Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

TIRFM и рН-чувствительные GFP-зонды для оценки нейромедиатора пузырька динамики в SH-SY5Y клеток нейробластомы: Сотовый изображений и анализ данных

10.6K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/52267

⸱

29 января 2015 г.

 ,  ,  ,  , 
1Department of Pharmacological and Biomolecular Sciences, Università degli Studi di Milano, 2San Raffaele Scientific Institute and Vita-Salute University, 3CEND Center of Excellence in Neurodegenerative Diseases, Università degli Studi di Milano

В этой статье

Краткое содержание

В этой статье представлен метод исследования динамики везикул нейротрансмиттеров в клетках нейробластомы с использованием конструкции синаптобревин2-pHluorin и флуоресцентной микроскопии полного внутреннего отражения. Также сообщается о разработанной стратегии обработки изображений и анализа данных.

Аннотация

Synaptic пузырьки выпустить нейротрансмиттеров на химических синапсов с помощью динамического цикла синтеза и поиска. Мониторинг синаптической активности в режиме реального времени и рассечения различные этапы экзо-эндоцитоза на уровне одного пузырька имеют решающее значение для понимания синаптические функции в норме и патологии.

Генетически кодируется рН-чувствительных датчиков, непосредственно направленные на синаптических пузырьков и полного внутреннего отражения флуоресцентной микроскопии (TIRFM) обеспечивают пространственно-временным разрешением необходимую для отслеживания динамики пузырьков. Мимолетны поле, создаваемое полного внутреннего отражения может только возбудить флуорофоров, размещенные в тонком слое (<150 нм) выше стеклянной крышкой, на которой клетки придерживаться именно там, где имеют место процессы экзо-эндоцитоза. В результате высокая контрастность изображения идеально подходит для пузырьков отслеживания и количественного анализа событий слияния.

В этом протоколе, SH-SY5Y человек пeuroblastoma клетки предлагаются в качестве полезной моделью для изучения высвобождение нейромедиаторов на уровне одного пузырька по TIRFM, из-за их плоской поверхности и в присутствии дисперсных пузырьков. Способы выращивания SH-SY5Y как адгезивные клетки, а также для трансфекции их synapto-pHluorin предоставляются, а также методики для выполнения TIRFM и визуализации. Наконец, стратегия стремится выбрать, рассчитывать и анализировать события в стиле фьюжн в уровнях цельноклеточных и одного пузырька представлены.

Для проверки метода анализа процедуры визуализации и передачи данных, динамика pHluorin-меченых везикул анализироваться в рамках отдыха и стимулировали (деполяризующими концентрации калия) условия. Деполяризацию мембраны увеличивает частоту событий слитых и вызывает параллельное повышение чистого сигнала флуоресценции, записанной в целой клетки. Анализ Single-пузырек показывает изменения поведения Fusion-событий (увеличение максимальной высоты и ширины). Эти данные свидетельствуют о йв деполяризации калия не только вызывает массовое освобождение нейромедиатора, но также изменяет механизм слияния пузырьков и утилизации отходов.

При соответствующей флуоресцентного зонда, эта техника может быть использована в различных клеточных системах рассекать механизмы конститутивной и стимулированную секрецию.

Введение

Химический синаптической передачи между нейронами является основным механизмом связи в нервной системе. Он опирается на высвобождение нейротрансмиттеров через динамический цикл слияния пузырьков и поиска в пресинаптической сайте. Многие из белков, участвующих в динамике везикулы были определены; Однако, их удельный вклад в феномен еще предстоит уточнить 1.

Наше понимание отчасти ограничена тем, что наиболее широко используемые тесты на экзо / эндоцитоза не всегда являются наиболее подходящим. Несколько исследований, связанных с слияния пузырьков и динамика полагаться на электрофизиологических методов. Эта техника обеспечивает оптимальную временное разрешение и отлично подходит для исследования начальной слияние везикул к плазматической мембране, но не в состоянии обнаружить многие из основных молекулярных событий, которые поддерживают пресинаптической функции. Электронная микроскопия, с другой стороны, обеспечивает лучшие morphologicaл описание каждой особой стадии, но в динамическом аспекте случае не может быть захвачен, потому что образцы должны быть установлены для того, чтобы анализировать.

Появление новых методов оптической записи 2,3, в сочетании с прогрессом в разработке флуоресцентного молекулярных зондов 4-6, обеспечивает визуализацию exocytic процессов в живых клетках, тем самым обеспечивая новый уровень информации о синаптической структуры и функции.

