Разработка В пробирке Модельной системой для изучения взаимодействия Equus Caballus IgE с рецептором с высоким сродством FcεRI

Summary

В настоящем исследовании описывается разработка и применение системы генетически модифицированного анализа, основанной на трансфекции клеток базофильного лейкоза крыс с помощью лошадиного гена FcεRIα. Трансфицированные клетки экспрессируют функциональный рецептор, в котором высвобождение медиаторов аллергической реакции может быть активировано IgE и антигеном.

Abstract

Взаимодействие IgE с его высокоаффинным Fc-рецептором (FcεRI) с последующей антигенной провокацией является основным путем в IgE-опосредованных аллергических реакциях. Как следствие высокого аффинного связывания между IgE и FcεRI, наряду с непрерывной продукцией IgE В-клетками, аллергия обычно сохраняется на протяжении всей жизни, и в настоящее время не существует постоянного лечения. Лошади, особенно скаковые, которые обычно являются инбредными, являются видом млекопитающих, которые очень склонны к развитию реакций гиперчувствительности, что может серьезно повлиять на их работоспособность. Физиологические реакции на аллергическую сенсибилизацию у лошадей зеркально отражают наблюдаемые у человека и собаки. В данной работе мы описываем разработку системы анализа in situ для количественной оценки высвобождения медиаторов аллергической реакции, относящейся к системе лошадей. С этой целью ген, кодирующий лошадиный FcεRIα, был трансфицирован и экспрессирован на поверхности родительских клеток крысиного базофильного лейкоза (RBL-2H3.1). Продукт гена трансфицированной лошадиной α-цепи образовывал функциональный рецепторный комплекс с эндогенными β- и γ-цепями крысы ¹. Полученная система анализа способствовала оценке количества медиатора, секретируемого из трансфицированных FcεRIα клеток RBL-2H3.1 лошадиного типа FcεRIα после сенсибилизации лошадиным IgE и антигенной провокации с использованием β-гексозаминидазы в качестве показателя ^{2, 3}. Высвобождение медиатора достигло пика на уровне 36,68% ± 4,88% при концентрации 100 нг ^мл-1 антигена. Этот анализ был модифицирован по сравнению с предыдущими анализами, использованными для изучения аллергических реакций человека и собак ^{4, 5}. Мы также показали, что этот тип системы анализа имеет множество применений для разработки диагностических инструментов и оценки безопасности потенциальных стратегий терапевтического вмешательства при аллергических ^{заболеваниях 6, 2, 3}.

Introduction

Аллергия, как известно, на протяжении тысячелетий. Лечение астмы был описан в древнеегипетской медицинского текста, известного как папирусе Эберса (~ 1550 г. до н.э.) и обсудили трав для лечения его ^7.

Сегодня аллергии классифицируется как ответ гиперчувствительности типа I, где Т хелперов типа 2 (TH ₂₎ рычаг иммунной системы бычков производство иммуноглобулина Е (IgE) антител в ответ на антигены окружающей среды, называемых аллергенами. Эти различные вещества, которые обычно взаимодействуют с клетками иммунной системы и стимулируют синтез и секрецию провоспалительных цитокинов, в том числе интерлейкина-4 и интерлейкина-13 ^{8, 9,} как у частицы в сигаретном дыме или дизельное выхлопных частиц, которые усиливают синтез IgE ^10.

Рост аллергических проявлений в промышленно развитых странах в последние 50 лет было обусловлено сочетанием эффектазагрязнителями окружающей среды и тенденция к более облагороженная окружающей среды, сочетающие переложить иммунный ответ к профилю преобладали по ТН ₂ цитокинов, предложенные «гигиеническая гипотеза» ^11.

Как уже упоминалось выше, люди не единственные млекопитающие, страдающие аллергией. Примечательно лошади и собаки могут также развиваться классические аллергические реакции, а также исследование по ¹² показал, что, как и у людей, лошадей аллергия приписывается генетических и экологических факторов. Как следствие, эти животные представляют хорошие модели для изучения взаимосвязи между генетическими и экологическими причинами аллергии, ее развитие от чувствительности к болезни и возможных стратегий вмешательства, как только клинические проявления установили в

В 1887 году, Stömmer был первым человеком, чтобы описать сходство между человеком и лошадей астмы ^13, эффект гистамина на лошади сердечно-сосудистой системы являетсяочень похож на человека ^14. Лошади также краеугольным камнем скачки промышленности, которая стоит нам $ 72 млрд с оборотом ставок по US $ 115 млрд в год ^15.

