Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Обнаружение Истинного IgE-выражения мышь B Lineage клеток

10.7K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/52264

⸱

1 декабря 2014 г.

 ,  ,  , 
1Department of Medicine, Division of Rheumatology, Immunology and Allergy, Brigham and Women's Hospital and Harvard Medical School

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

In vitro анализ рекомбинации переключателей класса у мышей затруднен из-за цитофильных молекул IgE, связанных с рецепторами Fc на поверхности В-клеток. Мы описываем метод детекции IgE с помощью трипсин-опосредованного расщепления поверхностно связанных IgE перед фиксацией и пермеабилизацией для окрашивания цитоплазматической флуоресценцией.

Аннотация

B-лимфоцит тяжелой цепи иммуноглобулина (IgH) коммутатор класса рекомбинации (КСО) является процесс, в котором изначально выразил IgM переключается на другие IgH изотипами, таких как IgA, IgE и IgG. Измерение IgH КСО в пробирке является основным методом для изучения ряда биологических процессов, начиная от рекомбинации ДНК и ремонт, чтобы аспектах молекулярной и клеточной иммунологии. В пробирке КСО анализ включает измерительной поверхности Ig выражение проточной цитометрии на активированных В-клеток. В то время как измерение IgA и IgG подклассов проста, измерение IgE с помощью этого метода является проблематичным в связи с растворимыми IgE связывания с FcεRII / CD23 экспрессируется на поверхности активированных В-клеток. Здесь мы опишем уникальная процедура для точного измерения IgE-продуцирующих мыши В-клетки, которые прошли КСО в культуре. Метод основан на трипсина-опосредованного расщеплени IgE-CD23 комплексов на поверхности клеток, что обеспечивает обнаружение IgE-продуцирующих В клональные клеток путем CYtoplasmic окрашивание. Эта процедура предлагает удобное решение для проточной цитометрии анализа КСО IgE.

Введение

Во время тяжелой цепи иммуноглобулина (IgH) коммутатор класса рекомбинации (КСО) у мышей и людей, IgH μ постоянные экзоны область (cz М) удаляются и заменяются одним из нескольких наборов вниз по течению постоянных экзонов области (C H) (например Cγ, с £ и Са), в результате чего переход от производства IgM к производству других классов Ig (например, IgG, IgE, IgA или). КСО происходит в течение переключатель (S) регионов, которые 1-10 кб последовательности, расположенные 5 'к каждому набору C H S 1. Вызванные активацией цитидиндеаминаза (AID) фермент инициирует КСО с помощью цитидиновое дезаминирования деятельности.

IgE является ключевым медиатором аллергических заболеваний 2 и более глубокое понимание того, как IgE производится и регулируется может открыть двери для новых терапевтических подходов к атопическим заболеванием. У мышей и человека, IgE является наиболее жестко регулируется Ig изотипа. IgE, как правило, обнаруживается на уровнях тысяч ТимаES меньше, чем другие изотипы IgH 3, но может быть значительно выше у болезненных состояний 4. Тем не менее, КСО IgE не полностью поняты. В пробирке активации В-клеток с помощью IL-4 в комбинации с любой анти-CD40 или LPS индуцирует КСО как IgG1 и IgE 5. Активированные В-клетки выразить низким сродством IgE рецептор FcεRII / CD23 2,6, который связывает растворимый IgE, секретируемый в культуре после КСО. Поэтому при анализе с проточной цитометрии, В-клетки с рецептором IgE связаны пятна аналогично B клетки, эндогенно экспрессирующих IgE 7. Хотя известно, что мыши B-клетки экспрессируют низкое сродство рецептора IgG FcγRIIB1 (CD32) 8, в нашем опыте это не по всей видимости, мешает измерению класса переключение на IgG1. Тем не менее, при измерении переключение IgE после активации В-клеток в культуре, неспецифический поверхностно-св занный IgE может скрывать анализ. С общими методами окрашивания, не-IgE-экспрессирующие клетки окрашиваются положительно для IgE.