Первоначальные исследования эксплуатируемые деятельности зависит от стириловые красители (FM1-43 и связанные с ними органические красители) 7,8. Государство-оф-арт-методы визуализации использовать рН-чувствительных варианты зеленого флуоресцентного белка (GFP) (pHluorin) привязаны к просвете пузырьки белков 9. Эти датчики, как правило, выключается, когда присутствует в пузырьки из-за низкой просвета рН. После слияния с плазматической мембраной, внутренняя пузырьков подвергается нейтральной внеклеточном пространстве, рН резко возрастает, снимает протонов в зависимости от тушения pHluorin и быстро появляется флуоресцентный сигнал. Как изменения в pHluorin быстрее, чем событие слияния, путем мониторинга флуоресценции возрастает, слияния пузырьков с мембраной могут быть измерены и проанализированы. Поскольку поверхность pHluorin с метками молекулы эндоцитарных, сигнал флуоресценции затем возвращается к исходному уровню, поэтому в тот же конструкция может быть использована также для мониторинга пузырек рециркуляции 9.

В то время как пузырек с метками pH-сенсор обеспечивает визуализацию только тех пузырьки, которые действительно сливаются с плазматической мембраной, изображения с высоким пространственным и временным разрешением требуется описать в деталях этапы экзо / эндоцитических процессов. Оптический метод, который обеспечивает необходимую пространственно-временное разрешение полного внутреннего отражения флуоресцентной микроскопии (TIRFM), применение флуоресцентной микроскопии 10.

"> Полное внутреннее отражение происходит на границе раздела между стеклом покровным стеклом и образцом. При светлый путь достигает стеклянной крышкой скольжения с углом падения большим, чем критический угол, свет возбуждения не передается в образце, но полностью отражается обратно. В этих условиях, затухающих световой волны формы на границе и распространяется в среде с меньшим оптической плотности (образца). Как интенсивность исчезающего поля убывает экспоненциально с расстоянием от границы (с глубиной проникновения 100 нм) только флуорофоров в непосредственной близости к покровным стеклом могут быть возбуждены в то время как еще дальше от границы нет. В клетках, трансфицированных GFP-конструкций, эта глубина соответствует белков, экспрессированных на плазматической мембране или в везикулярных структур приближается к нему. Как флуорофоры в внутрь клетки не могут быть возбуждены, фон флуоресценции сведено к минимуму, и изображение с очень высоким отношением сигнал / фон крысыIO формируется 11.

Несколько характеристики делают TIRFM методом выбора для контроля везикулы динамику. Идеальный контраст и высокое отношение сигнал-шум-отношение позволяют обнаруживать очень низких сигналов, возникающих из единичных пузырьков. Чип на основе захвата изображения в каждом кадре обеспечивает временное разрешение, необходимое для обнаружения очень динамичные процессы. Наконец, минимальное воздействие клеток к свету в любой другой плоскости образца, резко снижает фототоксичность и позволяет длительное время покадровой записи 12.

Анализ данных остается наиболее сложной и важным аспектом этой техники. Самый простой способ для контроля слияния пузырьков состоит в измерении накопления репортера флуоресцирующих белков на поверхности клетки, с течением времени 13. Как синтеза увеличивается, чистое увеличение сигнала флуоресценции, а также. Тем не менее, этот метод может недооценивать процесс, особенно в больших клетках, и в состоянии покоя условий,потому что эндоцитоза и Фотообесцвечивания процессы компенсировать увеличение интенсивности флуоресценции от пузырьков экзоцитоза. Альтернативным методом является следовать каждый отдельный случай слияния 14. Этот последний метод является очень чувствительным и может раскрыть важные данные о механизмах синтеза. Тем не менее, он требует ручной выбор отдельных событий, потому что полностью автоматизированные процедуры, чтобы следовать пузырьки и зарегистрировать колебания их флуоресцентных сигналов не всегда доступны. Наблюдение динамики пузырька требуется клетки Отбор проб на высокой частоте. Это приводит к большой объем данных, которые практически не могут быть проанализированы вручную.