Большинство современных спортивных лошадей являются потомками небольшого числа арабских лошадей разводят леди Энн Блант с 1878 года. Современные скаковых лошадей, как правило, инбредных выбрать для способностей производительности. Они склонны к генетических расстройств, одним из которых является их чувствительность к монтировать аллергические реакции. Они также имеют в 1000 раз выше сывороточных уровней IgE, чем даже наиболее сильно аллергия человека ^16. Верховая аллергические реакции, как правило, проявляется в виде укуса насекомого гиперчувствительности (IBH) ^{17, 18.} Результаты IBH в дерматита из-за укусов образуют насекомых в роду Culicoides. Другая форма лошадей аллергических заболеваний является рецидивирующие препятствия в дыхательных путях (РАО), это проявляется в легких и дыхательных путях. Она характеризуется хрипы и лабораторииORed дыхание. РАО обычно происходит в ответ на споры плесени, и высокие уровни IgE аллерген-специфическая были зафиксированы в лошадей, страдающих от РАО в одном исследовании ¹⁹ хотя новое расследование не подтвердило эту ^20.

Исследования лошадей аллергии вращалась вокруг попытки мониторинга и нейтрализующих лошадей IgE путем разработки анти-лошадей IgE моноклональных антител (моноклональные антитела,) ^{21, 22.} Кроме того, исследование, проведенное ²³ обсуждает производство внеклеточных доменов α лошадиный высоким сродством Fc рецептора цепь (FcεRIα) рецепторов в попытке обнаружить и количественного определения в сыворотке IgE лошадей. Связанный с этим исследование Ledin ²⁴ обсуждает новый подход, направленный на нейтрализацию сыворотке IgE путем заливки иммунную систему с помощью собственной / НЕСАМОУПРАВЛЯЮЩИХСЯ иммуногена. Все эти исследования, однако, отсутствует эффективная анализа для проверки безопасности и эффективности их протоколов. В этой статье, мы теперь представляем Такой анализ SYSма применимо к изучению диагностических и терапевтических стратегий, имеющих отношение к лошади системы, где β-гексозаминидазы релиз, в качестве индикатора клеток медиаторов дегрануляции, они были начислены на RBL-2H3.1 клеток, экспрессирующих лошадей FcεRIα. Этот протокол основан на предыдущих публикаций ^{25, 4, 5, 2, 3,} описывающих инженерии RBL клеток, трансфецированных геном, кодирующим связывающий домен IgE рецептора с высоким сродством к IgE из различных видов. Протокол объясняет, как выполнить анализе высвобождения β-гексозаминидазы, результаты которого представлены как среднее ± стандартное отклонение для трех экспериментов.

Релиз анализ был впервые разработан Siraganian и Хук ²⁵ для изучения аллергии человека. Лаборатория группа во главе с доктором Рувим Siraganian также разработал RBL клеточной линии. Эти RBL клетки были разработаны, чтобы выразить человеческую FcεRIα и протокол был опубликован ^4. Заключительная частьиз анализа пришли с развитием плазмиды ПСВ в работе Neuberger ^26, который, описанной производство антител IgE путем клонирования свою тяжелую цепь гена вниз по течению от мышиного гена для вариабельной области IgE, который нацелен на гаптен 4-гидрокси-3 нитро-phenacetyl (NP), в результате чего химерное антитело было полностью функциональной. Способность развивать любую IgE таргетинга то же гаптен, в то же время клонирования его рецептор на поверхности RBL клеток привело к стандартизации анализа, что делает его полезным протокол для измерения дегрануляцию базофилов клеток.

Анализ имеет плюсы и минусы. Профи из анализа является его адаптивность, которые будут использоваться в любой системе млекопитающих, наша лаборатория, таким образом, использовал его для проверки дегрануляции в человека, собак и лошадей систем, и это достижимо лишь путем синтеза IgE организма и клонирования его рецептор на поверхности клеток RBL.

