Культура эмбриональных мыши Cochlear эксплантов и Перенос генов путем электропорации

Краткое содержание

Мы представляем метод, который описывает выделение и культивирование кохлеарных эксплантов из эмбрионального внутреннего уха мыши. Мы также демонстрируем метод переноса генов в кохлеарные экспланты с помощью электропорации прямоугольной волны. Культура эксплантов in vitro в сочетании с методом переноса генов позволяет исследователям изучать эффекты изменения экспрессии генов во время развития.

Аннотация

Слуховые волосковые клетки, расположенные в мышином органе корти, обнаруживают и передают звуковую информацию в центральную нервную систему. Механосенсорные волосковые клетки расположены в одном ряду внутренних волосковых клеток и трех рядах наружных волосковых клеток, которые простираются вдоль базальной до апикальной оси улитки. Описанный здесь метод культивирования эксплантов обеспечивает эффективный метод выделения и поддержания кохлеарных эксплантов из внутреннего уха эмбриональной мыши. Кроме того, морфология и молекулярные характеристики сенсорных волосковых клеток и несенсорных поддерживающих клеток в культурах кохлеарных эксплантов напоминают те, которые наблюдаются in vivo, и могут быть изучены в ее внутренней клеточной среде. Кохлеарные экспланты могут служить важными экспериментальными инструментами для идентификации и характеристики молекулярных и генетических путей, которые участвуют в клеточной спецификации и формировании паттернов. Несмотря на то, что трансгенные модели мышей обеспечивают эффективный подход к изучению экспрессии генов, значительное число мутантов у мышей умирает во время эмбрионального развития, тем самым препятствуя анализу и интерпретации фенотипов развития. Орган Corti от мутантных мышей, которые умирают до рождения, может быть культивирован таким образом, чтобы можно было проанализировать их развитие in vitro и реакцию на различные факторы. Кроме того, мы описываем технику электропорирования эмбриональных кохлеарных эксплантов ex vivo, которая может быть использована для подавления или сверхэкспрессии специфических генов и анализа их потенциальной эндогенной функции и проверки того, является ли конкретный продукт гена необходимым или достаточным в данном контексте для влияния на развитие улитки у млекопитающих^1-8.

Введение

Орган Corti у млекопитающих состоит из мозаики специализированных типов клеток, включая два типа механосенсорных волосковых клеток, а также по крайней мере четыре типа несенсорных поддерживающих клеток, что делает его идеальной модельной системой для изучения нормальных клеточных процессов, таких как пролиферация, спецификация судьбы, дифференцировка и структурирование. Кроме того, нормальное развитие этих различных типов клеток имеет важное значение для нормальной функции слуха. Следовательно, крайне важно понимать факторы, как молекулярные, так и клеточные, которые регулируют их развитие. Тем не менее, небольшой размер улитки мыши, а также ее труднодоступность представляют собой особую проблему для исследований экспрессии генов. Более того, большинство событий спецификации и формирования клеточной судьбы происходят в эмбриональные периоды времени и в основном завершаются до рождения. Таким образом, идентификация и характеристика сигнальных событий в эмбриональные периоды времени имеет важное значение для понимания молекулярных основ морфогенеза улитки.

Здесь мы демонстрируем метод культивирования интактной улитки in vitro из внутренних ушей эмбриональной мыши. Обоснование использования этого метода заключается в том, что культивируемые улитки сохраняют свои молекулярные и морфологические характеристики, тем самым обеспечивая ценную модель для исследования потенциальных генов-кандидатов и изучения механизмов, участвующих в морфогенезе улитки. Хотя трансгенные мыши могут быть использованы для исследований экспрессии генов, для мониторинга конкретных функций генов часто требуется система in vitro. Кроме того, кохлеарные культуры могут быть получены из трансгенных эмбрионов мышей, чтобы можно было изучить их развитие in vitro и реакцию на различные растворимые факторы и антагонисты. Хотя в этом протоколе используются эмбрионы на 13-й день (Е13), посевы от Е12 или Е14 до раннего постнатального внутреннего уха могут дать аналогичные результаты.

