Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Всего монтажа Визуализация эмбриона мыши Сенсорная Axon прогнозам

9.7K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/52212

⸱

9 декабря 2014 г.

 ,  , 
1Brain and Mind Research Institute, Burke Medical Research Institute, Weill Medical College of Cornell University

В этой статье

Краткое содержание

Мы представляем здесь оптимизированный протокол для генотипирования, окрашивания и подготовки эмбриональных мышей для визуализации проекций периферических ноцицепторных аксонов у всего животного, как эффективный метод оценки фенотипов роста сенсорных аксонов у развивающихся генетически модифицированных мышей.

Аннотация

Визуализация нейронных проекций полнометражных эмбрионов необходимо получить представление о том, как у млекопитающих развивать нейронных сетей. Здесь мы опишем метод маркировать на месте подмножество спинной ганглий корень (DRG) аксонов прогнозов для оценки их фенотипические характеристики, используя несколько генетически модифицированных линий мышей. В TrkA-положительных нейронов нейроны ноцицептора, предназначенные для передачи сигналов боли. Мы используем мыши линии TrkA taulacZ для обозначения траектории всех TrkA-положительных периферийных аксонов в неповрежденной эмбриона мыши. Мы дополнительно разводить TrkA taulacZ линию на Bax нулевой фон, который, по существу отменяет апоптоза нейронов, с целью оценки роста, связанных с вопросы независимо от возможных последствий генетических манипуляций на выживание нейронов. Впоследствии, генетически модифицированные мыши, представляющие интерес, разводят с TrkA ЦаулACZ / Bax нулевая линия и готовы для исследования с использованием методов, описанных в данном документе. Данная презентация содержит подробную информацию о планах мыши размножения, генотипирование на момент вскрытия, подготовки ткани, окрашивание и очистки, чтобы для визуализации полнометражных аксонов траекторий в целом монтажа подготовки.

Введение

Установление точного нейронных сетей представляет собой сложный процесс развития необходимы для функциональности нервной системы. Нарушение этого процесса приводит к нейронной дисфункции, который был вовлечен в неврологических заболеваний человека 1-3. Для изучения основополагающих молекулярных механизмов роста аксонов и целевой иннервации у млекопитающих, мы разработали протокол для визуализации аксонов траектории TrkA-выражения сенсорных нейронов, используя комбинацию из двух генетически модифицированных линий мышей.

TrkA является рецептором для фактора роста нервов NGF и функциональный маркер ноцицептивных сенсорных нейронов 4. TrkA высоко экспрессируется в ноцицептивных нейронов во время раннего развития и посредником NGF-зависимое выживание нейронов, роста аксонов, разветвление и целевой иннервации 5-9. У мышей TrkA taulacZ, дикого типа гена TrkA заменен экспрессии taulacZ сassette 10, таким образом, что аксонов морфологии предполагаемых TrkA-позитивных нейронов могут быть визуализированы с помощью β-гал (X-GAL) окрашивания 11. Использование гетерозиготную линию TrkA taulacZ / WT, мы можем рассмотреть факторы, которые могут регулировать или помешать с развитием сенсорных афферентных проекций в естественных условиях.

Кроме того, выражение TrkA отсутствует у гомозиготных мышей TrkA taulacZ / taulacZ, которые, следовательно, могут быть использованы для оценки роста аксонов способствуя механизмов в отсутствие ФРН сигнализации / TrkA. С ноцицептивных нейронов зависит от NGF / TrkA сигнализации не только для роста аксонов, но и для выживания, мы используем другую линию мыши, не имея проапоптотического ген Bax, ингибируют апоптоз в эмбриональных нейронов DRG, спасая их от гибели клеток, что в противном случае наблюдается при отсутствии сигналов TrkA. Вах - / - фон 12 Таким образом, позволяет molecuLAR рассечение пути, непосредственно затрагивающих аксонов 7-9,13-15 роста сигнализации. В TrkA - / -: Вах - / - мышей, DRG нейроны выжить, но сенсорная афферентная иннервация в коже полностью отменена 14,15. Мы можем избирательно активировать сигнальные пути, чтобы определить их соответствующие взносы в развитие аксонов прогнозов. Полезность этого метода является то, что он позволяет оценить изменения в аксонов фенотипов роста, когда различные генетические модификации разводят на TrkA taulacZ / taulacZ: Вах - / - или TrkA taulacZ / WT: Вах - / - фоны.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: Все процедуры соответствовали требованиям Руководства NIH для использования и ухода за лабораторными животными. Протокол животное было одобрено IACUC в Weill Cornell Medical College.