С другой стороны,Недостатки анализа является то, что клетки RBL очень чувствительны к тепловых, механических и рН изменений, что делает их дать изменение уровней дегрануляции в пределах одной и той же тесте. Он, таким образом, настоятельно рекомендуется, что анализы всегда повторяется трижды, а затем берется среднее значение из них. Кроме того, RBL клетки, как правило, смещаются в сторону не-рилизинг фенотипа, если они остаются в культуре ткани в течение длительного времени (> 10 недель) ^27, что делает их обслуживание громоздкой. Они также склонны к инфекциям микоплазмой бактерий, которые не видны с помощью оптического микроскопа и не меняют морфологию ячейки, но кардинально изменить их уровни дегрануляции. Таким образом регулярные тесты микоплазмы необходимы.

Protocol

1) Получение клеточной линии:

1. Разработка RBL-2H3.1 клеточную линию, выражающую лошадей FcεRI α:
   1. Использование основных методов культуры ткани для линий монослоя клеток, трансфекции родительских RBL-2H3.1 клеток с использованием плазмиды рЕЕ6, неся лошадиный ген FcεRIα (GenBank: Y18204.1) ^28. Добавить мкл 2 мкг ^-1 плазмидной ДНК в 0,8 мл клеток при плотности 1,2 x10 ⁷ клеток мл ^-1. Электропорации клетки при 250 В 960 мкФ с использованием 0,4 см electrocuvette затем сразу инкубировать на льду в течение 10 мин.
   2. Выберите трансформированных клеток с использованием средств массовой информации, содержащие 0,4 г сульфата генетицина G418, затем отсортировать оставшиеся живые клетки через FACS, помечая их флуоресцентным IgE антитела. Используйте полученную RBL-2H3.1 выражающее лошадей клеточной линии FcεRIα для расследования ^{2, 3.}
2. Предварительная проба антитела сенсибилизация:
   -1 5x10 ⁵ клеток мл.
3. Добавьте IgE интерес взвешенных клеток в конечной концентрации 1 нг мл ^-1, то пластина 100 мкл клеток на 96-луночный планшет в столбцах 1-6, и инкубируют при температуре 37 ° С ± 5% CO ₂ + 90% относительной влажности в течение 16 ч. После инкубационного периода, и перед выполнением анализа высвобождения, проверить колодцы под микроскопом для а слияния и клеточной приверженности.

2) Анализ выпуска:

1. Стиральная клетки:
   1. Буфер Теплый выпуск (25 мм труб, 120 мМ хлорида натрия, 5 мМ хлорида калия, 0,04 мМ хлорида магния и 1 мМ хлорида кальция) при 37 ° С, чтобы обеспечить осторожного промывания клеток.
   2. Вымойте клеток, щелкая пластину, чтобы удалить клеточную среду и добавлением 100 мкл теплой, 37 ° C, релиз буфер. Повторите два раза.
2. Антигена:
   1. Приготовьте серийное разведение антигена (NIP-HSA или DNP-HSA) в 0 нг мл ^-1, 0,1 нг мл ^-1, 1 нг мл ^-1, 10 нг мл ^-1, 100 нг мл ^-1, 1000 нг мл ^-1, 10000 нг мл ^-1 в буфере выпуска и тепло при 37 ° С.
   2. После второй промывки клеток, отбросить носитель и заменяют 100 мкл антигена решений. Убедитесь, что скважины в той же строке (A1-6 например) имеют одинаковую концентрацию антигена добавленную к ним.
   3. Настройка негативного контроля в строке А, добавив 0 нг мл ^-1 антиген. Добавить возрастающую концентрацию антигена вниз по строкам (BG) с последующим Triton-X-буфера (5% Тритон Х-100) в строки H клеток, чтобы лизировать клетки, которые будут использоваться в качестве положительного контроля. Инкубируют при 37 ° С в течение 20 мин, чтобы позволить клетки, чтобы освободить ее медиаторы.
3. Настройка отдельных элементов управления также:
   1. После инкубации передачи 50 мкл клеточного супернатанта к другой половине пластины (A1-6 скважин в скважинах A7-12 и т.д.). Отменить оставшиеся 50 мкл супернатанта и заменить с 50 мкл тритона-X буфера, чтобы позволить измерение количества выпущенных медиаторов в каждую лунку в колонках 7-12, как процент от общего объема медиаторов внутри клеток в колонке 1-6 ,
4. Фермент субстрата:
5. Добавить 50 мкл β-гексозаминидазы субстрата (50 мМ 4-нитрофенил N-ацетил-β-D-глюкозаминида подготовлен в ДМСО разбавляли до 2 мМ, добавляя его в цитратном буфере 0,2 М лимонной кислоты и 0,2 М ацетата натрия, рН 4,5) во все лунки, чтобы способствовало превращение субстрата в 4-нитрофенола в β-гексозаминидазы фермента. Инкубируйте пластин при 37 ° С в течение 2 часов.

