Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Глутамат и гипоксии как стресс модель для изолированных перфузируемые сетчатки позвоночных

7.3K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/52270

⸱

22 марта 2015 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Centre for Ophthalmology, University Eye Hospital Tübingen

В этой статье

Краткое содержание

Благодаря этому исследованию, введем стандартную модель стресс для изолированной орошали сетчаткой крупного рогатого скота для дальнейшего доклинического терапевтического тестирования. Эффект либо гипоксии (чистый N 2) или глутамата стресса (250 мкМ глютамата) на функции сетчатки, представленного A- и B-волновых амплитуд оценивали.

Аннотация

Нейропротекция была сильное поле исследования в офтальмологии исследований в последние десятилетия и влияет на такие заболевания, как глаукома, сетчатки окклюзии сосудов, отслоение сетчатки, и диабетической ретинопатии. Это было предметом этого исследования, чтобы ввести стандартную модель стресс для будущей доклинических терапевтических испытаний.

Бычьи сетчатки были подготовлены и перфузии раствором стандартной кислорода насыщенным, и ЭРГ регистрировали. После записи стабильные би-волны, гипоксия (чистый N 2) или глутамата напряжения (250 мкм глутамата) было оказано в течение 45 мин. Для исследования влияния на функцию фоторецепторов только, 1 мМ аспартата был добавлен, чтобы получить-волны. ERG-восстановление следили в течение 75 мин.

Для гипоксии, снижение в волны амплитудой 87,0% было отмечено (р <0,01) после времени экспозиции 45 мин (уменьшение на 36,5% после окончания вымывания р = 0,03). Кроме того, начальная ОВЦСлегкость в B-волновых амплитуд 87,23% было зафиксировано, что достигнуто статистической значимости (P <0,01, снижение на 25,5% в конце размыва, р = 0,03).

Для 250 мкм глутамата, начального снижения амплитуд (р> 0,05), а затем снижением на 1,9% (р> 0,05) 7,8%. Снижение на 83,7% В-волновых амплитуд (р <0,01) отмечено; после смыва 75 мин снижение составило 2,3% (р = 0,62). В этом исследовании, стандартизированная модель стресс представлен которые могут быть полезны для выявления возможных нейропротекторное действие в будущем.

Введение

Нейропротекция была сильное поле исследования в офтальмологии исследований в последние десятилетия. Сетчатка очень чувствительны нейронной сети, что существенно зависит от оксигенации и сильно влияет на метаболизм окружающих его клеток. Основные глазные патологии, связанные с нервно-паралитического повреждения клеток являются сосудов сетчатки окклюзии, глаукома, и отслойка сетчатки.

Окклюзии артерии сетчатки, в качестве примера для сосудов сетчатки окклюзии, приводит к внезапной потере зрения в результате гипоксии внутренней сетчатки 1. Это часто связано с общими сосудистыми патологиями 2 и приводит к постоянной потере зрения 1, только с 8% пациентов, восстанавливающихся остроты зрения значительно 1. Хотя артериальная фибринолиз был предложен в качестве варианта лечения, польза не может быть показано в рандомизированном клиническом испытании 3.

Глаукома и отслойка сетчаткиоба имеют повышение концентрации глутамата 4-6. Глутамат в физиологических условиях встречается в качестве возбуждающего передатчика в течение всей центральной нервной системы и внутренней сетчатки 7,8. Повышенные уровни глутамата были найдены не только при глаукоме и отслойке сетчатки 5,6, но и в пролиферативной диабетической ретинопатии 9. Увеличение глутамата, возможно, приводит к эксайтотоксичности и, следовательно, повреждение нервных клеток 10. В большинстве случаев отслойки сетчатки, а в некоторых случаях пролиферативной диабетической ретинопатии операции на сетчатке (Парс-Плана витрэктомии) являются необходимыми. Во время Парс-Плана витрэктомии механических манипуляций, яркий свет оптического волокна или напряжения сдвига, оказываемого высоких скоростях потока оросительных решений при длительных операциях оказывают дополнительную нагрузку на сетчатке 11,12.

Все перечисленные заболевания имеют в общем, что патология локализуется в Сетчаткав покое и поставить офтальмологическое сообщество с проблемой, чтобы найти способы, чтобы защитить сетчатку как нейросенсорной системы.

