FIM изображений и FIMtrack: Два новых инструментов, позволяющих с высокой пропускной способностью и анализ экономической эффективности опорно-двигательного

Большинство животных имеют возможность двигаться в очень сложной и контролируемым образом. Чтобы расшифровать генетическую основу базовый контроль локомоции является обязательным для количественной оценки различных форм поведения. В этом отношении, дрозофилы могут служить в качестве идеальной модели. Отслеживание свободно летающих дрозофилы раздражал ^1-4, но ползет дрозофилы личинок происходит в двух измерениях при относительно низкой скорости и, таким образом, можно легко контролировать. Установок камеры на основе в сочетании с соответствующим освещением используются для получения изображений ^5. Оба инцидента или проходящем свете используется в поведенческих экспериментах ^6,7. Тем не менее, из-за полупрозрачного тела личинок и возможных легких отражений обхода поверхности верного записи личинок движений может быть сложной задачей. Для преодоления таких проблем, некоторые сложные методы были разработаны. Недавно темного поля была введена для повышения переднего плана / фона продолжениеРаст ^8. В качестве альтернативы камеры на основе записи, линзы менее оптической томографии и изображения-датчика менее на чипе методы сбора были введены ^9-11.

Несколько отслеживания программы были введены недавно, в том числе коммерчески доступных программного обеспечения ¹² и нестандартных решений. Примеры программ слежения с высокой пропускной способностью являются Worm Tracker Multi (МБТ) ¹³ и Multianimal походка и дорожки (Магат) ^8. Оба имеют в общем, что несколько животных могут быть отслежены в одном арене в открытом поле, так что сталкивающиеся животные ведут к нескольким новых идентичностей животных. Чтобы преодолеть это ограничение, установка мульти-хорошо было введено разделение 12 животных в отдельных скважинах ^14. Точное количественное определение передвижения отдельных лиц может быть достигнуто с помощью подвижного этап отслеживания в сочетании с микроскопом ^15. Тем не менее, все эти подходы являются либо стоимость неэффективно, отсутствие достаточно повторноРаствор или слишком много времени для высокой пропускной способности фенотипирования.

Чтобы преодолеть вышеупомянутые ограничения, мы разработали FIM (ИК на основе изображений Метод) на основе нарушенного полного внутреннего отражения (НПВО) ¹⁶ (рисунок 1). Этот новый подход позволял обеспечивает беспрецедентно высокий контраст и даже позволяет многоцветной запись пресмыкающиеся ^16. Основной принцип этой удобной и эффективный метод очень легко. Акриловое стекло пластина залиты светом (например, 875 нм ИК). В связи с различными показателями преломления из акрилового стекла и воздуха, свет полностью отражается на стекло / воздух границы. Без отопления акрилового стекла не отмечено ^16. Только если объекты с более высоким показателем преломления коснуться, залитый светом стол, может осветить ввести эти объекты. Если животные прикасайтесь к поверхности, свет отражается и могут быть захвачены снизу (рис 1). В результате, только контактныеплощадь животных появляется как яркое пятно, которое позволяет детально визуализации с общей черном фоне. Таким образом, FIM-изображений позволяет записывать прекрасные фильмы для алгоритмов компьютерного зрения. Простой и надежной использование FIM теперь приводит подробный анализ высокую пропускную способность комплекса поведении животных в недоступном и может быть использован для изучения обработки информации: например, обоняния ^{8, 16;} Видение ¹⁷ или thermosensation ^18.

Рисунок 1. FIM установки с интеграцией тепла стимула и основных физических принципов. (А) FIM установки. Интенсивность освещения можно регулировать с передней панели. (B) для доставки тепла стимул, черного цвета алюминиевой пластины, перфузии с горячей и холодной водой с обеих сторон, находится на 2 мм выше поверхности агара, которыйСама толщиной 2 мм. Градиент устанавливается на теплоотвод пластины и агар разностью температур (C) физический принцип нарушенного полного внутреннего отражения:. Акриловое стекло пластина освещается инфракрасным светом. θ _1, θ ₂ и θ ₃ указывают световые углы отражения. н, п _1, п ₂ и п ₃ обозначают показатели преломления воздуха, акриловое стекло, агар и личинки, соответственно, и выполнить неравенство N _A <N ₁ <N ₂ <N _3. Из-за преломления, угол отражения изменяется в процессе перехода. Если угол меньше критического угла, свет не отражался больше может пройти через слои и могут быть захвачены снизу. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.