Предложение данной работы является оптимизация технику отображения TIRFM для мониторинга базальной и стимулированной высвобождения нейромедиаторов в нейробластомы клеточной линии SH-5YSY, и описать, шаг за шагом, процедура разработана в лаборатории для анализа данных, как на уровне целых клеток и одного пузырька.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Культивирование и трансфекция клеток

  1. Культура клеток SH-SY5Y
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эксперименты проводились с использованием нейробластомы человека SH-SY5Y (ATCC# CRL-2266)15. Клетки SH-SY5Y растут как смесь плавающих кластеров и адгезивных клеток. Следуйте инструкциям, указанным в протоколе (плотность клеток, коэффициент расщепления и т. д.), чтобы клетки, которые растут, прочно прикреплялись к стеклянной крышке, что имеет решающее значение для TIRFM.
    1. Перед началом работы, под ламинарным проточным шкафом биобезопасности, вносят своевременный объем стерильного фосфатного буферного солевого раствора (ПБС) и питательной среды.
      1. Внесите 50 мл PBS с концентрацией 150 мМ NaCl, 24 мМ фосфатного буфера, pH 7,4. Отфильтруйте раствор.
      2. Приготовьте 50 мл клеточной среды из модифицированной Eagle среды (DMEM) Дульбекко с высоким содержанием глюкозы, 10% инактивированной при нагревании фетальной бычьей сыворотки (FBS), пенициллина (100 ЕД/мл), стрептомицина (100 мкг/мл), L-глутамина (2 мМ) и пирувата натрия (1 мМ). Отфильтруйте раствор.
    2. Удалите полную питательную среду и промойте клетки 3 мл PBS.
    3. Инкубировать клетки с 2 мл 0,05% трипсин-этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) (для чашки Петри 6 см) в течение 5 мин при 37 °C, 5% CO2 и отделить клетки с помощью пипетки.
    4. Инактивируйте трипсин, добавив 2 мл DMEM, и соберите клетки центрифугированием при 300 x g в течение 5 минут.
    5. Удалите надосадочную жидкость, добавьте 1 мл DMEM в гранулу и пипеткой распыляйте раствор вверх и вниз в достаточной степени, чтобы рассеять клетки в одноклеточную суспензию.
    6. Разделите их в соотношении 1:4 в новой чашке Петри диаметром 6 см, содержащей 3 мл готовой среды. Поддерживайте клетки в культуре в чашках Петри диаметром 6 см при температуре 37 °C в инкубаторе с 5% содержаниемCO2. Субкультуры раз в неделю или когда они покроют 80 - 90% площади поверхности.
  2. Покрытие ячеек SH-SY5Y для визуализации
    1. Для экспериментов TIRFM пластины помещают ячейки на стеклянные крышки. Используйте стеклянные крышки толщиной от 0,17 ± 0,005 мм и показателем преломления 1,5255 ± 0,00015. Прежде чем начать, подготовьте стеклянные покровные стекла следующим образом:
      1. Чистые стеклянные крышки с 90% этанолом, O/N.
      2. Тщательно промойте их в дистиллированной воде (три смены дистиллированной воды). Высушите стеклянные крышки в сушильном шкафу.
      3. Поместите крышки в стеклянные чашки Петри и стерилизуйте в разогретой духовке при 200 °C в течение 3 часов.
    2. За день до трансфекции поместите каждый покровный лист в чашку Петри высотой 3,5 см, добавьте 1 мл питательной среды и инкубируйте при температуре 37 °С в инкубаторе с 5% содержаниемСО2.
    3. Трипсинизируйте клетки, как описано в шагах 1.1.3 - 1.1.5, суспендируйте клеточную гранулу в 1 мл готовой среды и подсчитайте. Рассчитайте правильный объем клеточной суспензии для добавления в каждую чашку Петри, чтобы получить 3 x 105 клеток на лунку. Такая плотность необходима для оптимального роста клеток и эффективной трансфекции. Инкубировать при 37 °C в инкубаторе с 5%CO2 O/N.
  3. SH-SY5Ytransfection полиэтиленимином (PEI)
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для визуализации динамики синаптических везикул был использован вектор pCB6, содержащий синапто-pHluorin. Синапто-pHluorin был получен путем слияния pH-чувствительного варианта зеленого флуоресцентного белка (GFP)16 и белка везикулярной мембраны синаптобревина 2. Эта конструкция широко использовалась для исследования свойств синаптических везикул в нейронах9.
    1. Перед началом трансфекции сделайте 10 мл следующих растворов. Держите растворы не более 1 месяца.
      1. Приготовьте раствор NaCl с концентрацией 150 мМ. Отрегулируйте pH до 5,5 с 0,01 Н HCl.
      2. Приготовьте раствор PEI в концентрации 10% полиэтиленимина (PEI; линейный 25 кДа) в 150 мМ растворе NaCl. pH раствора повышается до 8,8. Отрегулируйте pH до 7,8 с помощью 0,01 Н HCl.
    2. Через 24 часа после нанесения средства удалите средство и освежите 1,5 мл готового средства. Камеры должны содержаться при температуре 37 °C в инкубаторе с 5% содержаниемCO2.
    3. Под ламинарным проточным шкафом биобезопасности, в пробирку с микрофугой объемом 1,5 мл, добавьте 3 мкг плазмидной ДНК на 25 мкл 150 мМ раствора NaCl и 100 мкл раствора PEI на 3,5 см чашки Петри.
    4. Сделайте вихрь в течение 10 секунд, затем инкубируйте смесь ДНК/ПЭИ в течение 30 минут при RT.
    5. Осторожно добавьте смесь ДНК/ПЭИ в чашку Петри, содержащую покровные листы с клетками, и осторожно встряхните, чтобы равномерно распределить реагент в чашке Петри.
    6. Через 4 ч смените среду и инкубируйте клетки О/Н при 37 °С в инкубаторе с 5% содержаниемСО2. Проводите визуализирующие эксперименты через 24 - 48 часов после трансфекции.