Мы также представляем технику переноса генов в культивируемых эмбриональных кохлеарных эксплантах с использованием электропорации прямоугольной палочкой. После выделения эксплантов улитки можно использовать электропорацию для экспрессии ДНК-плазмид генов, представляющих интерес, в отдельных клетках в пределах кохлеарного протока. Этот метод служит дополнительным подходом к исследованиям с использованием трансгенных мышей для получения представления о молекулярных путях, лежащих в основе клеточного фенотипа. С помощью этого метода переноса генов трансфицируются различные типы эпителиальных клеток в эмбриональной улитке, что позволяет проводить анализ потери и приобретения функции на уровне отдельных клеток. Кроме того, электрофизиологические исследования могут быть проведены и в культурах кохлеарных эксплантов⁸. Этот метод электропорации in vitro относительно прост и понятен, в сочетании с минимальным повреждением тканей, что привело к быстрому распространению данной методики.

Протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: Все протоколы, использующие живые животные должны быть рассмотрены и утверждены на уходу и использованию комитета Институциональная животных (IACUC) по и должны следовать официально одобренных методов по уходу и использованию лабораторных животных. Все вскрытия должны быть выполнены с использованием стерильной техники на чистом столе ламинарного потока. Перчатки и маски, если это необходимо, следует носить во время этой процедуры.

1. Рассечение эмбриональных Мышь внутреннего уха

1. Настройка для органа Корти эксплантов культур:
   1. Стерилизацию ламинарного потока капот культуры ткани при включении УФ-светом в течение приблизительно 30 мин и дезинфицировать поверхность с 70% -ным этанолом перед использованием. Кроме того, все стерилизации инструментов, включая рассечение тонких инструментов рассечение и Sylgard покрытием блюд для вскрытия эмбриона через автоклаве или путем выдержки в 70% этаноле в течение по крайней мере 20 мин перед использованием. Вылейте 70% этанола и позволяют блюда и инструменты высохнуть на воздухе в Клеа потока чистой ламинарногоп скамейке перед использованием.
   2. Подготовка стерильного Хэнка сбалансированный солевой раствор (HBSS) / (4- (2-гидроксиэтил) -1-пиперазинэтансульфонова кислота) (HEPES) смеси путем добавления 10% 10x HBSS и 0,5% HEPES и доведени рН приблизительно до 7,2 и фильтр стерилизуют Конечный раствор, и хранят при температуре 4 ° С. Выполняйте все разборы в охлажденный раствор HBSS / HEPES лучше сохранять ткани на протяжении всей процедуры.
   3. Шерсть со стеклянным дном блюда с базальной мембраны матрицы путем добавления 5 мл холодного (4 ° С) стерильного Игла в модификации Дульбекко (DMEM) с 300 мкл аликвоты базальной мембраны матрицы в стерильной 15 мл полипропиленовую трубку. Смешайте встряхиванием содержимого и добавить 150 мкл базальной мембраны матрицы DMEM смеси в центре каждого культуральной чашке, так что она охватывает всю культуру также присутствующего в центральной части блюда. Обложка посуду и хранить в 37 ° C инкубаторе в течение по крайней мере 45 минут перед использованием.
