Разработка В пробирке Модельной системой для изучения взаимодействия Equus Caballus IgE с рецептором с высоким сродством FcεRI

Summary

В настоящем исследовании описывается разработка и применение системы генетически модифицированного анализа, основанной на трансфекции клеток базофильного лейкоза крыс с помощью лошадиного гена FcεRIα. Трансфицированные клетки экспрессируют функциональный рецептор, в котором высвобождение медиаторов аллергической реакции может быть активировано IgE и антигеном.

Abstract

Взаимодействие IgE с его высокоаффинным Fc-рецептором (FcεRI) с последующей антигенной провокацией является основным путем в IgE-опосредованных аллергических реакциях. Как следствие высокого аффинного связывания между IgE и FcεRI, наряду с непрерывной продукцией IgE В-клетками, аллергия обычно сохраняется на протяжении всей жизни, и в настоящее время не существует постоянного лечения. Лошади, особенно скаковые, которые обычно являются инбредными, являются видом млекопитающих, которые очень склонны к развитию реакций гиперчувствительности, что может серьезно повлиять на их работоспособность. Физиологические реакции на аллергическую сенсибилизацию у лошадей зеркально отражают наблюдаемые у человека и собаки. В данной работе мы описываем разработку системы анализа in situ для количественной оценки высвобождения медиаторов аллергической реакции, относящейся к системе лошадей. С этой целью ген, кодирующий лошадиный FcεRIα, был трансфицирован и экспрессирован на поверхности родительских клеток крысиного базофильного лейкоза (RBL-2H3.1). Продукт гена трансфицированной лошадиной α-цепи образовывал функциональный рецепторный комплекс с эндогенными β- и γ-цепями крысы ¹. Полученная система анализа способствовала оценке количества медиатора, секретируемого из трансфицированных FcεRIα клеток RBL-2H3.1 лошадиного типа FcεRIα после сенсибилизации лошадиным IgE и антигенной провокации с использованием β-гексозаминидазы в качестве показателя ^{2, 3}. Высвобождение медиатора достигло пика на уровне 36,68% ± 4,88% при концентрации 100 нг ^мл-1 антигена. Этот анализ был модифицирован по сравнению с предыдущими анализами, использованными для изучения аллергических реакций человека и собак ^{4, 5}. Мы также показали, что этот тип системы анализа имеет множество применений для разработки диагностических инструментов и оценки безопасности потенциальных стратегий терапевтического вмешательства при аллергических ^{заболеваниях 6, 2, 3}.

Introduction

Аллергия, как известно, на протяжении тысячелетий. Лечение астмы был описан в древнеегипетской медицинского текста, известного как папирусе Эберса (~ 1550 г. до н.э.) и обсудили трав для лечения его ^7.

Сегодня аллергии классифицируется как ответ гиперчувствительности типа I, где Т хелперов типа 2 (TH ₂₎ рычаг иммунной системы бычков производство иммуноглобулина Е (IgE) антител в ответ на антигены окружающей среды, называемых аллергенами. Эти различные вещества, которые обычно взаимодействуют с клетками иммунной системы и стимулируют синтез и секрецию провоспалительных цитокинов, в том числе интерлейкина-4 и интерлейк....

Protocol

1) Получение клеточной линии:

1. Разработка RBL-2H3.1 клеточную линию, выражающую лошадей FcεRI α:
   1. Использование основных методов культуры ткани для линий монослоя клеток, трансфекции родительских RBL-2H3.1 клеток с использованием плазмиды рЕЕ6, неся лошадиный ген FcεRIα (GenBank: Y18204.1) ^28. Добавить мкл 2 мкг ^-1 плазмидной ДНК в 0,8 мл клеток при плотности 1,2 x10 ⁷ клеток мл ^-1. Электропорации клетки при 250 В 960 мкФ с использованием 0,4 см electrocuvette затем сразу инкубировать на льду в течение 10 мин.
   2. Выберите трансформированных клеток с использованием средств массовой информаци....

Results

Родительские RBL-2H3.1 клетки и те, трансфицируют с лошадиного гена рецептора FcεRIα были впервые сенсибилизированные мыши с IgE анти DNP-HSA и вызов с антигена DNP-HSA. Мышь IgE связывается с эндогенным рецептором крыс в обеих клеточных линий и, таким образом, действует в качестве контроля для проверки выпуска жизнеспособность обеих клеточных линий, чтобы освободить медиаторов (фиг.1). Это важный проверка и должна проводиться регулярно, так как на расширенной (> 10 недель) прохода в культуре клеток,.......

Discussion

В целом результаты этого исследования показали, что, когда RBL-2H3.1 клетки, экспрессирующие лошадей FcεRIα были осведомлены с лошади IgE и оспорены антигена, они дают пик высвобождения медиаторов из 36,68% ± 4,88% от общего количества медиатора внутри клетки, по сравнению с RBL-2H3.1 родительские клетки не выражающие лошадей FcεRIα.

Таким образом, этот анализ является полезным инструментом для исследования и изучения лошадей аллергические реакции в пробирке. Его позволяет определят.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
RBL-2H3.1 экспрессирующий Fc&epsilon у лошадей; RIα	-	-	Произведено в лаборатории
Equine IgE anti NIP-HSA		-	-Произведено в лаборатории
96 лунок	Пластина Sigma	CLS3595-многоканальная
пипетка	Anachem	-	-
Инкубатор	Galaxy R	-
-4Гидрокси-5-йодо-3-нитрофенилуксусная кислота	Cambridge Research Biochemicals	N-1070-1	NIP-OH конъюгировали с сывороточным альбумином человека для получения NIP-HSA в лаборатории
Динитрофенил, конъюгированный с сывороточным альбумином	человека Sigma	A6661	Сокращенно DNP-HSA Планшетный
спектрофотометр	Anthos Labtec HT2	-
-трубки	Sigma	P1851-Sodium
Chloride	Sigma	S7653-Potassium
Chloride	Sigma	P9333-Хлорид
магния	Sigma	M2670-Кальция
хлорид	Sigma	C1016-Тритон
x100	Sigma
N-ацетил-&бета;-D-глюкозаминид	Sigma	N9376	Стоковый раствор под названием β-гексозаминидаза субстрат был приготовлен в 50mM в
диметилсульфоксиде	ДМСО Sigma	D2650-Лимонная
кислота	сигма		251275-ацетат
натрия	Sigma	S7670-Tris
	Sigma	T5941	-