2. Визуализация клеток с помощью флуоресцентной микроскопии полного внутреннего отражения (TIRFM)

  1. Настройка визуализации
    1. Выполните визуализацию TIRF с конфигурацией, описанной на рисунке 1. Он состоит из моторизованного инвертированного микроскопа (рис. 1, врезка А), источника лазера (рис. 1, врезка В) и TIRF-слайдера (рис. 1, врезка С). Достигайте освещенности TIRFM через высокую числовую апертуру (NA 1.45 Alpha Plan-Fluar) 100X масляный, иммерсионный объектив.
    2. Для подсветки TIRFM используйте многолинейный (458/488/514 нм) аргон-ионный лазер мощностью 100 мВт. Используя мономодовое волокно, введите линейно поляризованный лазерный свет в траекторию луча с помощью ползунка TIRF. Вставьте ползунок TIRF в плоскость диафрагмы светового поля пути отраженного светового луча.
      1. Для широкоугольного освещения подключите микроскоп к обычной ртутной короткодуговой лампе HBO белого света. Двойная призма с сохранением поляризации в ползунке обеспечивает одновременное сочетание освещения TIRF и белого света.
    3. Фильтруйте лазерный свет с помощью возбуждающего фильтра (ширина полосы 488/10 нм), установленного на фильтрующем колесе, введенном в лазерный тракт. Используйте высокоскоростной затвор с программным управлением, чтобы обеспечить быстрое управление лазерным освещением. Для анализа pHluorin установите полосовой фильтр излучения 525/50 нм. Снимайте цифровые изображения (512 x 512 пикселей) на охлаждаемую быструю ПЗС-камеру с помощью программного обеспечения Image ProPlus.
  2. Достижение освещенности TIRF (Рисунок 2)
    1. Включите лазеры, компьютер, камеру, колесо фильтров и контроллеры затвора, а затем подождите 20 минут, прежде чем начать эксперимент, пока лазеры должны нагреться и стабилизироваться.
    2. Перед проведением визуализации сделайте подходящий объем следующих растворов.
      1. Приготовьте 50 мл раствора Кребса (KRH) в дозе 125 мМ NaCl, 5 мМ KCl, 1,2 мМ MgSO4, 1,2 мМ KH2PO4, 25 мМ 4-(2-гидроксиэтил)пиперазина-1-этансульфоновой кислоты (HEPES) (буферизованной до pH 7,4), 2 мМ CaCl2 и 6 мМ глюкозы.
      2. Приготовьте 10 мл раствора KCl-KRH (pH 7,4) при концентрации 80 мМ NaCl, 50 мМ KCl, 1,2 мМ MgSO4, 1,2 мМ KH2PO4, 25 мМ HEPES (буферизованного до pH 7,4), 2 мМ CaCl2 и 6 мМ глюкозы.
    3. Снимите стеклянную крышку с трансфицированными клетками и вставьте ее в соответствующую камеру визуализации. Соберите камеру и добавьте 500 μл раствора KRH в центр стакана.
    4. Добавьте масло поверх цели. Поместите камеру визуализации на предметное столико микроскопа и расположите объектив под стеклянным покровным стеклом. Накройте образец крышкой сейфа.
    5. В режиме эпифлуоресценции сосредоточьтесь на покровном стекле (верхней поверхности) и выберите трансфицированные клетки, помещенные в центр камеры. Выберите ячейки, флуоресцентный сигнал которых может быть четко зарегистрирован при времени экспозиции менее 80 мс.
    6. Под программным управлением переключитесь на подсветку TIRF в режиме реального времени.
    7. Чтобы настроить конфигурацию TIRF, проверьте положение луча, выходящего из объектива, на крышке образца (рис. 2B). Когда луч расположен в центре линзы объектива (рис. 2A, слева), в центре крышки образца TIRF виднеется пятно (рис. 2B, слева), и ячейка визуализируется в режиме эпифлуоресценции (несколько фокусных плоскостей, высокая фоновая флуоресценция; Рисунок 2C, слева).
    8. Чтобы достичь критического угла, переместите сфокусированное пятно в направлении Y (вперед или назад; Рисунок 2B, в центре) с помощью винта регулировки угла наклона на ползунке TIRF (рисунок 1C). Когда луч сходится на плоскости образца под углом, превышающим критический угол (рис. 2A, справа), пятно исчезает, и в середине крышки образца видна прямая тонкая сфокусированная линия (рис. 2B, справа).
    9. Для точной настройки угла TIRF используйте образец ячейки (Рисунок 2C). Посмотрите флуоресцентное изображение на видео, на этом этапе все еще видно эпифлуоресцентное изображение. Осторожно перемещайте винт до тех пор, пока не будет достигнуто условие TIRF: в фокусе находится только одна оптическая плоскость ячейки (т. е. плазматическая мембрана, контактирующая с покровным скольжением), в результате чего получается плоское изображение с высокой контрастностью (рис. 2C, справа).
  3. Визуализация образцов
    1. Задайте эксперимент с одноканальной интервальной съемкой. Чтобы свести к минимуму фотообесцвечивание, сделайте снимок с малым временем экспозиции и высоким коэффициентом усиления. Соответствующее время экспозиции составляет от 40 до 80 мс. Получение изображений с частотой дискретизации 1–2 Гц. Кинетика везикул может быть лучше оценена при выборке на более высокой частоте (10 Гц). Обычное время наблюдения обычно составляет 2 минуты.
    2. Добавьте 500 μл раствора KRH и записывайте ячейки в режиме TIRFM. Это состояние покоя. Экономьте время на создании последовательных изображений.
    3. Фокусируйтесь на той же клетке и записывайте при одинаковых условиях покоя (мощность лазера, время экспозиции, номер кадра). После пяти кадров добавьте 500 μл раствора KCl-KRH и держите KCl в камере. Это стимулированное состояние; Экономьте время на последовательных изображениях.

3. Анализ изображений и обработка данных

ПРИМЕЧАНИЕ: Для анализа изображений в лаборатории были разработаны макросы, основанные на существующих функциях программного обеспечения для анализа изображений; аналогичные макросы доступны в Интернете (URL приведен в Таблице материалов и оборудования).