   4. Залить 4-5 мл охлажденной HBSS в гоРи стерильные полистирол чашки Петри и оставить его закрытым в капюшоне.
   5. Подготовка питательной среды в стерильных 15-мл полипропиленовую трубку путем добавления 9 мл DMEM 100 мкл N2 добавок, 10 мкг / мл CIPRO и 1 мл ФБС.
2. Выделение эмбрионов:
   ПРИМЕЧАНИЕ: В этой процедуре для культивирования кохлеарные эксплантов из эмбриональных мышей, урожай внутреннее ухо из эмбриональных день (E) 13 височных костей с на следующий день после оплодотворения рассматривается как E1 ^9. Протокол также может быть использован с эмбриональных мышиных внутреннего уха, начиная с E12 с E18.
   1. Эвтаназии приурочен беременной мышь с CO ₂ и жертвенное животное путем смещения шейных позвонков или соответствующих утвержденных протоколов. Провести euthanization от ламинарного потока капот культуры ткани для поддержания стерильности в комнатной культуре ткани.
   2. Поместите эвтаназии мыши на бумажном полотенце с живота вверх и дезинфекции живота с 70% этанола.
   3. Вскрыть брюшную полость, захватывая кожус изогнутыми щипцами с одной стороны, и вырезать эпидермиса и мышцы вдоль средней линии с помощью ножниц, используя другой рукой. Сделайте две перпендикулярные разрезы с обеих сторон и вытащить матку осторожно подняв двусторонних рога матки щипцами и снять его из-под соединительной ткани с помощью ножниц.
   4. Поместите эмбриональных цепь в чашку Петри, содержащую охлажденный раствор рассечение (HBSS / HEPES смеси) и трансфер в ламинарном чистом столе.
   5. Удалить эмбрионов тщательно из плаценты и поместить их в одном из стерильные чашки Петри, содержащие рассечение решение. Если решение оказывается кровавый, переместите их в новую чашку Петри.
      ПРИМЕЧАНИЕ: На данный момент, эмбрионы могут быть организованы с использованием промежуточного руководство Theiler.
   6. Обезглавьте эмбрионов, зажимая в области шеи с парой чистых щипцов или ножниц и поместить головы в свежей чашке Петри, содержащей охлажденный раствор рассечение.
3. Вскрытие внутреннего уха:
   1. Место Oпе глава эмбрион в стерильной Sylgard блюдо с холодной рассекающих
   2. Решение. Работа при вскрытии микроскопом при увеличении в ~ фактор 1.6, иммобилизации эмбрионов голову, поставив Minutien контакты вокруг или ближе к зрительному области (1А).
   3. Использование двух пар стерильных щипцов осторожно удалите кожу и открыть череп на спинной стороне вдоль средней линии (рис 1б). Удалить мозг от полость черепа и внутреннего уха, расположенные в височных костей можно определить на данном этапе (рисунок 1в, г). Подкладка из кровеносного сосуда, который обычно присутствует вокруг внутреннего уха, могут быть использованы в качестве ориентира для определения внутреннего уха на этой стадии (рис 1D).
   4. Проанализируйте внутреннее ухо от височных костей, помещая щипцы под ткани и выделения внутреннего уха от основания черепа и переход к новой блюдо с холодной решение рассекает (рис 1E, F),