Изложенные здесь стратегия, которая была использована для проведения КСО анализов и выявления истинных IgE-выражения В-клеток у мышей, 9 - 11. Лечение активированных В-клеток с трипсином, общий лаборатории реагент, чтобы переварить белок, устраняет как cytophylic и мембраной поверхность IgE. После пермеабилизации и окрашивание цитоплазмы IgE, таким образом, показывает истинное IgE-продуцирующих клеток.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: Все эксперименты, описанные здесь, были в соответствии с институциональными Комитет Уход за животными и использование (IACUC) руководящие принципы и одобрен Animal Research детской больницы (арку), Бостон, штат Массачусетс.

1. Подготовка реагентов

  1. 1,000x ИЛ-4 на складе: Развести IL-4, цитокин с 20 мкг / мл в H 2 O и 0,1% бычьего сывороточного альбумина (BSA). Не включать в 200 мкл аликвоты по 1,5 мл микроцентрифужных труб и хранить при -20 ° С.
  2. 1,000x анти-CD40: Получить от производителя по 1,0 мг / мл, хранят при 4 ° С.
  3. В стимуляции клеток носитель: до 425 мл средой RPMI-1640, добавить 75 мл свежей талой фетальной телячьей сыворотки (FCS), 10 мл 1,0 М HEPES буфера, 5 мл L-глутамина на складе, 5 мл пенициллина: Стрептомицин складе, 5 мл минимально необходимой среды Non-незаменимые аминокислоты (MEM-NEAA) и 3,5 мкл 2-меркаптоэтанола. Храните носители при 4 ° С в течение недели. Добавить IL-4 (20 нг / мл) и анти-CD40 (1,0 мкг / мл) непосредственно перед использованиемтолько с объемом сред, необходимых.
  4. 2% FCS-FACS буфера: Добавить 10 мл FCS в 490 мл 1х PBS. Хранить при 4 ° С.
  5. 2x трипсина-ЭДТА раствор: развести 5 мл 10х трипсина-ЭДТА маточного раствора (5,0 г трипсина, 2,0 г ЭДТА на литр) в 20 мл 1x PBS. Магазин трипсин-ЭДТА в 2 раза работы аликвот при 4 ° С. Дайте нагреться до комнатной температуры перед использованием.
  6. Эмбриональной телячьей сыворотки: Держите размороженные ФТС, при 4 ° С на срок до двух недель. Место на льду 15 мин до цитоплазматической процедуры окрашивания.
  7. Обычный-буферный формалин: Подготовка 10% раствор формалина (3,7% параформальдегида). Формалин является токсичным, и поэтому справиться с этим в лабораторных вытяжкой при ношении соответствующие средства индивидуальной защиты. Магазин формалина при комнатной температуре в корпусе химического хранения.
  8. Метанол: Хранить абсолютный метанол (100%) при температуре от -20 ° С до тех пор, пока клетки готовы быть проницаемыми. Следует отметить, что метанол является горючим и должны быть сохранены в соответствующем морозильной камеры.

2.Очистка и активация В-клеток

  1. С свеже-заготовленной селезенки мыши, подготовить суспензии отдельных клеток, слегка нажав орган через сито 70 мкм клетки с плунжера 3 мл шприца. В 15 мл коническую центрифужную пробирку, собрать клетки в 10 мл 1x PBS и центрифуге при 300 х г в течение 5 мин при 4 ° С.
  2. Декантировать супернатант и ресуспендируют осадок в 1 мл красных кровяных клеток лизиса буфера в течение 5 мин. Нейтрализовать с 13,5 мл 1x PBS и центрифуге при 300 х г в течение 5 мин.
  3. (Необязательно) Магнитное разделение В-клеток с использованием анти-CD45R (B220) меченных бусы, после очистки протокола MACS согласно инструкциям производителя.
  4. Стимулирование очищенные В-клетки в 1,0 × 10 6 клеток / мл в нагретой стимуляции В-клеток среде, содержащей IL-4 (20 нг / мл) и анти-CD40 (1,0 мкг / мл) в течение 5 дней при 37 ° С. Начнем с 8 мл культуры, разделенных на две лунки культурального планшета (4 мл каждый) 6-а.
  5. Проверьте cultuповторно каждый день, чтобы поддерживать в 1,0 × 10 6 клеток / мл. Регулировка концентрации путем разделения в другие лунки и разбавления культуры при стимуляции В-клеток свежую среду, содержащую IL-4 и анти-CD40.