Электроретинограммы (ERG) является стандартным методом для оценки естественных функций в фоторецепторов (волны) и функции внутреннего сетчатки (B-волны). ERG измеряется серебряных электродов, введенных в роговицу и глаза стимулируются при повышении уровня освещенности для определения дефектов в прутках или конусов или во внутреннем сетчатки. Различные дефекты в сетчатке могут быть обнаружены изменения амплитуды (силы ответа) или время ожидания (время-ответ-интервала) ЭРГ. Различные протоколов и методы измерения ERG (шаблон ERG, мультифокальной-ERG или светлое поле ERG) позволяют дальнейшую дифференциацию дефектов. Методика изолированной сетчатки была введена недавно, что делает возможным оценить воздействие на сетчатке без помех, например, из исследования животногообщие реакции 13,14.

Это было целью данного исследования для оценки и ввести определенную и стандартную модель стресс для гипоксии и глутамата нагрузки на орошали изолированной сетчатки. Таким образом, мы надеемся заложить основы для будущих исследований по нейропротективных воздействия некоторых веществ или внутриглазных орошения решений.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Подготовка говяжьи глаза

  1. Получить крупного рогатого скота глаза сразу после животное забивают.
  2. Транспорт защищенные глаза "Sickel-решения" специальной средой, содержащей 120 мМ NaCl, 2 мМ KCl, 0,1 мМ MgCl 2, 0,15 мМ CaCl 2, 1,5 мМ NaH 2 PO 4, 13,5 мМ Na 2 HPO 4 и 5 мМ глюкозы в RT.
  3. Выполните подготовку сетчатки при недостаточном освещении, адаптированных условиях с тусклым красным светом.
  4. Снимите переднюю часть глаза. Выполните экваториальный разрез ок 4 мм кзади от лимба. После удаления роговицы, радужной оболочки, цилиарного тела и объектив в одной части. Держите сетчатки в Sickel-решения.
  5. Механически ослабить стекловидных вложений поверхности сетчатки и удалить стекловидное тело с открытой чашкой глаз.
  6. После разделить глаза на четыре квадранта и выбивать круглый областях около Диаметр 7 мм, используя трепана.
  7. Аккуратно отделить сетчаткуот пигментного эпителия и поместить его на устройстве записи внутри коробки, защищенном от света. Устройство записи состоит из пластикового сопровождающего с сеткой в ​​середине; разместить сетчатку на сетке, а затем закрепить с пластиковым кольцом, непосредственно на электродах.
    ПРИМЕЧАНИЕ: пластик сопровождающий имеет два канала, чтобы постоянный поток среды.

2. Запись электроретинограммы (ERG)

  1. Для того, чтобы записать электроретинограммы, использовать два серебро / хлорид электродов по обе стороны сетчатки и заливать сетчатку с постоянной скоростью перфузии около 1 мл / мин и постоянной температуре 37 ° С. Используйте "Sickel-решение", насыщенный кислородом.
  2. Перед началом измерения, темно адаптации сетчатки (защита от света во время всех измерений) и использовать по стимулированию каждые пять минут. Используйте 1 Гц одним белым ксеноновая вспышка для стимуляции с интенсивностью, установленной в 6,3 MLX на поверхности сетчатки.
  3. Использование откалиброван фильтры нейтральной плотности и легкий стимул 10 мкс, управляемый таймером, чтобы иметь оптимальные ответов.
  4. Для измерения и обработки данных, фильтр эрг и усиливать его (100 Гц фильтр высоких частот, 50 Гц режекторный фильтр, 100000 х усиление) с помощью RPS312RM усилитель траве. Попробуйте отфильтровать возможные тревожные частоты, которые могут нарушить сигнал. Для того, чтобы обрабатывать данные, используйте приобретения доска аналого-цифровых данных на настольном компьютере (ПК-совместимый).
  5. После темного периода адаптации под постоянным перфузии, измерения амплитуды электрического сигнала, пока стабильные б-амплитуды волн не записываются.
    ПРИМЕЧАНИЕ: амплитуды считается стабильным, если пять одиночных замеров достичь среднего значения и отклонения менее 10%. Хорошим примером одиночных измерений приведена на рисунке 1.
  6. Чтобы начать тестирование, заменить чистый кислород либо чистого азота (количество отдельных экспериментов, N = 5), чтобы проверить на гипоксиюили 250 мкм глутамата (N = 5).
  7. Запишите электрические ответов каждые 5 мин в течение 45 мин.
  8. После периода тестирования, заливать сетчатки со стандартным среде, насыщенной кислородом в течение 75 мин и посмотреть на изменения амплитуды B-волн. Это вымывание фаз. Измерьте амплитуду б-волны от корыта а-волны до пика Ь-волны.
  9. Для исследования влияния гипоксии или глутамата на фоторецепторов потенциала при скотопических условиях, подавляют б-волну, добавив 1 мм до питательного раствора.
  10. После записи стабильный фоторецепторов потенциал в течение 30 мин, проводить процедуру, как и прежде, подвергая сетчатки 45 мин с различными ирригационных растворов с 1 мМ аспартата. Используйте тот же период промывки (шаг 2,8), как уже упоминалось ранее.