2. Формирование органа Корти эксплантов культур

ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе развития, ткань хрящевая и может быть легко расчлененный с помощью щипцов.

1. Восточный внутреннее ухо, так что вентральной стороной вверх (фиг.2А) и стабилизировать внутреннее ухо, осторожно вставив острый конец Minutien штифтов через вестибулярной части внутреннего уха (фиг.2В).
2. Использование ультратонкие щипцы разрезать лежащего хряща, сделав надрез, используя один конец пинцетом возле овального окна и осторожно снимите хряща от улитки (рис 2С).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Важно, чтобы убедиться, что щипцы не вставлена ​​слишком глубоко в хрящ, как вышележащие хрящи иногда сливается с канала улитки, в этом случае было бы полезно использовать закрытые щипцы, чтобы освободить хрящ от основной улитки, очищая ниже сurface хряща. На данном этапе развития, кохлеарный спираль только три четверти оборота в длину.
3. Далее, подвергать сенсорного эпителия путем размещения щипцы предпочтительную область канала улитки, либо основание или на самой вершине, и, осторожно потянув за крышу улитки (рис 2D).
   ПРИМЕЧАНИЕ: крыша улитки должны быть полностью удалены, как это может замаскировать сенсорного эпителия, препятствующих анализа.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Эта процедура должна быть сделано аккуратно, как это легко оторвать сенсорный эпителий.
4. В качестве последнего шага, аккуратно удалите подлежащей соединительной ткани с открытой сенсорного эпителия, так что база улитки эксплантата равномерно квартиру.
5. Изолировать расчлененный улитки с вестибулярной части внутреннего уха с помощью щипцов. Это может быть выполнено до или после стадии 2,4 (рис 2Е).
6. Передача расчлененный кохлеарной чувствующего эпителия на базальной Membraпе матрица покрытием культура и используя 1,5 мм стерильную ковшовой нории (рис 2F).
7. Orient кохлеарной эксплантов с люменальной поверхности эпителия вверх и аспирации базальной мембраны матрица-DMEM решение тщательно сгладить ткани и заменить его 150 мкл свежей культуральной среды осторожно добавляя к блюду. Следует проявлять осторожность, чтобы убедиться, что каждый эксплантов хорошо прилипает к покрытой покровным стеклом и не плавают в культуральной среде. Убедитесь, что кончик пинцетом направлена ​​вниз, а помещения на стеклянной хорошо, чтобы избежать повреждения кохлеарной эксплантов.
8. Осторожно передачи культуры блюдо в стерильный 150 мм чашки для культивирования и место в инкубаторе тканевых культур при 37 ° С с 5% СО ₂ в течение требуемого периода времени, обычно 3-6 дней в пробирке (DIV). После 1 DIV, рассмотрим культур при вскрытии микроскопом, чтобы убедиться, что кохлеарный эксплантов придерживается хорошо в чашку с культурой.
9. После того как вcubation в пробирке для требуемой длины времени, культуры обрабатывали для иммуногистохимии.
   ПРИМЕЧАНИЕ: эксплантов культуры, как правило, выдерживают в течение 6 DIV, что эквивалентно стадии развития, P0. После инкубации в пробирке, культуры могут быть обработаны для ниже по течению приложений, таких как иммуногистохимии (фиг.3В), ОТ-ПЦР, гибридизация и / или вестерн-блоттинга.

3. Электропорация-опосредованной Перенос генов

1. Настройка для электропорации:
   1. Стерилизовать один 100 мм Sylgard покрытием стеклянной посуде в автоклаве или замачивания в 70% этанола в течение примерно 20 мин и дайте высохнуть на воздухе в чистом столе перед использованием.
   2. Подготовка ДНК из вектора экспрессии выбора, используя соответствующие макси- или миди-преп комплектов. Векторы экспрессии, используемые в настоящем Протоколе pIRES2-Atoh1.EGFP и pCLIG-NeuroD1.EGFP. Конечная концентрация ДНК должна быть не менее 1 мкг / мкл в стерильной ДНК /РНКазы свободной воды.
2. Электропорации ДНК в эмбриональные кохлеарных эксплантов:
   1. Добавить 10 мкл раствора ДНК плазмиды к новому 100 мм Sylgard покрытием блюдо и передавать полностью расчлененный кохлеарной эксплантов (полученного на стадии 2.5) в раствор ДНК.
   2. С просвета поверхности эпителия вверх, наклон улитку слегка так, чтобы было перпендикулярно плоскости тарелки.
   3. Поместите электрод лопасти по обе стороны от улитки с отрицательной лопасти (катод) в направлении сенсорного эпителия и положительным лопасти (анод), расположенного рядом с основания улитки.
      Примечание: С ДНК отрицательно заряженные, он переносит с отрицательного на положительный электрод и путем размещения на катодном конце зонда, примыкающей к сенсорного эпителия; ДНК в основном идут через поверхность сенсорного эпителия.
   4. Использование электропоратора, доставить 9 до 10 импульсов 24 мВ, 30 Продолжительность мс импульс с датчика положения педали нога на Т-он Электропоратор, а затем добавить 100 мкл теплой культуральной средой, к электропорации улитки.
   5. Повторите шаги 3.2.1-4 для всех кохлеарных эксплантов и ДНК всех интересующих генов и передать электропорации cochleae в матрицу покрытием блюдо базальной мембраны для посева (шаг 2,7). Культура все электропорации cochleae в 37 ° C, 5% CO ₂ увлажненном инкубаторе для требуемой длины времени, которые затем будут обработаны для иммуногистохимии.
      ПРИМЕЧАНИЕ: улитка из всего помета CD1 мыши (примерно 8-12 детенышей), можно выделить, микродиссекции, электропорации и высевали в <4 ч.