3. трипсинизации Фиксация и пермеабилизирующего

  1. Трипсинизации
    1. Собрать до 1,0 х 10 7 культивируемых клеток в 15 мл коническую трубку, центрифуги при 300 мкг в течение 5 мин и сливают надосадочную жидкость.
    2. Промыть 10 мл PBS для удаления остаточного белка из коллекции клеточных сред. Повторите шаг центрифугирования и декантируют супернатант.
    3. Ресуспендируют осадок клеток в остаточного объема после декантации (около 100 мкл).
    4. Осторожно добавьте 800 мкл комнатной температуре 0,1% (2x) трипсина-ЭДТА в клетки. Не включать медленно под углом 45 ° вниз по боковой стороне коническую трубку.
    5. Закройте трубку и осторожно перемешать, наклоняя трубку так, жидкость проходит по длине трубки 5-6 разс. Волокнистые, белый осадок, могут образовывать в растворе. Ограничьте время трипсинизации в рамках мин.
    6. Гасят реакцию трипсином с 1 мл холодного FCS. Развести FCS сразу же путем добавления 10 мл холодной PBS.
    7. Центрифуга при 300 мкг в течение 5 мин при 4 ° С, затем декантируют супернатант и возврата трубки в лед.
  2. Фиксация
    1. Ресуспендируют клеток в остаточного объема после декантации. Если необходимо, довести объем до 100 мкл с холодным PBS.
    2. В вытяжном шкафу, добавить 800 мкл 10% нейтральном формалине с буфером раствора к клеткам и пипетки вверх и вниз. Трубка будет нагреваться при добавлении формалина. Инкубируют при 37 ° С в течение 10 мин.
  3. Пермеабилизирующего
    1. Настройка настольный вихревой смеситель на осторожном встряхивании скорости.
    2. Draw 9 мл холодной (-20 ° C) метанола в 10 мл серологической пипеткой.
    3. Держите пробирку, содержащую клетки на вихревом смесителе и осторожно начать Шакинг клетки.
    4. Добавить холодным метанолом в трубе, так что по капле падает на клетках в то время как трубка все еще встряхивания, так что метанол непрерывном перемешивании. После первых 2 мл метанола скорость дозирования может быть увеличена в медленном потоке.
    5. Пусть трубка сидеть на льду в течение 30 мин, чтобы завершить пермеабилизации. Кроме того, эти клетки могут храниться при температуре -20 ° С в течение месяца.

4. флуоресценции окрашивания для IgG1 и IgE класса Переключение

  1. Центрифуга образца при 300 мкг в течение 5 мин и декантируют раствора метанола. Белый осадок может гранул с клетками.
  2. Добавить 10 мл комнатной температуре 1x PBS и центрифуге при 300 мкг в течение 5 мин, чтобы вымыть клетки. Повторить один раз. Примечание: Промывка осадка с водой комнатной температуры PBS растворяется дополнительный осадок, который может образоваться после шага 4.1.
  3. Выполнение дополнительного Промыть 10 мл 2% FCS FACS буфера.
  4. Распределить образцы в 96-луночных круглодонных пластиныи центрифуге при 300 х г в течение 5 мин. Слейте супернатант и поставил тарелку на льду.
  5. Пятно в 60 мкл 2% FCS FACS буфера на лунку со следующими антител разведений: Анти-IgM НПП / Cy7, 1: 200, анти-IgG1 ПЭ, 1: 600, анти-IgE FITC, 1: 100, Anti- CD45R (B220) PerCP-Cy5.5, 1: 200
  6. Через 5 мин окрашивания, промыть пластины с 150 мкл 2% FCS, буфер-FACS и центрифуги в течение 5 мин при 300 х г.
  7. Ресуспендируют в 400 мкл 2% FCS, буфер-FACS и пипеткой через сито нейлона клеток 40 мкм в 5 мл FACS трубы.

