Интубация опосредованного Интратрахеального (IMIT) Инстилляции: неинвазивный, легких конкретных Система доставки

Краткое содержание

Интубации-опосредованной трахею (IMIT) инстилляция реагентов является отличным, неинвазивный метод исследования респираторных заболеваний, а также к способу привить терапевтические реагенты непосредственно в легкие. Это быстрый и высоко воспроизводимым методом, который является подходящим для доклинических испытаний.

Аннотация

Респираторные исследования болезни, как правило, связаны с использованием мышиных моделях в качестве суррогатных систем. Тем не менее, существуют значительные физиологические различия между мышиными и дыхательной систем человека, особенно в их верхних дыхательных путей (УРТ). В некоторых моделях, эти различия в мышиной носовой полости может иметь значительное влияние на прогрессирование заболевания и презентации в нижних дыхательных путей (LRT) при использовании интраназального методы закапывания, потенциально ограничивающие полезность мышиной модели для изучения этих болезней. По этим причинам, было бы выгодно разработать методику, чтобы привить бактерий непосредственно в легкие мышей с целью изучения LRT болезнь при отсутствии вовлечения УРТ. Мы назвали эту легких конкретный метод доставки интубация опосредованного трахею (IMIT) инстилляции. Это неинвазивный метод сводит к минимуму возможность закапывания в кровоток, что может произойти во время более инвазивной traditiОнал хирургические интратрахеального подходы инфекция, и ограничивает возможность случайного доставки пищеварительного тракта. IMIT является двухэтапный процесс, в котором мышам первой интубацию, с промежуточным чтобы обеспечить правильное размещение катетера в трахею, а затем встраивают в тупой иглой в катетер, чтобы опосредовать прямую доставку бактерий в легких. Такой подход облегчает> 98% эффективность доставки в легкие с отличным распределением реагента всей легких. Таким образом, IMIT представляет собой новый подход к изучению болезни LRT и терапевтический доставку непосредственно в легкие, улучшая при возможности использовать мышей в качестве суррогатов для изучения респираторных заболеваний человека. Кроме того, точность и воспроизводимость этой системы доставки также делает его доступным надлежащей лабораторной практике (стандартами ГЛПС), а также поставка широкого спектра реагентов, которые требуют высокой эффективности доставки в легкие.

Введение

Мыши были использованы для моделирования многочисленные проявления заболевания человека, в том числе множества заболеваний дыхательных путей. Модели Суррогатное болезни зачастую не в состоянии повторять все аспекты моделируемой болезни, как правило, из-за важного физиологического или иммунных различия в этих двух моделей принимающих. Таким образом, цель улучшения модельных систем является разработка подходов, которые позволяют суррогаты более точно отражают процесса заболевания или провести реакцию, как наблюдается в исходной системе хоста. Есть несколько ключевых физиологических различий между мышами и людьми в механизме, с помощью которого они вдохновляют воздух. В этих различий значительные логометрических различия в размерах между URT и LRT. Было подсчитано, что мыши обладают> 100 раза площадь поверхности УРТ относительно человека, нормализованное против общего ^1,2 емкость легких. Таким образом, носовых раковинах из мыши позволяет более широкие фильтрации вдыхаемого воздуха, чтобы облегчить гораздо большую скорость breathiнг, которые могут иметь существенное влияние на исследованиях пневмонии, если инфекция из полости носа играет важную роль в прогрессировании заболевания.