SPectrum процессов, которые могут быть проанализированы FIM широкая. Без каких-либо дальнейших корректировок FIM изображений может быть использован для мониторинга всех личиночной стадии дрозофилы (рис 5б) или могут быть использованы следовать отпечатков стопы для взрослых Drosophila ^19. Аналогичным образом, траектории С. Elegans или движение планарии плоских червей может быть легко записана (5С). Даже анализ грибковой гифы или корневой рост волос представляется целесообразным ^19. В нашем FIM установки, 4 х 16 ИК светоизлучающие диоды (ИК светодиоды) интегрированы в 32 х 32 см ² акриловой стеклянной пластины, называется таблица отслеживания (Рисунок 1). Интенсивность ИК-светодиодов регулируется в зависимости от веса объектов на таблицы отслеживания, которые можно легко сделать с помощью микроконтроллера, подключенного к цепи с помощью широтно-импульсной модуляции (PWM). FIM дает очень высокую контрастность изображения в широком диапазоне освещенностей. Важно отметить, что поколениявающий отличные результаты на уже низкой общей инфракрасного irridation.

Камера с инфракрасным фильтром находится ниже таблице слежения, которая позволяет интеграцию дополнительных стимулов в установке. Тепловые стимулы могут быть легко применены с помощью теплового радиатора пластины и световых сигналов применяются ЖК проекторе. Кроме отдушки могут содержаться в градиентах простыми крышками ^8. Для градиентных экспериментов тепла, тепловой радиатор пластина перфузии с горячей и холодной водой с обеих сторон, соответственно, и расположены над личинок (рис 1B) 2 мм.

Поколение высокой контрастностью, высококачественные фильмы открывает возможность для сложной компьютерной основе анализа изображений, таким образом, мы реализовали программу FIMTrack, чтобы извлечь большой набор функций, из изображений (Рис 2). Первые шесть основных функции были определены из контура животного (фиг.3А). Эти функции обеспечивают базовый уровеньДля дальнейшего расчета шесть вторичных функций, описывающих форму животных и его положение в определенных раздражителей в данный момент времени (рис 3b). В настоящее время девять третичные функции вычисляются, которые интеграции временных аспектов и, таким образом характеризуют передвижение животного вместе с первичными и вторичными функциями (фиг.3С).

Рисунок 2. Обзор FIMTrack, алгоритмическое документооборота и личинок представление. () Как использовать FIMTrack. Изображения загружаются. Серый пороговое значение и пороги личинок размер, определяющие единый личинок должен быть установлен. Личинок область должна быть в [мин-размера, макс-размер]. Отслеживание запускается кнопкой подсвечивается. (B) отслеживание процесса. После нажатия на кнопку пуска нажата, фоновое изображение окlculated (минимальные интенсивности во времени). Пока есть кадры остаются личинки на сегменты на основе серого порога и минимумов и порога макс размера. Для всех сегментации личиночные представления расчетных (по сравнению с (С)). Каждая новая модель связана с заданной траектории, если действительный дорожки доступен. При достижении последнего кадра, завершение постобработка, после которого следует выработки выходной. (C) личиночной представление. Животное состоит из головки и хвоста точки (ч и т д). Между этими точками произвольной нечетное число позвоночника точек с _я может быть установлен с радиусом R _I. Кроме того, центр массы т и основным корпусом угол изгиба γ вычислены. Несколько параметров движения, связанные с обрисованы фиолетовыми линиями. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.

ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь использование FIM представлена ​​для удобства анализа с высокой пропускной способностью личинок передвижения для скрининга в свободно движущейся условиях и под влиянием теплового раздражителя. Другие приложения, такие как анализ обонятельных стимулов зависит локомоции или изображения с высоким разрешением качения или других поведений может потребоваться незначительные изменения в протокол, которые предоставляются по запросу.

1. Set-до экспериментов

1. Используйте около 100 личинок на генотип в общем (время 1 час требуется), чтобы получить статистически значимые ценности. Примечание: В случае, если несколько генотипы должны быть сравнены и записаны в разные дни, записать одинаковое количество личинок на генотип в день.
2. Для большинства приложений, запись с частотой 10 Гц для анализа параметров. Для приложений, изображений высокого разрешения, изменения скорости визуализации, если это необходимо.
3. Для отслеживания третьего возраста личинок, проводить эксперименты около 120 ч после откладки яиц. Сделать сюре, что культуры дают достаточно личинок в экспериментальной периода (см 4.3).
4. Для не-стимулирующих приложений, подготовить ползет поверхность, содержащую полупрозрачный агар (см раздел 2). Для содержать личинки в диапазоне стимулом для тепловой градиент применения, окружают поля зрения с аверсивного соль агар барьера (раздел 3).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Другие приложения могут потребовать различных поверхностей.
5. Убедитесь, что используется номер с постоянных условиях окружающей среды (температура, свет, поток воздуха, влажность воздуха и т.д.).