5. Используйте следующие Gating стратегии:

  1. Изолировать CD45R (B220) положительных клеток из популяции взрывных лимфоцитов, расположенной на FSC / SSC участка (рис 1).
  2. Из B220 положительных клеток, используйте IgE и IgG1 заговор с целью выявить соответствующие группы населения.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Эта процедура была успешно реализована для изучения КСО IgE у мышей В-клеток. Чтобы продемонстрировать эффективность при измерении CSR, мы стимулировали мыши В-клетки селезенки с анти-CD40 и IL-4, как описано выше 11. Через пять дней после стимуляции, клетки были собраны и обработаны с использованием протокола, описанного выше и окрашивали флуоресцентно-меченного IgM, IgG1, IgE и В220 (CD45R) антител. Комплекс закрытого типа на взрывных лимфоцитов (рис 1), очевидно, население IgE + клеток не ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Стимуляция мыши селезенки В-клеток в культуре с анти-CD40 и IL-4 будет имитировать Т-хелперов 2-го типа (T H 2) взаимодействие, поощрение переключение класса для IgG1 и IgE 5. В-клетки могут быть активированы для КСО в контексте общего спленоцитов 12 или в очищенных В-клеток селезенки 11. Как отмечено в протоколе (этап 2.3), обогащение В-клеток не является обязательным, и, по усмотрению экспериментатора, чтобы определить, было бы полезно. Положительный магнитной сепарации В-кл...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не раскрывают информацию.

Благодарности

DRW поддерживается за счет грантов НИЗ AI089972 и AI113217, а также слизистой оболочки иммунологии исследований группы, и имеет награду карьеры для ученых-медиков из Wellcome Фонда Burroughs.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Антимышиный IgE FITCBD Pharmingen553415клон R35-72
Крыса Антимышиный IgG1 PEBD Pharmingen550083клон A85-1
МетанолBDHBDH1135-4LPДержать при -20 °°; C
Falcon Cell Sither 40 µ m НейлонCorning352340
Falcon Cell Sither 70 &микро; m НейлонCorning352350
Anti-Hu/Mo CD45R(B220) PerCP-Cy5.5eBioscience45-4052-82клон RA3-6B2
анти-мышь/крыса CD40eBioscience16-0402-85клон HM40-3
RPMI Medium 1640Gibco11875-093
HEPES (1M)Gibco15630-080
MEM-NEAA (100x)Gibco11140-050
Фосфатный буферный физиологический раствор (10x)Lifetechnologies (Corning)46-013-CM
MACS CD45R (B220) микрогранулы Miltenyi Biotec130-049-501
Очистительная колонна MACSMiltenyi Biotec130-042-401
IL-4PeproTech214-14Восстановите в воде или 0,1%
растворе формалина BSA, нейтральный буферизованный, 10%Sigma AldrichHT501128-4L
раствор трипсина-ЭДТА (10x)Sigma AldrichT4174-100 мл5,0 г трипсина, 2,0 г ЭДТА• 4 Na на литр 0,9% NaCl
пенициллин-стрептомицинSigma AldrichP0781-100 мл10 000 ЕД пенициллина; 10 мг/мл стрептомицина (100x)
L-глутамин 200 мМSigma AldrichG7513
2-меркаптоэтанол (99%)Sigma AldrichM6250-100 мл
Буфер для лизиса эритроцитовSigma AldrichR7757
Rat Anti-Mouse IgM RPE/Cy7SouthernBiotech1140-17клон 1B4B1
HyClone Fetal Calf SerumThermoSH30910.03
Среда для стимуляции В-клеток Среда для стимуляцииВ-клеток состоит из RPMI с эмбриональной сывороткой теленка (15%), 20 мМ HEPES, 1x MEM-NEAA, 2,0 мМ L-глутамина,   1x Пенициллин-стрептомицин (Пенициллин: 100 Ед/мл, Стрептомицин: 100 &; г/мл), бета-меркаптоэтанол (7 & микро; Л/Л), IL-4 (20 нг/мл) и анти-CD40 (1&микро; г/мл)