  1. Количественное определение интенсивности флуоресценции
    1. Используйте макрос «Интенсивность флуоресценции последовательности» для количественной оценки интенсивности флуоресценции в области интереса (ROI) изображения на протяжении всего фильма.
    2. Откройте изображения с временной последовательностью. Перейдите в макроменю и выберите «Интенсивность флуоресценции последовательности». В окне «Анализ» появится кнопка «Выберите ROI».
    3. Выберите один из инструментов выбора в меню, чтобы создать ROI. Поместите 3 ROI в области клеточной мембраны без пятен (background ROI). Используйте этот «фоновый ROI» для оценки фотообесцвечивания и установки порогового значения для анализа событий термоядерного синтеза (рис. 3A).
  2. Коррекция фотообесцвечивания и определение пороговых значений (рис. 3B)
    1. Чтобы оценить фотообесцвечивание, откройте строки интенсивности флуоресценции "background ROIs", (рисунок 3Ba). Нормализуйте значения интенсивности флуоресценции в каждом кадре до начального значения интенсивности (F0) (F/F0) (Рисунок 3Bb). Усредняем значения.
    2. Выделите средние данные и создайте линейный график с помощью пунктов меню диаграммы.
    3. В меню анализа данных выберите «линия тренда», чтобы открыть диалоговое окно анализа графика. Выберите тип регрессии. Установите "экспоненциальную" регрессию. Затем выберите "отобразить уравнение на графике". В окне графика отображается экспоненциальное уравнение, и значения параметров назначаются автоматически (Рисунок 3Bc).
    4. Примените экспоненциальную поправку к значениям интенсивности в каждом кадре следующим образом:
      Fn (исправлено) = Fn / exp(-n * a)
      Fn = экспериментальная интенсивность флуоресценции, измеренная в системе координат n; n = количество кадров; a = коэффициент обесцвечивания (постоянный, выражающий скорость снижения интенсивности в результате фотообесцвечивания;Рисунок 3Bd).
    5. Чтобы задать порог, откройте нормализованный и скорректированный "фоновый ROI", рассчитайте средний сигнал флуоресценции и его стандартное отклонение (SD). Среднее значение плюс 3 SD представляет пороговое значение (рис. 3Be). Используйте этот порог для анализа данных.
  3. Выбор событий слияния с помощью полуавтоматической процедуры
    1. Открывайте изображения с временной последовательностью с помощью программного обеспечения для анализа изображений. Примените фильтр Гаусса к активной последовательности изображений.
    2. Анализируйте изображения с помощью инструмента «подсчет объектов» или макроса, который позволяет выбрать объект, пиксели которого имеют среднюю интенсивность флуоресценции в заданном диапазоне. Установите диапазон интенсивности вручную, с помощью функции порога (перейдите в меню бара, установите меру → порог, чтобы выделить интересующую область). Адекватным порогом является 30% от локального флуоресцентного фонового сигнала.
    3. Примените макрос "Фильтры объектов", чтобы выбрать только объекты, удовлетворяющие следующим критериям:
      1. Примените опцию диапазонов (минимум и максимум включительно) для экспозиции. Aspect показывает соотношение между большой осью и малой осью эллипса, эквивалентного объекту. Аспект всегда равен ≥1. Адекватные значения: min = 1, max = 3.
      2. Примените диапазоны для диаметра. Диаметр представляет собой среднюю длину диаметров, измеренных с интервалом в два градуса, соединяющих две контурные точки и проходящих через центроид объекта. Установите диапазон в пикселях (или в μм, если используется калиброванная система).