2. Сканирование Подготовка поверхности (прозрачный агар)

Примечание: В FIM установки поверхность агара добавляют, чтобы обеспечить влажную поверхность сканирования. Кроме того, это также улучшает свойства освещения.

1. Варить 0,8% агара пищевого в деионизированной воды высшей степени очистки. Для скрининга применения подготовить 400 мл.
2. Налейте агаре при 50 ° C (ручной горячей) на отдельной 33 см х 33 см ACrylic-стеклянная пластина. Поверхностное натяжение агара и, таким образом, температура будет определить толщину плиты агара. При 50 ° С, толщиной 2 мм агар плиты получены. Не агитировать после кипячения и залить постоянно, чтобы избежать пузырей. Подготовка свежие агар плит для каждого периода формирования изображения около 4 часов.
3. Заполните стандартные 6 см чашки Петри с оставшейся 0,8% раствора агара для сортировки, чистый и приучить личинок до эксперимента (1 блюдо на генотип).
4. В случае, если отвращение агар барьер необходим для приложения, перейдите к разделу 3.
5. Обрежьте примерно 2 см по периметру плиты агара, чтобы получить плоскую квадратную поверхность для записи. Удалить излишки агара.
   ПРИМЕЧАНИЕ: размер зависит от приложения.
6. Передача агар плиты в FIM установки непосредственно после охлаждения осторожно подтолкнув скольжения агар через край акриловой стеклянной пластиной.

3. Необязательно: Добавление отвращение агар препятствием для зобулин поверхности (Солт-агар)

1. Варить 2,5% агара пищевого 3 М NaCl в деионизованной воды высшей степени очистки. Для скрининга в тепловой градиент подготовить 200 мл.
   ПРИМЕЧАНИЕ: объем зависит от приложения.
2. Вырезать шириной 2 см вырез в ранее налил ползет поверхность вокруг поля зрения (22 х 22 см).
   Примечание: Различные формы барьера и поля зрения может потребоваться в зависимости от применения.
3. Заполните выемку с солью агар 0,1-0,3 см выше, чем на поверхности слежения.

4. Fly Обращение

1. Задняя летит в 25 ° C инкубаторе с 12 ч циклом свет / темнота доводят до времени эксперимента о стандартной пищи лету при влажности 65% воздуха.
2. Для крестов, обезболить 30 девственница мух и 8 мужчин с СО ₂ и пересечь их в 130 мл культуры флаконах 35 мл пищи.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Один 130 мл культуры флакон с 35 мл пищи даст около 20-30 лели третьей возрастной стадии личинок в пределах промежутка формирования изображения 4 ч. Визуализации и отслеживания работы для всех личиночной стадии возрастной стадии.
3. Оставьте немного воды в культуре флаконах ездить поздно третьего возраста личинок движение и собирать большой личинок из флакона стенах с помощью небольшой кисти.
4. 2-5 мин до начала записи, передачи личинки в течение одного изображения на чашки Петри, содержащую 0,8% агара пищевого в деионизированной ультра чистой воды приучить и очистить их.

5. Настройка Настройка FIM визуализации для записей (не Стимул Условия)

1. Отрегулируйте камеры фокус объектива и диафрагмы, если это необходимо. Установите время экспозиции для соответствующей камеры.
   Примечание: Эти параметры не должны быть изменены в ходе эксперимента.
2. Отрегулируйте интенсивность освещения, чтобы получить хороший контраст по визуализации одну личинку.
3. Держите условия окружающей среды в комнате с постоянной во время записи. Затемнить комнату, чтобы не мешать личинок с направленного света,

6. Необязательно: Настройка Настройка FIM визуализации для записей (постепенное температуры по стимулированию условия)

ПРИМЕЧАНИЕ: тепловой градиент устройство 42 х 42 х 0,2 см ³ алюминиевая пластина с матовой черной краской и изолирующего материала на верхней площадке. Пластина перфузии с водой из двух различных цепей, подключенных к калориферы / охладителей и насосов на обоих концах (рис 1б). Температуры можно регулировать в пределах от -5 до +50 ° C.