1. Подготовка ткани

  1. Эвтаназии приурочен беременности самок смещения шейных позвонков 15. Рассеките эмбриональных E16 - E18 эмбрионов из тайм-беременности самок и место эмбрионов индивидуально в лунки блюдо 6-луночный, заполненных холодной фосфатным буферным солевым раствором (PBS).
  2. Промойте эмбрионы в холодной PBS.
  3. Удалить небольшую часть амниотической мембраны эмбриона и поместить в предварительно подготовленный протеиназы К раствору для последующего генотипирования. С другой стороны, если амниотической мембраны теряется, удалить небольшую часть от кончика хвоста эмбрионов и поместить его в раствор протеиназы К
  4. Совать отверстия в коже по всему эмбриона с использованием насекомых булавками (по крайней мере 100 с каждой стороны).
  5. Удалить PBS и медленно добавить свежий 2% параформальдегида (PFA),рН 7,4, к колодцу.
  6. Осторожно встряхивают в течение 2 ч при 4 ° С.
  7. Промыть эмбрионы дважды в PBS и хранить не в PBS при 4 ° С до окрашивания.

2. Генотипирование

  1. Погрузитесь амниотической мембраны или эмбриона хвосты протеиназы К смеси в соответствии с инструкциями изготовителя.
  2. Выдержите при 56 ° С в течение 10 мин.
  3. Экстракт ДНК с использованием коммерчески доступного набора для очистки ДНК.
  4. Взять 0,5 мкл общего объема 200 мкл очищенных геномной ДНК-раствор, объединить его с 0,5 мкл каждого из генов конкретного смыслового и антисмыслового праймеров (10 мкМ), 2 мкл дНТФ Mix (2,5 мМ дАТФ, дЦТФ, дГТФ и дТТФ) , 0,2 мкл Taq полимеразы (5 ед / мкл) и 2 мкл ПЦР буфера (10x), добавляют H 2 O до полного объема 20 мкл.
    Примечание: Последовательности праймеров следующие (таблица 1):
    TrkA: TrkA_F: GCG GGC GCC GCC GCG ATG, TrkA_R: GAA GCC GCC ТГК GCG GCT CTG CCA GGG TG; ПЦР осколочнаяДлина ния: 400 пар оснований (п.о.).
    Вах: In5R: GTT GAC CAG AGT GGC GTA Г.Г., Ex5F: TGA TCA GAA CCA TCA Т.Г., NeoR: CCG СТТ ССА ТТГ CTC AGC GG; Длина ПЦР-фрагмента: дикого типа, 304 BP; Вах NULL, 507 б.п..
    TauLacZ: lacZup: ACA ACG TCG TGA GTG GGA AAA, lacZdown: ATC AAC ATT AAA TGT GAG CGA G; ПЦР длины фрагмента: 360 пар.
  5. Запуск ПЦР со следующей программой для TrkA: Шаг 1: 1 мин при 95 ° C, шаг 2: 10 сек при 95 ° C, шаг 3: 20 сек при 68 ° C, шаг 4: 30 сек при 72 ° C. Повторите шаги 2 - 4 для 40 циклов.
    1. Для LacZ и Bax, запустить ПЦР со следующей программой: шаг 1: 1 мин при 95 ° С, шаг 2: 10 с при 95 ° С, шаг 3: 1 мин при 54 ° С, Шаг 4: 1 мин при 72 ° C, повторите шаги 2 - 4 для 35 циклов.
  6. Образцы Выполнить ПЦР на 2% агарозном геле при 100 В в 1x Трис-ацетат-ЭДТА буфере в течение 20 мин с полосу ДНК лестницы, чтобы оценить фрагментов длины.
  7. Анализ эмбрионов на наличие дикого типа TrkA, TРКА-tauLacZ и Bax нулевые аллели. Генотипы экспериментальных эмбрионов TrkA taulacZ / вес: Вах - / - и TrkA taulacZ / taulacZ: Вах - / -, в зависимости от экспериментальных вопросов. Эмбрионы, лишенные репортеру tauLacZ будет отрицательным для окрашивания аксонов и, следовательно, может служить в качестве отрицательного контроля для калибровки процесса окрашивания.

3. эмбрионов Окрашивание

  1. Использование коммерческого набора для окрашивания LacZ с некоторыми модификациями, как описано ниже в разделах 3.2 - 3.8. Вот, используйте комплект Millipore.
  2. Погрузитесь эмбрионов в буфере А, по крайней мере, 1 ч, встряхивая осторожно при комнатной температуре.
  3. Непосредственно погрузиться эмбрионов в буфере B, по крайней мере, 15 минут, встряхивая осторожно при комнатной температуре.
  4. В то время как эмбрионы в буфере A / B, предварительно теплой ткани основного раствора при 37 ° С. Используйте 5 мл ткани базы раствора на эмбрион.
  5. В то время как эмбрионы в буфере A / B, подготовки свежего 5-Bromo- 4- хлор-3-индолил α-D-галактопиранозид (X-Gal) в концентрации 40 мг / мл в 100% диметилсульфоксиде (ДМСО).
  6. Развести X-гал в подогретого ткани исходного раствора с концентрацией 1 мг / мл и добавляют 5 мл X-Gal / ткани базовой смеси в стекл нный сцинтилл ционный флакон.
  7. Трансфер эмбрионов в стеклянный сцинтилляционный флакон, содержащий X-гал / ткани основной смеси. Уплотнение крышки парафильмом и инкубировать при 37 ° С в течение ночи, проверка на наличие синего красителя.
  8. Эмбрионы Postfix со свежими 4% PFA, рН 7,4. Осторожно встряхивают в течение 4 ч при 4 ° С.
  9. Промыть эмбрионы дважды в холодной PBS.