5. Завершение реакции:
   1. Остановить реакцию, добавив в 150 мкл трис-буфера (1 М Трис-HCl, рН 9) в каждую лунку в качестве высоких рН буфера останавливает реакцию и превращает 4-нитрофенол в желтый цвет.
6. Чтение и анализ результатов:
   1. Read пластину с использованием планшет-спектрофотометре при длине волны 405 нм для измерения оптической плотности желтого цвета. Расчетное процентное содержание β-опубликованном гексозаминидазы, используя следующую формулу:

2. Применить эту формулу в каждую лунку, после чего берется среднее значение для каждой строки. A1 и A7 представляют расположение скважин в 96-луночный планшет. Показать график процент β-гексозаминидазы выпуска (что соответствует общей выпуска медиатора) AgaiНСТ антиген концентрация ^{2, 3.}

Results

Родительские RBL-2H3.1 клетки и те, трансфицируют с лошадиного гена рецептора FcεRIα были впервые сенсибилизированные мыши с IgE анти DNP-HSA и вызов с антигена DNP-HSA. Мышь IgE связывается с эндогенным рецептором крыс в обеих клеточных линий и, таким образом, действует в качестве контроля для проверки выпуска жизнеспособность обеих клеточных линий, чтобы освободить медиаторов (фиг.1). Это важный проверка и должна проводиться регулярно, так как на расширенной (> 10 недель) прохода в культуре клеток,...

Discussion

В целом результаты этого исследования показали, что, когда RBL-2H3.1 клетки, экспрессирующие лошадей FcεRIα были осведомлены с лошади IgE и оспорены антигена, они дают пик высвобождения медиаторов из 36,68% ± 4,88% от общего количества медиатора внутри клетки, по сравнению с RBL-2H3.1 родительские клетки не выражающие лошадей FcεRIα.

Таким образом, этот анализ является полезным инструментом для исследования и изучения лошадей аллергические реакции в пробирке. Его позволяет определят...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
RBL-2H3.1 экспрессирующий Fc&epsilon у лошадей; RIα	-	-	Произведено в лаборатории
Equine IgE anti NIP-HSA		-	-Произведено в лаборатории
96 лунок	Пластина Sigma	CLS3595-многоканальная
пипетка	Anachem	-	-
Инкубатор	Galaxy R	-
-4Гидрокси-5-йодо-3-нитрофенилуксусная кислота	Cambridge Research Biochemicals	N-1070-1	NIP-OH конъюгировали с сывороточным альбумином человека для получения NIP-HSA в лаборатории
Динитрофенил, конъюгированный с сывороточным альбумином	человека Sigma	A6661	Сокращенно DNP-HSA Планшетный
спектрофотометр	Anthos Labtec HT2	-
-трубки	Sigma	P1851-Sodium
Chloride	Sigma	S7653-Potassium
Chloride	Sigma	P9333-Хлорид
магния	Sigma	M2670-Кальция
хлорид	Sigma	C1016-Тритон
x100	Sigma
N-ацетил-&бета;-D-глюкозаминид	Sigma	N9376	Стоковый раствор под названием β-гексозаминидаза субстрат был приготовлен в 50mM в
диметилсульфоксиде	ДМСО Sigma	D2650-Лимонная
кислота	сигма		251275-ацетат
натрия	Sigma	S7670-Tris
	Sigma	T5941	-