      3. Определите оптимальный диапазон в предварительных экспериментах: выберите интересующие вас пятна вручную, а затем измерьте их диаметр с помощью функции построения профиля.
    4. Выберите "отобразить объекты": выбранные объекты будут наложены на изображение TIRFM (Рисунок 4B).
    5. Включайте в анализ только те пятна, которые демонстрируют кратковременное (от одного до трех кадров) переходное увеличение интенсивности флуоресценции, сразу за которым следует выраженная потеря сигнала (переходные пятна). Используйте круговое выделение для создания ROI диаметром примерно в одну точку радиально вокруг выбранной везикулы/пятен (экспериментальные ROI). Выполните этот шаг вручную.
    6. Выбрав ROI, рассчитайте среднюю интенсивность флуоресценции каждого ROI в течение фильма.
  4. Анализ данных (Рисунок 3C-D)
    1. Экспорт временного хода изменений флуоресценции, измеренных в каждом «экспериментальном ROI», в электронную таблицу; (Рисунок 3Da). Нормализуйте значение интенсивности в каждом кадре до начальной интенсивности флуоресценции (F/F0), (рис. 3Db).
    2. Примените экспоненциальную коррекцию к значениям интенсивности в каждом кадре, как указано на шаге 3.2.4 (рисунок 3Dc).
    3. Чтобы вычислить общее количество событий слияния (пиковое число), время каждого слияния (ширина пика) и амплитуду флуоресцентного пика (высоту пика и AUC) примените логические функции с помощью электронных таблиц или математических пакетов. Пример анализа событий слияния с использованием логических формул представлен на рисунках 3Dd и 3De.
      4. Предположим, что
    4. увеличение интенсивности флуоресценции превышает пороговое значение (средняя фоновая интенсивность флуоресценции ± 3SD) в виде слияния везикул с плазматической мембраной, а результирующий пик — в виде события слияния.
    5. Рассчитайте ширину пика как разницу между последним и первым значением x каждого пика. Умножьте это значение на 1 / (частота дискретизации). Рассматривайте эту величину как время слияния и адгезии везикул на плазматической мембране до повторного закисления и рециркуляции везикул (рис. 3Dd).
    6. Рассчитайте AUC всей ячейки как сумму значений сверх порогового значения. Рассматривайте эту величину как чистое флуоресцентное изменение во время записи из-за спонтанной (покоящейся) или вызванной (стимулированной) синаптической активности.
    7. Вычислите высоту пика как разницу между максимальным значением y каждого пика и пороговым значением. Рассматривайте это значение как ориентирующее на тип термоядерного синтеза (одиночный против одновременного/последовательного синтеза или переходный против полного синтеза).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Описанные процедуры TIRF-визуализации и анализа данных предназначены для изучения динамики везикул в клеточных системах. Этот метод может быть использован для определения влияния сигнальных молекул и лекарственных препаратов на процессы слияния и динамику нейромедиаторных везикул17. С использованием белков плазматической мембраны с GFP-меткой анализ методом TIRFM применялся для характеристики конститутивного транспорта GFP-меченных транспортеров глутамата в глиальных и эпителиальных клетках18,19.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