Несколько разных подходов были использованы, чтобы привить бактерии в легких мышей для изучения респираторных заболеваний человека, как. Наиболее распространенными из этих подходов является интраназального прививки, в котором жидкую суспензию наносят на одну или обе ноздри мыши. В то время как относительно простой, предостережений, такие как объем закапывания и вида анестезии, используемых может повлиять на эффективность закапывания в LRT через интраназально прививки ^3-5. В частности, Миллер и др. показали, что интраназально инстилляцию Francisella tularensis объемов менее 50 мкл не привести к закапывания бактерий в LRT ^6. Они также наблюдали более LRT закапывания при использовании ингаляционных изофлурана в отличие от введенного кетамина / ксилазина для анестезии. Тем не менее, наша experiencе с Чумная палочка интраназального прививки указывает более последовательным прививка может быть достигнуто с помощью кетамина / ксилазина по сравнению с изофлуран (MBL, неопубликованные данные). Эти различия могут быть связаны с патогеном используется или при вариации лабораторных процедур, но главное выделить потенциальную изменчивость этой техники. Кроме того, легкие, собранные сразу после интраназального инстилляции, показывают, что относительно низкий процент начальной бактериального инокулята достигает легких (в случае Y. Pestis, только 10% были обнаружены через 1 час после инстилляции ^7), предполагая, что большое количество бактерий может быть сохранена в УРТ (или проглатывании в желудочно-кишечном тракте). В некоторых моделях болезни, это значительное отложение бактерий на URT слизистой может посрамить наше понимание развития болезни, если организм способны колонизировать мышиный носовую полость в форме, не согласующейся с заболеванием человека. Например, при использовании в естественных условиях </ EM> томография, было замечено, что Burkholderia pseudomallei, которые не колонизировать человеческий УРТ, вызывает подавляющее оппортунистические инфекции мышиного полости носа при доставке интраназальным способом инстилляции ^8.

Другие методы воспитания бактерии в легких мышей были также использованы в инфекционной исследований болезни. Тем не менее, по сравнению с интраназально закапывания эти методы, как правило, требуют более техническую экспертизу и / или дорогостоящее оборудование, не устраняя потенциал для инфекции посвящения в нескольких сайтах (например, аэрозольных [URT и LRT] трансоральным [желудочно-кишечного тракта и LRT]; и хирургическое трахею [LRT и поток крови]). Учитывая потенциальные осложнения, которые могут быть связаны с вторичными очагов инфекции, мы стремились разработать интратрахеальные подход, который обходит УРТ и обеспечивает возбудителя непосредственно в легкие под наркозом мышей, но также ограничивает случайное inoculatион в поток крови или желудочно-кишечного тракта. С этой целью, интубация опосредованного трахею (IMIT) закапывание был разработан в качестве консервативного процедуры, гарантирующей LRT инстилляцию посевного материала путем включения промежуточный этап для проверки правильности установки катетера до закапывания. Этот метод описан с использованием инстилляции краски, чтобы визуально демонстрируют широкое распределение посевного материала на протяжении легких, и P. палочки инстилляции, чтобы продемонстрировать высокую эффективность доставки (> 98% инокулята) этого метода в легкие. Важно отметить, что в то время как первоначально разработана для бактериальной доставки, IMIT также предлагает эффективный инструмент для: I) закапывания различных молекул для изучения других моделей респираторного заболевания, II) легких конкретных терапевтических поставки, и в) функция основная легких исследования, включая целенаправленное доставка миРНК в легкие.

Протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: Все процедуры, описанные здесь, были рассмотрены и одобрены Университета комитета Луисвилле институциональной биобезопасности (протокол # 13-056) и Уходу за животными и использованию комитета (протокол # 13-064).

1. Подготовка Dye

1. Развести 0,1% (вес / объем) Кумасси в PBS и фильтр стерилизуют с помощью шприца 0,45 мкм фильтр.

2. Подготовка синегнойной палочки культуры

1. 15 часов до запланированного инстилляции, инокуляции 3 мл бульонной культуры с одной бактериальной колонии.
2. Выращивают культуру 15 ч при 37 ° С на шейкере (200 оборотов в минуту).
3. Центрифуга 1 мл культуры в 1,5 мл пробирке 12000 х г в течение 30 сек.
4. Извлеките носитель и ресуспендируют осадок в 1 мл PBS.
5. Развести аликвоты бактериальной суспензии сырья 1:10 в PBS и измерить OD ₆₀₀ разбавленного бактериальной суспензии, чтобы определить,концентрация бактерий.
6. Развести бактериальной смеси суспензии в PBS до желаемой концентрации бактериального инокулята, используя объем подачи 50 мкл для IMIT инокуляции.