4. Ткань Обезвоживание и посредничества

  1. Место эмбрионов в 50% метанол / 50% PBS смеси в течение 30 мин при комнатной температуре, встряхивания в стеклянных флаконах.
  2. Продолжать обезвоживают в 75% метаноле / 25% PBS в течение 30 мин при комнатной температуре, встряхивая в стеклянных флаконах.
  3. Продолжить для обезвоживания в 90% метанола / 10% РБС в течение 30 мин при комнатной температуре, встряхивая в стеклянных флаконах.
  4. Продолжать обезвоживают в 100% метаноле в течение 30 мин (2х) при комнатной температуре, встряхивая в стеклянных флаконах.
  5. В то время как эмбрионы дегидратации, подготовить 1: 1 (по объему) смеси спирта и бензоил бензоат бензоила.
    ПРИМЕЧАНИЕ: бензоила алкоголя и бензоил бензоат является токсичным.
  6. Погрузить эмбрионов в 1: 1 (по объему) смесь из 100% метанола: 100% Babb в течение 15 мин. Использовать стекло только потому, что Бабб будет растворяет пластик.
  7. Погрузитесь эмбрионов в 100% Бабб полностью очистить ткань и визуализировать окрашивание X-гал в очищенном эмбриона.
    Примечание: изображение как можно быстрее, так как X-Gal пятна будет исчезать в течение долгого времени.

5. Всего горе изображений

  1. Стабилизация эмбрион, погруженный в 100% Бабб на соответствующих углов для фотографии с помощью металлических щипцов. Освещать используя комбинацию UP-света и под-света Источники света.
  2. Получение изображений с рассекает микроскопомоснащен цифровой камерой. Возьмите несколько экспозиций светлом поле в пяти последовательных фокальных плоскостях 0,5 мм друг от друга вдоль оси Z. Время экспозиции и диафрагмы может меняться в зависимости от освещения и камеры спецификации и должны быть оптимизированы для каждой установки.
  3. Используйте стандартное программное обеспечение для обработки изображений процесс нанесения изображения и создавать фотомонтажи.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Генотипы TrkA WT / taulacZ: Вах - / - и TrkA taulacZ / taulacZ: Вах - / - эмбрионы могут быть однозначно определено с помощью стандартных ПЦР генотипирование (Рисунок 1). X-Gal окрашивание отображает подробную периферийных аксонов беседки подкожно, обычно окрашенных эмбрионов (фиг 2, 3, а), и в течение эмбриона после очистки ткани (фиг 3б, 4).

Мы разводили в TrkA WT / taulacZ: Вах -...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Описанный выше X-гал процедура окрашивания эмбриональных мышей TrkA taulacZ позволяет быстро и детальной визуализации на большие расстояния аксонов прогнозов в интактном фиксированной эмбриона. Из-за Вах нулевой фоне этих мышей позволит для зондирования механизмы, которые могут способствовать как росту аксонов и выживание нейронов сигнализации. Спаривание с трансгенными или мышей с нокаутом интересов позволяет комплексной оценки аксонов фенотипов и может служить полезным руководством для буд...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих интересов.

Благодарности

Авторы хотели бы поблагодарить доктора Луи Рейхардт для мышей TrkA taulacZ и д-р Аннет Markus для проницательного обсуждения и предложений. Эта работа была поддержана запуска средства из Берк Фонда, а также Уайтхолл исследовательского фонда грант 2010-08-61, исследовательский грант от Крылья для жизни фонда (WFL-US-028/14), грант ZB1-1102-1 от Кристофер и Дана Рив Фонд и гранты 1R01EY022409 и 3R01EY022409-01S1 из Национального института глаза, к JZ. KJo является членом Голдсмит.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
PFASigma-AldrichP6418
PBSLife Tech10010-023
Раствор для полоскания тканей AMilliporeBG-6-B
Раствор для полоскания тканей BMilliporeBG-7-B
Раствор для окрашивания тканейMilliporeBG-8-C
X-galSigma-AldrichB4252
Стеклянный флакон для сцинтилляцииKimble Chase74500-20
ИнкубаторLablineМодель 120
Булавки от насекомыхFST26000-30
DMSOSigma-AldrichD8418
6-луночная тарелкаСША ScientificCC7672-7506
ПраймерыIDTпользовательские праймеры
Takara dNTP смесьTakara4030
Takara LA буферTakaraRR002A
Takara LA TaqTakaraRR002A
PCR машинаBio-RadDNA Engine Dyad
Бензиловый спиртSigma-AldrichB-1042
БензилбензоатSigma-AldrichB-6630
Препарирующий микроскопLeicaM205A
ФотоаппаратLeicaDFC310FX
Кольцевой светLeica MEB110
PhotoshopAdobePhotoshop 4.0
ДНК