3. Анализ данных

  1. Для того, чтобы статистически оценить данные, обеспечить нормальное распределение для всех данных, например, с помощью Колмогорова-СмирноваТест 15.
  2. Рассчитать снижение А- и В-волновых амплитуд в процентах после фазы экспозиции по сравнению с прошлым измерения до экспозиции. Сравните снижение ЭРГ-амплитуд через 45 мин - в конце периода экспозиции - к ЭРГ измеренного перед применением.
  3. Сравнение А- и В-волну в конце фазы выведения на соответствующей амплитуды до экспозиции, чтобы исследовать возможное восстановление.
  4. Для статистического анализа используют программное обеспечение JMP статистического программного обеспечения или программного обеспечения SPSS. Рассчитать данные в течение как среднее ± стандартное отклонение. Оцените значимость, соответствующей статистического анализа.
    Примечание: Эти тесты могут быть различными в зависимости от экспериментальной области. В этих условиях, использовать парного критерия Стьюдента Стьюдента.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

После 1 ч перфузии сетчатки препаратов с стандартного раствора насыщенного кислородом (рис 1А и В) эрг амплитуды наблюдалась стабилизация и меньше вариаций амплитуд между отдельными измерениями. рН, осмотическое давление, температура, и ПО 2 (для гипоксии испытаний, за исключением) были поддерживается постоянным для всех тестов.

Для выделения фоторецептора сигнал из сигнала внутреннего сетчатки, 1 мМ аспартата был добавлен в стандартном растворе для подавления б-волн...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

В этом исследовании было обнаружено значительное влияние на амплитуду б-волна за 45 мин гипоксии. Это сокращение было еще значимым после фазы выведения. Аналогичный эффект на потенциал фоторецептора можно было наблюдать.

Результаты поддерживаются другими опубликованными данными 16 и дают нам возможность изучить возможные нейропротекторное действие после гипоксии.

После 45 мин экспозиции 250 мкМ глютамата, мы нашли статистически значимое влияние только ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Эта статья посвящается моей любимой жене Марен и нашему маленькому Карлу.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
120 мМ NaCl Merck Pharma, Германия1,064,041,000
2 mM KCl,   Merck Pharma, Германия1,050,010,250
0,1 мМ MgCl2, Merck Pharma, Германия58,330,250
0,15 мМ CaCl2Merck Pharma, Германия111 TA106282
1,5 мМ NaH2PO4/13,5 мМ Na2HPO4   Merck Pharma, Германия1 065 860 500
5 мМ глюкозыMerck Pharma, Германия40 741 000