3. IMIT Инстилляции

1. Поместите группу мышей в изофлуран индукции анестезии камеру и анестезию с использованием 2 - 3% смеси изофлуран / кислород.
2. На начальном начала седации, загривок мыши, удерживая кнопку мыши в вертикальном положении, и управлять 10 мкл 2% -ного раствора лидокаина через зонд иглы до задней части горла и дайте раствору стечь вниз надгортанника. Вернуться мышь для анестезии камеры.
   1. Разрешить минимум 5 минут, чтобы разрешить лидокаин для полного эффекта, как местный анестетик.
3. Когда мыши достигли желаемого уровня седации (дыхание скорость ~ 60 ударов в минуту), уменьшить изофлурана до 2% для поддержания седации.
4. Предварительный натяг краситель или бактериальная посевной в 250 мкл газонепроницаемаяТочность шприц нужным с 22 G долгое тупой иглой.
   1. Первый составить 150 мкл воздуха, измеренные тефлоновой поршень шприца. Далее, составить 50 мкл инокулята, продвигая поршень тефлоновую от 150 мкл метки в 200 мкл метки на корпусе шприца.
      Примечание: Когда образец выбрасывается в интубированных мыши, 50 мкл суспензии будет доставлен во-первых, за которым следует 150 мкл воздушной подушке, который будет распространять инокулята в течение всего легкого.
5. Снимите одну мышь от индукции камеры и лежал на спине на интубации платформы. Закрепите мышь на платформу, зацепив его резцы с уплотнительным кольцом, прикрепленной к липучке, и обеспечение липучки на платформу. Поднимите мышь, чтобы под углом 45 °.
6. Использование микро хлопка аппликатор, убрать язык с качения, используя доминирующую руку.
7. С недоминирующем стороны, использовать операционную Отоскоп посадку с интубации воронок и к маintain язык опровержение и визуализировать голосовую щель.
8. С доминирующей рукой, использовать направляющую проволоку с резьбой через 20 G катетера интубировать мышь, гостиный катетер на глубину 10 мм в трахею мыши (катетер подходят с силиконовой рукав с 10 мм подвергаются катетера). Снимите Отоскоп / воронок.
9. Убедитесь, что мышь была правильно интубация, обеспечивая катетер с недоминирующем рукой, коротко крепления связную длину Луер 1/16 "прозрачной трубки, содержащей цветную краску.
   ПРИМЕЧАНИЕ: краситель быстро мигрируют туда и обратно в соответствии с дыханием.
10. Не приступайте к последующим шагам, если подтверждение интубации не было установлено в этот момент. Если интубация пытались не удалось, сбросить катетера и направляющей проволоки на один попытки интубации.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это нецелесообразно пытаться более двух интубации мыши в одной сессии, не вызывая травму мыши.
11. Продолжайтеобеспечить катетер с недоминирующем стороны, вставляя точность шприц / тупую иглу, содержащую жидкость подушку подвеска / воздуха.
12. Нанесите жидкость / воздух непосредственно в легкие в одном движении жидкости и немедленно удалить иглу / катетер с помощью мыши.
13. Вернуться мышь в клетку и дать восстановление после наркоза.

4. Характеристика IMT Доставка

1. После IMIT закапывания, усыпить мыши по CO ₂ асфиксии в соответствующее время после прививки.
2. Закрепите эвтаназии мыши на рассечение борту и замочить грудь и живот с 70% этанола, используя бутылку шприца.
3. Если оценивать распределение агента визуализации всей легких, удалить легкие от животного с помощью метода стерилизации и отображения легкие, как подходящий для визуализации.
   ПРИМЕЧАНИЕ:. Легкие могут быть получены дополнительные гистологические методы окраски через соответствующий фиксации или криоконсервации
4. Если оценки бактериальной бремя инфицированной ткани легкого, удалить легкие от животного с помощью метода стерилизации. Место легкие в стерильный, взвешенную 1 унция мешок образца. Взвешивают и записывают вес образца мешка + легкие.
   1. Добавить 1 мл стерильного 1x PBS каждому отбора проб + тканях. Reseal мешок образца.
   2. Перемешать тканей от нежно прокатки 25 мл серологические пипетки над отбора проб + ткань.
   3. Генерация серийных разведений гомогената легких в стерильном PBS и плиты на чашки с агаром (LB, или по мере необходимости, чтобы бактериальных видов изучаются):
      1. Провести шесть раз серийное разведение в U-образным дном 96-луночного планшета по многоканальной пипетки затем тарелка три образца по многоканальным на агаром.
   4. Инкубируйте агаром в течение ночи при 37 ° С и перечислить колониеобразующих единиц на следующий день.

Результаты

Для визуализации распределения привила материала через метод IMIT, 50 мкл 0,1% Кумасси красителя закапывали в легких под наркозом мыши. Мышь была немедленно усыпляют и легкие были удалены стерильной вскрытии. Рисунок 1 показывает, что краситель был доставлен ко всем долях легких.