1. Включите тепловой градиент устройство 1 ч до экспериментов и поместить его выше установки, чтобы установить желаемый температурный профиль и компоненты, чтобы уравновесить.
2. Передача ползет поверхности агара с соленой барьером для установки.
3. Поместите пластину радиатора по сравнению с агаром, и регулировать расстояние между пластиной и Обход поверхности до 2 мм (~ 1 мм выше личинок).
4. Создание линейного градиентапо крайней мере, 0,8 ° C / см от 34 ° C (ок. 2 см от барьера в поле зрения) до 18 ° C (ок. 2 см от барьера на противоположном участке в поле зрения), регулируя Температура воды цепей в 1 ° C и 45 ° C.
   ПРИМЕЧАНИЕ: различный градиент свойств металлической пластины требуют различных температур, которые должны быть установлены эмпирически. Эти параметры не должны быть изменены в ходе экспериментов.
5. Настройка параметров, как описано в разделе 5.
6. Дайте обхода поверхность для уравновешивания в градиенте до экспериментов в течение 20 мин. Проверьте температурный градиент с пирометром.
7. Перейдите к разделу 8.

7. FIM изображений (Не Стимул условиях)

1. Используйте маленькую влажную кисть, чтобы мягко собрать 15 личинок от привыкания чашках Петри и передавать их в центр поверхности слежения. Не переносите остатки пищи или слишком многоводы (см 7.8).
2. Запись 1 - 50 личинок на 22 см х 22 см зону слежения. Используйте 15 животных на видео для большинства отбора заявок (по статистическим причинам использовать по крайней мере 100 особей на генотип).
3. Аккуратно отделить личинок и ждать около 10-20 сек, пока все личинки начали двигаться прямо перед записью.
4. Запишите личинок передвижение в течение 2 мин при 10 кадрах в секунду для некурящих условиях стимула. Используйте несжатых TIF изображения в качестве выходного формата.
5. Во время записи, собирать личинки для следующего видео из флаконов приучают их Критическое. Не беспокоить записанный личинок света.
6. После записи, снимите личинки с большим кисти и выбросить их в соответствии с местными правилами техники безопасности и законодательства.
7. После удаления личинок, используйте кисть, чтобы очистить и увлажнить Обход поверхность с ультра чистой деминерализованной воды.
8. Крит: Держите поверхность влажной во все времена, но избежать чрезмерного моisture, которые можно рассматривать как ореолы или капель окружающие личинок в записи и нарушить слежения.

8. Необязательно: FIM изображений (постепенное Температура Стимул условия)

1. После градиент температуры устанавливается (см раздел 6), подготовить программное обеспечение для записи для немедленной записи 20 сек после размещения личинок на поверхности переползания (см 8.2) например, установить количество кадров в видео и определить путь для сохранения.
2. Приподнимите радиатор тарелку и поместите личинки на 33 ° C 2 см от соли барьера. Обратитесь к 6 и 7 для дальнейших общих указаний. Снова опустите радиатор пластину и начать запись в течение 3-4 мин непосредственно после личинки начали двигаться прямо.
3. После записи, снимите личинки непосредственно, чистый и увлажняют поверхность. Не прикасайтесь к соли агар, чтобы избежать распространения NaCl.
4. Крит: Держите поверхность влажной во все времена, но избежатьизлишняя влага, которая может рассматриваться как ореолы или капель окружающие личинок в записи и нарушить слежения.
5. Разрешить поверхность агара, чтобы уравновесить снова после увлажнения в течение 1-2 мин, в то время как сохранение изображений и сбора новых животных, чтобы подготовить следующего видео. Управление температурный градиент, используя пирометр каждые 5 видео и регулировать температуру устройства, если это необходимо (температура воды, высоту и ху ориентацию по отношению к поверхности слежения).

9. Отслеживание личинок локомоции

ПРИМЕЧАНИЕ: Для более подробной информации обратитесь к прилагаемой инструкции для FIMTrack (Дополнение). Для потока программы графике рис 2.

1. Отрегулируйте параметры отслеживания для соответствующих экспериментов с использованием опции предварительного просмотра.
   1. Регулировка пиксель за см соответствии с камерой и поле зрения.
   2. Отрегулируйте кадров в секунду на основе настроек камеры.
   3. Отрегулируйте яркость пороги около того йна всех животных обнаружены правильно (обратной дано в предварительном просмотре).
   4. Отрегулируйте личинок пороги размер области. Обратите внимание на опцию обратной связи в окне предварительного просмотра: одиночки будут выделены желтым цветом, сталкиваясь личинки выделяются красным цветом и площадь каждого животного дается в синий цвет.
2. Начать отслеживание с помощью кнопки в правом нижнем углу.
   ПРИМЕЧАНИЕ: После успешного слежения, изображение показывая личинок дорожки и файл CSV, содержащий рассчитанные движения и позы функции хранится в каталоге изображений.
3. Используйте FIM Результаты модуль просмотра (Edit> Результаты просмотра ...) для рассмотрения и вручную настроить отслеживания результатов. При необходимости определить стимулирования регионов, чтобы оценивать данные в отношении стимул режима, например, ползает ориентацию по отношению к тепловой градиент или расстояния до источника одоранта. Для более подробного описания, пожалуйста, используйте ручную (Дополнение).