В данной работе представлен протокол визуализации и анализа динамики везикул в секретирующих клетках с использованием флуоресцентных кДНК-кодируемых векторов и TIRFM. Ключевыми элементами успешной визуализации с помощью TIRFM являются выбор клеточной модели и трансфекция клеток с генетически закодированными оптическими индикаторами высвобождения и переработки везикул.

TIRFM идеально подходит для выращивания клеток, прилегающих к стеклянной крышке и достаточно плоских, чтобы обеспечить стабильн...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

Авторы хотели бы выразить признательность Università degli Studi di Milano за поддержку Элиане Ди Кайрано (стипендия постдокторантуры) и Стефании Моретти (стипендия доктора философии). Эта работа была поддержана университетской исследовательской программой PUR to C.P.

Мы хотели бы поблагодарить профессора Джереми М. Хенли, Школа биохимии, Бристольский университет, Великобритания, за конструкцию pHluorin, а также доктора Дотти Франческо за помощь в анализе данных, а также Сильвию Марсикано за техническую помощь.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Оборудование
Axio Observer Z1figure-materials-1 Zeiss491912-9850-000инвертированный микроскоп
Multiline Argon Laser Lasos 77figure-materials-2 Lasos00000-1312-752многолинейный (458/488/514 nm), 100 mW аргоновый ионный лазер
Laser TIRF sliderfigure-materials-3 Zeiss423681-9901-000
Объектив 100Xfigure-materials-4 Zeiss421190-9900-000Иммерсионный, NA 1.45 Alpha-Plan
CCD-камера RetigaSRV Fast 1394figure-materials-5 QImaging
Оптический переключатель фильтров LAMBDA 10-3 с SmartShutterfigure-materials-6 Sutter Instrument Company
Программное обеспечение
ПО Image ProPlus 6.3figure-materials-7 Media Cyberneticsвыбор точек, выбор ROI, определение интенсивности флуоресценции
Excelfigure-materials-8 Microsoftкоррекция фотовыгорания, анализ всей клетки и отдельных везикул
GraphPad Prism 4.00figure-materials-9 GraphPad Software, Inc.статистический анализ