Для определения количества бактерий доставлено в легкие с помощью метода IMIT три группы мышей (n = 3) закапывали в трех различных концентрациях P. палочка (1,21 х 10 ^8, 1.21x10 ^7, и 1,21 х 10 ⁶ колониеобразующих единиц [КОЕ] в 50 мкл). Сразу после IMIT закапывания, мышей умерщвляли, легкие удаляется, и бактериальные номера были перечислены и по сравнению с посевного (рисунок 2). Доставка инокулята имеет высокую эффективность с помощью этого метода, с> 98% инокулята извлеченного из легких закапываютживотные. Кроме того, IMIT инстилляции была высокой воспроизводимостью, независимо от концентрации инокулята (R ² = 0,9951).

Рисунок 1: IMIT инстилляции распределяет инокулята на протяжении легких легкие от мышей привили с 50 мкл 0,1% Кумасси синим красителем шоу распределенных во всех лепестков..

Рисунок 2:. IMIT закапывания бактерий в легких мышей были заложены с Р. палочки и количество бактерий закапывают в легких (Вход ₁₀ КОЕ - восстановлены) сравнивались с расчетной инокулята (Вход ₁₀ КОЕ - поставляется). Каждый круг представляет КОЕ / легкое отдельного мыши (п = 3 для каждогоБактериальный доза).

Обсуждение

IMIT закапывания предлагает ключевые усовершенствования существующих моделей респираторных заболеваний в способности воспроизводимо привить реагентов непосредственно в легкие. Это быстрый подход, который идеально расположен для команды из двух исследователей, один из которых управляет логистикой анестезии и арретирования, а другой, который выполняет технику IMIT. Большие исследования могут быть проведены с использованием IMIT со средним обязательства время 2 - 3 мин на мышь. Поскольку подход использует изофлураном как обезболивающее средство, мыши быстро оправиться от наркоза, уменьшая земледелие время мониторинга животных через восстановление.

Наиболее технически сложным аспектом метода IMIT является начальный этап интубации мышей. Лица, которые учатся выполнять IMIT способны сосредоточиться на этом первом шаге установки катетера и обеспечение того, чтобы интубации была достигнута через визуального подтверждения движения красителя. Преимущество этого подхода в том, что легких спекуляцияБР закапывания гарантируется за счет использования подтверждения интубации, что повышает доверие как нового научного, а также эксперт пытается интубировать трудное животное. Ключевыми элементами оптимизации вероятность успешного интубации являются: I) достижения глубокой седации, чтобы обеспечить достаточное рабочее время, б) правильное размещение в воронок в рот, чтобы позволить хорошую визуализацию надгортанника, III) размещение хорошо глубина воронок, чтобы язык остается втянут в течение всей процедуры, и IV) использование поворотной платформы для поддержки руки исследователя так, что процедура проводится расслабились и с устойчивым подходом.

Один из недостатков процедуры IMIT связана с частотой IMIT инстилляции событий. В связи с потенциальной травмы, связанной с пропущенного интубации, это не рекомендуется, что более чем две попытки интубации проводиться в течение одного сеанса (до двух промахов). IMITимеет отличный потенциал в ее способности быть использован для доставки терапевтических средств в легких мышей, однако терапевтические режимы, которые используют очень частой доставки реагента в легких не могут быть пригодны для IMIT. Это может быть возможным, что IMIT можно использовать ежедневно, чтобы доставить реагенты в мышиной легких, не вызывая значительного травму, но только тогда, когда проводятся высококвалифицированным научным, так как большинство травмы, связанной с интубации, как полагают, связаны с пропущенного события интубации , Такой высокочастотный IMIT должны обсуждаться с местными ветеринарами и IACUC.

Дополнительным потенциальным ограничением IMIT является размер мыши, который в настоящее время интубированных. Процедура IMIT описано выше был разработан с использованием мышей из примерно 17 - 22 г, где 20 г катетер был найден, чтобы быть подходящим размером для трахею мышей в этом диапазоне размеров. Большие катетеры были успешно использованы в старых мышей; начальная разработка IMIT мADE использование катетера 18 г в линии BALB / C мышей, которые являются> 20 г. Важно отметить, что, если используются альтернативные размеры катетер, тупые иглы должны быть получены, которые подходят просвет катетера и обрезаны до длины, что расширяет только 1 мм за кончик катетера. Интубация мышей меньше, чем 17 г может быть возможна, но не рекомендуется из-за опыта, необходимого, и потребует использования меньшего катетеров и воронок, чем описаны выше.