10. Оценка данных

1. Импорт файла CSV в Excel, Matlab или любую другую программу для дальнейшего статистического анализа.

Для визуализации несколько различных камер с различными свойствами разрешением были протестированы (Рисунок 4). Все камеры, где, оснащенные соответствующим ИК-фильтром. В соответствии с низким разрешением с самой низкой ценой камеры в этом тесте, поле зрения не превышает 10 см х 10 см. Наилучшие результаты были получены с использованием 4-мегапиксельная (МП) камеры. Это приводит к разрешением 100 пикселей на третьей стадии личинки длиной и позволил легко распознавать внутренние структуры. Кроме того, перистальтика животного может быть легко извлечены (фиг.4А). Тем не менее, все еще можно получить высокую контрастность фильмы с помощью менее дорогих камер, которые также могут быть проанализированы FIMTrack. Использование мегапиксельная камера 1,4 с глубиной 8 бит и разрешением 1392 х 1040 пикселей составляет примерно половину цены и позволяет разрешение 45 пикселей на третьей стадии личинки длиной в поле зрения. Головой, но никакие другие внутренние структуры не могут быть признаны (4В). Отслеживание и обнаружение перистальтики возможно, но точность уменьшается (фиг.4В).

С еще дешевле 0,8-мегапиксельной камерой с пространственным разрешением, сравнимым с мегапиксельной камерой 1.4, личинок голова не может быть признано точно больше (рис 4C). Отслеживание и анализ перистальтика возможно, но в том числе более дрожание на основе повышения уровня шума. Удивительно, но даже с низким веб-камера разрешением USB обеспечивает достаточное качество фильмов для расчета личинок траектории (0,3-мегапиксельная камера, ниже 20 €, рис 4D). Перистальтики может быть рассчитана из области, но измерения очень шумным.

В нашей установке мы обычно используем мегапиксельная камера 4. Для скрининга, эта камера позволяет осуществлять мониторинг в 22 см х 22 см арену, которая, очевидно, даёт возможность анализировать большое количество животных одновременно, так что анализ с высокой пропускной способностью является возможным. Используя эту настройку, личинок длиной яы представлен 40 пикселей, которые по-прежнему позволяет запись и анализ перистальтики. Примерный образ 15 личинок траекторий в тепловой градиент приведен на фиг.5А. Кроме того, использование макро-объектив позволяет личинок изображения с очень высоким разрешением, где множество внутренних органов становятся видимыми и признание головка дополнительно улучшена (фиг.5В). Кроме того, они могут использоваться для дальнейшего более детального анализа поведения в широком диапазоне 20. Та же установка может быть легко использована для ползания изображение C. Элеганс червей (5С).

Рисунок 4. FIM изображений и слежения результаты для различных камер. () Слева: FIM изображений из трех личинок ползет по 10 см х 10 см этапе отслеживания получены с помощью мегапиксельная камера 4 с 10 кадров в секунду. Средний:Вырезка и центр масс траектории одной личинки. Площадь животного указано. Справа: Площадь личинки построены более 100 кадров. Красная стрелка указывает момент времени в дефект изображения. (B) Эквивалент (а), но получены с помощью Мп камерой 1.4. (C) Эквивалент (а), но получены с помощью мегапиксельная камера 0,8. (D) Эквивалент ( ), но, получены с помощью мегапиксельная камера 0,3. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 5. Тепло стимулирования, и высокое разрешение приложения. () Тепловая стимул приложений (по сравнению с рис 1). Траектории рассчитываются с помощью FIMTrack. (B) заявление Высокое разрешение изображения третьего, второго и первого взрослой личинки с помощью макро-объектив. Третий возрастной стадии личинок длиной представлен 400 пикселей в поле зрения 2,5 х 2,5 см. (С) С. Элеганс червь получены с помощью FIM изображений. Масштабные линейки указаны. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.

Авторы не имеют ничего раскрывать