Ссылки

  1. Verze, L., et al. Cutaneous innervation in hereditary sensory and autonomic neuropathy type IV. Neurology. 55, 126-128 (2000).
  2. Sethna, N. F., Meier, P. M., Zurakowski, D., Berde, C. B. Cutaneous sensory abnormalities in children and adolescents with complex regional pain syndromes. Pain. 131, 153-161 (2007).
  3. Uceyler, N., et al. Small fibers in Fabry disease: baseline and follow-up data under enzyme replacement therapy. J Peripher Nerv Syst. 16, 304-314 (2011).
  4. Reichardt, L. F., Mobley, W. C. Going the distance, or not, with neurotrophin signals. Cell. 118, 141-143 (2004).
  5. White, F. A., et al. Synchronous onset of NGF and TrkA survival dependence in developing dorsal root ganglia. J Neurosci. 16, 4662-4672 (1996).
  6. Farinas, I., Wilkinson, G. A., Backus, C., Reichardt, L. F., Patapoutian, A. Characterization of neurotrophin and Trk receptor functions in developing sensory ganglia: direct NT-3 activation of TrkB neurons in vivo. Neuron. 21, 325-334 (1998).
  7. Markus, A., Zhong, J., Snider, W. D. Raf and akt mediate distinct aspects of sensory axon growth. Neuron. 35, 65-76 (2002).
  8. Kuruvilla, R., et al. A neurotrophin signaling cascade coordinates sympathetic neuron development through differential control of TrkA trafficking and retrograde signaling. Cell. 118, 243-255 (2004).
  9. Zhong, J., et al. Raf kinase signaling functions in sensory neuron differentiation and axon growth in vivo. Nature. 10, 598-607 (2007).
  10. Bulfone, A., et al. An olfactory sensory map develops in the absence of normal projection neurons or GABAergic interneurons. Neuron. 21, 1273-1282 (1998).
  11. Moqrich, A., et al. Expressing TrkC from the TrkA locus causes a subset of dorsal root ganglia neurons to switch fate. Nature. 7, 812-818 (2004).
  12. Knudson, C. M., Tung, K. S., Tourtellotte, W. G., Brown, G. A., Korsmeyer, S. J. Bax-deficient mice with lymphoid hyperplasia and male germ cell death. Science. 270 (5233), 96-99 (1995).
  13. Lentz, S. I., Knudson, C. M., Korsmeyer, S. J., Snider, W. D. Neurotrophins support the development of diverse sensory axon morphologies. J. Neurosci. 19, 1038-1048 (1999).
  14. Patel, T. D., Jackman, A., Rice, F. L., Kucera, J., Snider, W. D. Development of sensory neurons in the absence of NGF/TrkA signaling in vivo. Neuron. 25, 345-357 (2000).
  15. Donovan, K. J., et al. B-RAF kinase drives developmental axon growth and promotes axon regeneration in the injured mature CNS. The Journal of experimental medicine. 211, 801-814 (2014).
  16. Mercer, K., et al. Expression of endogenous oncogenic V600EB-raf induces proliferation and developmental defects in mice and transformation of primary fibroblasts. Cancer research. 65, 11493-11500 (2005).
  17. Tronche, F., et al. Disruption of the glucocorticoid receptor gene in the nervous system results in reduced anxiety. Nature genetics. 23, 99-103 (1999).
  18. Madisen, L., et al. A toolbox of Cre-dependent optogenetic transgenic mice for light-induced activation and silencing. Nat Neurosci. 15, 793-802 (2012).
  19. Feng, G., et al. Imaging Neuronal Subsets in Transgenic Mice Expressing Multiple Spectral Variants of GFP. Neuron. 28, 41-51 (2000).
  20. Schmidt, H., Rathjen, F. G. DiI-labeling of DRG neurons to study axonal branching in a whole mount preparation of mouse embryonic spinal cord. J Vis Exp. , (2011).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

TrkA-положительные нейроныTau LacZ-репортерBax-нулевой фонпросветление тканейраствор BABBокрашивание ALSпротокол генотипирования
Всего монтажа Визуализация эмбриона мыши Сенсорная Axon прогнозам
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.