Ссылки

  1. Sudhof, T. C. The synaptic vesicle cycle. Annu. Rev. Neurosci. 27, 509-547 (1146).
  2. Denk, W., Svoboda, K. Photon upmanship: why multiphoton imaging is more than a gimmick. Neuron. 18 (3), 351-357 (1997).
  3. Helmchen, F., Svoboda, K., Denk, W., Tank, D. W. In vivo dendritic calcium dynamics in deep-layer cortical pyramidal neurons. Nat Neurosci. 2 (11), 989-996 (1999).
  4. Tsien, R. Y. The green fluorescent protein. Annu Rev Biochem. 67, 509-544 (1998).
  5. Matz, M. V., et al. Fluorescent proteins from non bioluminescent Anthozoa species. Nat Biotechnol. 17 (10), 969-9673 (1999).
  6. Ribchester, R. R., Mao, F., Betz, W. J. Optical measurements of activity-dependent membrane recycling in motor nerve terminals of mammalian skeletal muscle. Proc Biol Sci. 255 (1342), 61-66 (1994).
  7. Polo-Parada, L., Bose, C. M., Landmesser, L. T. Alterations in transmission, vesicle dynamics, and transmitter release machinery at NCAM-deficient neuromuscular junctions. Neuron. 32 (5), 815-828 (2001).
  8. Gaffield, M. A., Betz, W. J. Imaging synaptic vesicle exocytosis and endocytosis with FM dyes. Nat Protoc. 1 (6), 2916-2921 (2006).
  9. Miesenböck, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).
  10. Axelrod, D. Total internal reflection fluorescence microscopy. Methods Cell. Biol. 89, 169-221 (2008).
  11. Sankaranarayanan, S., De Angelis, D., Rothman, J. E., Ryan, T. A. The Use of pHluorins for Optical Measurements of Presynaptic Activity. Biophys. J. 79, 2199-2208 (2000).
  12. Mattheyses, A. L., Simon, S. M., Rappoport, J. Z. Imaging with total internal reflection fluorescence microscopy for the cell biologist. J. Cell Sci. 123, 3621-3628 (2010).
  13. Wyatt, R. M. Balice-Gordon R.J. Heterogeneity in Synaptic Vesicle Release at Neuromuscular Synapses of Mice Expressing SynaptopHluorin. J. Neurosci. 28 (1), 325-335 (2008).
  14. Tsuboi, T., Rutter, G. A. Multiple forms of "kiss-and-run" exocytosis revealed by evanescent wave microscopy. Curr Biol. 13, 563-567 (2003).
  15. Miloso, M., et al. Retinoic Acid-Induced Neuritogenesis of Human Neuroblastoma SH-SY5Y Cells Is ERK Independent and PKC Dependent. J. Neurosci. Res. 75, 241-252 (2004).
  16. Jaskolski, F., Mayo-Martin, B., Jane, D., Henley, J. M. Dynamin-dependent Membrane Drift Recruits AMPA Receptors to Dendritic Spines. J Biol Chem. 284 (18), 12491-12503 (2009).
  17. Treccani, G., et al. Stress and corticosterone rapidly increase the readily releasable pool of glutamate vesicles in synaptic terminals of prefrontal and frontal cortex. Mol Psychiatry. 19 (4), 433-443 (1038).
  18. D'Amico, A., et al. The surface density of the glutamate transporter EAAC1 is controlled by interactions with PDZK1 and AP2 adaptor complexes. Traffic. 11 (11), 1455-1470 (2010).
  19. Perego, C., Di Cairano, E. S., Ballabio, M., Magnaghi, V. Neurosteroid allopregnanolone regulates EAAC1-mediated glutamate uptake and triggers actin changes in Schwann cells. J Cell Physiol. 227 (4), 1740-1751 (2012).
  20. Bergeron, A., Pucci, L., Bezzi, P., Regazzi, R. Analysis of synaptic-like microvesicles exocytosis of B-cells using a live imaging technique. PlosOne. 9, e87758(2014).
  21. Encinas, M., et al. Sequential treatment of SH-Sy5Y cells with retinoic acid and brain-derived neurotrophic factor gives rise to fully differentiated, neutrophic factor-dependent, human neuron-like cells. J. Neurochem. 75 (3), 991-1003 (2000).
  22. Kume, T., et al. Dibutyryl cyclic AMP induces differentiation of human neuroblastoma SH-SY5Y cells into a noradrenergic phenotype. Neurosci Lett. 443 (3), 199-203 (2008).
  23. Diaspro, A., Chirico, G., Usai, C., Ramoino, P., Dobrucki, J. Photobleaching. Handbook of Biological Confocal Microscopy. Pawley, J. B. , Springer-Verlag New York, Inc.. New York. 690-699 (2006).
  24. Rossano, A. J., Chouhan, A. K., Macleod, G. M. Genetically encoded pH-indicators reveal activity-dependent cytosolic acidification of Drosophila motor nerve termini in vivo. J Physiol. 591 (7), 1691-1706 (2013).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Флуоресцентная микроскопия полного внутреннего отражениятрансфекция Synapto-pHluorinанализ слияния везикулколичественное определение интенсивности флуоресценциитрекинг отдельных везикулстимуляция калиевой деполяризацией
TIRFM и рН-чувствительные GFP-зонды для оценки нейромедиатора пузырька динамики в SH-SY5Y клеток нейробластомы: Сотовый изображений и анализ данных
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.