4. Анализ Cochlear эксплантов культур

ПРИМЕЧАНИЕ: Культуры, как правило, выдерживают в течение 6 DIV, что эквивалентно стадии развития, P0. После инкубации в пробирке, культуры фиксированы и обработаны для иммуногистохимии.

1. После требуемой длины Incubation, удалить культуральную среду и быстро промыть кохлеарный эксплантов в фосфатно-солевом буфере (PBS) и инкубируют в 4% параформальдегида (приготовленного в PBS) в течение 15 мин при комнатной температуре.
2. Промыть фиксатор добавлением PBS и промыть в PBS три раза в течение 15 мин.
3. Проницаемыми с помощью PBS-T (PBS + 0,5% твин) в течение 30 мин, после чего блокируют с PBS-T, содержащей 10% козьей сыворотки.
4. Инкубируют в растворе первичного антитела, содержащий первичное антитело в PBS-T с 1% козьей сывороткой в ​​течение ночи при 4 ° С.
5. Промыть улитки три раза при комнатной температуре с использованием PBS-T 15 мин перед добавлением каждого соответствующие Alexa-конъюгированные вторичные антитела.
6. С кохлеарной эксплантов культивировали на покровного стекла можно работать отдельно путем выделения покровное от блюда и монтажа на слайде. Это может быть достигнуто путем замачивания культуры блюдо в OS30 растворитель, по крайней мере, 1 часа при комнатной температуре. Использование стерильной лезвие, снимите покровное из диш и крепление на стекло и визуализировать под флуоресцентным микроскопом.

Результаты

Мы описываем метод выделения улитки из эмбрионального внутреннего уха и микропрепарирования для обнажения сенсорного эпителия. После вскрытия он может быть покрыт и культивирован как интактный кохлеарный проток (Рисунок 3) и проанализирован с помощью иммуногистохимии. Культивируемые кохлеарные экспланты представляют собой полезный анализ для изучения влияния различных растворимых факторов и фармакологических препаратов на развитие улитки. После вскрытия кохлеарных эксплантов можно использовать метод элек...

Обсуждение

Все клетки в мембранном лабиринте внутреннего уха мыши в том числе сенсорные, nonsensory и спирального ганглия нейронов получены из placodally полученных отоциста расположен рядом с мозге эктодермы, около ^10-14 E8. В E11, брюшной области отоциста распространяется для формирования канала улитки, и как развитие продолжается, группа эпителиальных клеток в улитке, а также в других регионах отоциста, становятся определяется как prosensory патчей, которые впоследствии приведет к различные виды механосенсорных волос...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
HBSS	Gibco	14065-056
HEPES	Gibco	15630-080
Dulbecco' s Модифицированная среда	Gibco	12430-054
Фетальная бычья сыворотка	Gibco	10082
N-2 Добавка (100x)	Gibco	17502-048
Ципрофлоксацина гидрохлорид	Cellgro	61-277-RF
Стеклянная тарелка 60 мм	Kimble Chase	23062-6015/23064-6015
Стеклянная тарелка 100 мм	Kimble Chase	23064-10015/23062-10015
Булавки Minutien	Fine Science Tools	26002-15
Щипцы Dumont #5	Fine Science Tools	11251-10
Генератор импульсов	Protech International Inc	CUY21Vivo-SQ
Стеклянные донные тарелки для культуры	MatTek	P35G-0-10-C
Matrigel matrix	BD Biosciences	356237
Чашка для культур, 60 x 15 мм	Becton Dickinson	353037
Чашки для культивирования тканей	Greiner Bio-one	639160
Фосфат буферный физиологический	Gibco	10010-023
OS-30	Dow Corning	4021768
Fluoromount	Southern Biotech	0100-01
Конические пробирки, 15 мл	Greiner Bio-one	188261
Миозин 6	Proteus Biosciences Inc	25-6791
Миозин 7a	Proteus Biosciences Inc	25-6790
TuJ1	Sigma	T2200