Мы использовали IMIT на поставку нескольких респираторных инфекций в дополнение к P. палочки, в том числе В. pseudomallei ⁹ и Klebsiella пневмонии ^10. IMIT модель сделала большие успехи в наших исследованиях В. заболевания органов дыхания pseudomallei, выявив, что интраназально прививка вызывает раннее, УРТ заболеваемость мышей, а не системного конечной заболевания наблюдается в человеческой болезни ^9. Б. pseudomallei является Tier 1 Selecт агентом влияния Biodefense, и как развиваются такие, модели респираторные заболевания для аэрозольного воздействия, какие модели потенциал биозащиты связанные маршрут въезда качестве оружия патогенов. Потому что современные модели аэрозольные привести к заражению как URT и LRT, те же потенциальные фенотипы рано заболеваемости мы определили для интраназального модели В. заболевания органов дыхания pseudomallei может обратиться в аэрозольной модели. Будущей адаптации модели IMIT может быть интубации-опосредованной доставки аэрозоля (Имад), в котором мышам интубацию для целевой доставки аэрозоля только в легкое. Механические вентиляторы в настоящее время доступны для поддержания ИФ анестезии, которая может быть адаптирована для доставки аэрозоля, а не на основе жидкого, патогенов вызов.

IMIT первоначально была разработана в качестве подхода для оптимизации доставки бактерий в легких, но также имеет приложение на поставку других реагентов в легких мышей. Как дисговорилось выше, интраназального доставки соединений мышам приводит к низкой эффективности, сильно варьирует доставка реагентов в органе-мишени легкого. Интраназальное доставка Позитронно-эмиссионная томография (ПЭТ) реагентов для мышиного легкого дали 40% эффективности ¹¹ доставке, в то время как мы продемонстрировали, что IMIT предлагает отличную альтернативу другим поставки легких подходов с> 98% эффективности доставки и multilobar распределения. Это улучшение в адресной доставки в легкие имеет потенциал для увеличения воспроизводимости терапевтического доставки для лечения легочного заболевания. IMIT мог же предлагают льготы для исследований: я) влияние окружающей среды легочных раздражителей, б) рак легких фенотипические исследования, III) легких конкретных миРНК нокдауна.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Грызун, наклонная рабочая стойка	Hallowell EMC	000A3467	Основание должно быть отсоединено при работе в операционном отоскопе BSC
Головка	Welch Allyn	21700
Otoscope 3,5 В Li Батарея	Welch Allyn	71900
Мышь для интубации Зеркало короткое, автоклавируемое	Hallowell EMC	200A3589S
Резцовые петли	Hallowell EMC	210A3490A
из хлопка	Puritan	871-PC DBL	Используется для ретракции языка
Внутривенный катетер, 20 G	Exel Int	26741	Опционально: подходит силиконовая втулка с открытой поверхностью катетера 10 мм
Газонепроницаемый шприц, 250 мкл	Hamilton	81120	Используется для доставки жидкого инокулята с помощью
тупой иглы IMIT, 22 г	Hamilton	91022	Обрезка по длине для выступающего на 1 мм из 20 G катетера
Направляющая проволока (оптоволоконная проволока, 0,5 мм)	TheFiberOpticStore.com	FOF .50	Отрезок до длины 6 дюймов: используется в качестве направляющей проволоки для интубации
туберкулинового шприца, 1 мл	Becton Dickinson	309659	Собрать с оптоволоконной проволокой в качестве направляющей проволоки
Brilliant Blue R (Coomassie)	Sigma	B0149
Tygon трубка, 1/16 "	Saint Gobain	ALC00002
Кобель Luer 1/16" barb	Cole Parmer	45503-22
Самка Luer 1/16" barb	Cole Parmer	45500-00
Lidocaine, USP	Spectrum	LI102	pH лидокаин в раствор при 2% (w/v) pH7.0
Пакет для проб, 1 унция	Whirl-Pak	B01067
U-bottom 96 луночный планшет, стерильный	Greiner	650161

Аппликатор с тонким наконечником