Ссылки

  1. Chaudhuri, J., et al. Evolution of the immunoglobulin heavy chain class switch recombination mechanism. Advances in immunology. 94, 157-214 (2007).
  2. Gould, H. J., Sutton, B. J. IgE in allergy and asthma today. Nature reviews. Immunology. 8, 205-217 (2008).
  3. Winter, W. E., Hardt, N. S., Fuhrman, S. Immunoglobulin E. Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 124 (9), 1382-1385 (2000).
  4. Ozcan, E., Notarangelo, L. D., Geha, R. S. Primary immune deficiencies with aberrant IgE production. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 122, 1054-1062 (2008).
  5. Bacharier, L. B., Geha, R. S. Molecular mechanisms of IgE regulation. The Journal of allergy and clinical immunology. 105, 547-558 (2000).
  6. Yokota, A., et al. Two species of human Fc epsilon receptor II (Fc epsilon RII/CD23): tissue-specific and IL-4-specific regulation of gene expression. Cell. 55 (4), 611-618 (1988).
  7. Boboila, C., et al. Alternative end-joining catalyzes class switch recombination in the absence of both Ku70 and DNA ligase 4. The Journal of experimental medicine. 207, 417-427 (2010).
  8. Nimmerjahn, F., Ravetch, J. Fcgamma receptors as regulators of immune responses. Nature reviews. Immunology. 8 (1), 34-47 (2008).
  9. Callen, E., et al. 53BP1 mediates productive and mutagenic DNA repair through distinct phosphoprotein interactions. Cell. 153 (6), 153-1280 (2013).
  10. Wesemann, D. R., et al. Reprogramming IgH isotype-switched B cells to functional-grade induced pluripotent stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (34), 13745-13750 (2012).
  11. Wesemann, D., et al. Immature B cells preferentially switch to IgE with increased direct Sµ to Sε recombination. The Journal of experimental medicine. 208 (13), 2733-2746 (2011).
  12. Zarrin, A. A., et al. An evolutionarily conserved target motif for immunoglobulin class-switch recombination. Nature immunology. 5, 1275-1281 (2004).
  13. Fan, G., et al. Development of a class-specific polyclonal antibody-based indirect competitive ELISA for detecting fluoroquinolone residues in milk. Journal of Zhejiang University. Science. B. 13 (7), 545-554 (2012).
  14. Perez, O., Krutzik, P., Nolan, G. Flow cytometric analysis of kinase signaling cascades. Methods in molecular biology (Clifton, N.J.). 263, Clifton, NJ. 67-94 (2004).
  15. Jamur, M., Oliver, C. Cell fixatives for immunostaining. Methods in molecular biology (Clifton, N.J.). 588, 55-61 (2010).
  16. Ishizaka, T., Ishizaka, K. Mechanisms of passive sensitization. IV. Dissociation of IgE molecules from basophil receptors at acid pH. Journal of immunology (Baltimore, MD. : 1950). 112 (3), 1078-1084 (1950).
  17. Erazo, A., et al. Unique Maturation Program of the IgE Response In Vivo. Immunity. 26, 191-203 (2007).
  18. Xiong, H., Dolpady, J., Wabl, M., Curotto de Lafaille, M. A., Lafaille, J. J. Sequential class switching is required for the generation of high affinity IgE antibodies. Journal of Experimental Medicine. 209, 353-364 (2012).
  19. Yang, Z., Sullivan, B., Allen, C. Fluorescent in vivo detection reveals that IgE(+) B cells are restrained by an intrinsic cell fate predisposition. Immunity. 36 (5), 857-872 (2012).
  20. Berkowska, M. A., et al. Human IgE(+) B cells are derived from T cell-dependent and T cell-independent pathways. The Journal of allergy and clinical immunology. , (2014).
  21. He, J. -S., et al. The distinctive germinal center phase of IgE+ B lymphocytes limits their contribution to the classical memory response. The Journal of experimental medicine. 210 (12), 2755-2771 (2013).
  22. Keegan, A., Fratazzi, C., Shopes, B., Baird, B., Conrad, D. Characterization of new rat anti-mouse IgE monoclonals and their use along with chimeric IgE to further define the site that interacts with Fc epsilon RII and Fc epsilon RI. Molecular immunology. 28 (10), 1149-1154 (1991).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

BIgEBIgEIgEB
Обнаружение Истинного IgE-выражения мышь B Lineage клеток
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.