Ссылки

  1. Varma, D. D., Cugati, S., Lee, A. W., Chen, C. S. A review of central retinal artery occlusion: clinical presentation and management. Eye (Lond). 27, 688-697 (2013).
  2. Resch, M., Suveges, I., Nemeth, J. Hypertension-related eye disorders). Orv Hetil. 154, 1773-1780 (2013).
  3. Feltgen, N., et al. Multicenter study of the European Assessment Group for Lysis in the Eye (EAGLE) for the treatment of central retinal artery occlusion: design issues and implications. EAGLE Study report no. 1 : EAGLE Study report no. 1. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 244, 950-956 (2006).
  4. Dreyer, E. B., Zurakowski, D., Schumer, R. A., Podos, S. M., Lipton, S. A. Elevated glutamate levels in the vitreous body of humans and monkeys with glaucoma. Arch Ophthalmol. 114, 299-305 (1996).
  5. Bertram, K. M., et al. Amino-acid levels in subretinal and vitreous fluid of patients with retinal detachment. Eye (Lond). 22, 582-589 (2008).
  6. Diederen, R. M., et al. Increased glutamate levels in the vitreous of patients with retinal detachment). Exp Eye Res. 83, 45-50 (2006).
  7. Ientile, R., et al. Apoptosis and necrosis occurring in excitotoxic cell death in isolated chick embryo retina. J Neurochem. 79, 71-78 (2001).
  8. Mali, R. S., Cheng, M., Chintala, S. K. Plasminogen activators promote excitotoxicity-induced retinal damage. FASEB J. 19, 1280-1289 (2005).
  9. Ambati, J., et al. Elevated gamma-aminobutyric acid, glutamate, and vascular endothelial growth factor levels in the vitreous of patients with proliferative diabetic retinopathy. Arch Ophthalmol. 115, 1161-1166 (1997).
  10. Vorwerk, C. K., et al. Depression of retinal glutamate transporter function leads to elevated intravitreal glutamate levels and ganglion cell death. Invest Ophthalmol Vis Sci. 41, 3615-3621 (2000).
  11. Schultheiss, M., et al. Dulbecco's Modified Eagle Medium is neuroprotective when compared to standard vitrectomy irrigation solution. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 251, 1613-1619 (2013).
  12. Januschowski, K., et al. Comparing the effects of two different irrigation solutions on an isolated perfused vertebrate retina. Ophthalmic Res. 48, 59-66 (2012).
  13. Sickel, W. Respiratory and Electrical Responses to Light Simulation in the Retina of the Frog. Science. 148, 648-651 (1965).
  14. Luke, M., et al. The isolated perfused bovine retina--a sensitive tool for pharmacological research on retinal function. Brain research. Brain research protocols. 16, 27-36 (2005).
  15. Henderson, A. R. Testing experimental data for univariate normality. Clinica chimica acta; international journal of clinical chemistry. 366, 112-129 (2006).
  16. Alt, A., et al. The neuroprotective potential of Rho-kinase inhibition in promoting cell survival and reducing reactive gliosis in response to hypoxia in isolated bovine retina. Cell Physiol Biochem. 32, 218-234 (2013).
  17. Green, D. G., Kapousta-Bruneau, N. V. Electrophysiological properties of a new isolated rat retina preparation. Vision research. 39, 2165-2177 (1999).
  18. Richter, S. H., Garner, J. P., Wurbel, H. Environmental standardization: cure or cause of poor reproducibility in animal experiments. Nat Methods. 6, 257-261 (2009).
  19. Dutescu, R. M., et al. Multifocal ERG recordings under visual control of the stimulated fundus in mice. Investigative ophthalmology & visual science. 54, 2582-2589 (2013).
  20. Perlman, I. Testing retinal toxicity of drugs in animal models using electrophysiological and morphological techniques. Doc Ophthalmol. 118, 3-28 (2009).
  21. Mukhopadhyay, A., Gupta, A., Mukherjee, S., Chaudhuri, K., Ray, K. Did myocilin evolve from two different primordial proteins. Mol Vis. 8, 271-279 (2002).
  22. Januschowski, K., et al. Evaluating retinal toxicity of a new heavy intraocular dye, using a model of perfused and isolated retinal cultures of bovine and human origin. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 250, 1013-1022 (2012).
  23. Luke, M., et al. The isolated perfused bovine retina--a sensitive tool for pharmacological research on retinal function. Brain Res Brain Res Protoc. 16, 27-36 (2005).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

глутаматный стрессмодель гипоксииизолированная сетчаткарегистрация электроретинограммыпрепарат бычьей сетчаткиамплитуда волны аамплитуда волны бтестирование нейропротекторных средстванализ восстановления ЭРГпротокол темновой адаптации
Глутамат и гипоксии как стресс модель для изолированных перфузируемые сетчатки позвоночных
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.