Одновременное Электрофизиологические Запись и Micro-инъекции агенты, ингибирующие в мозге грызунов

Краткое содержание

Здесь мы создаем стеклянную пипетку с двойными функциями: ингибирование глубоких структур мозга с помощью микроинъекций лекарств и мониторинг их эффектов в реальном времени с помощью одновременных электрофизиологических записей.

Аннотация

Здесь мы опишем метод для строительства одноразовой "injectrode", используя коммерчески доступные и недорогие запчасти. Зондирующего система была разработана, что позволяет инъекции препарата во время записи электрофизиологических сигналов от пораженной нейронной население. Этот метод обеспечивает простой и экономичной альтернативой коммерческим решениям. Стеклянной пипетки была модифицирована путем объединения ее с иглой для подкожных инъекций и серебряной нити. Injectrode прикреплен к коммерческой микрошприц насос для доставки лекарственных средств. Это приводит в технике, что обеспечивает в режиме реального времени обратной связи фармакодинамики через многоквартирных внеклеточного сигналов, исходящих от места доставки наркотиков. Как доказательство концепции, мы записали активность нейронов от двухолмия вызванной вспышками света у крыс, одновременно с доставкой наркотиков через injectrode. Емкость записи injectrode позволяет функциональную характеристику инъекцотражения на сайте пользу точный контроль над локализацией поставки наркотиков. Применение этого метода также простирается далеко за пределы того, что показали здесь, как выбор химического вещества загружаются в injectrode огромен, в том числе отслеживание маркеры для анатомических опытов.

Введение

Инактивация областях коры и подкорковых ядер важно в изучении функциональных связей между различными структурами мозга ^2-4. Последние исследования использованы потери из-функции химического или криогенные методы, чтобы изучить роль структур головного мозга ^2,5. В отношении фармакологических микроинъекций, небольшие объемы препаратов можно вводить в область головного мозга с контролируемой скоростью при сведении к минимуму побочного ущерба окружающей ткани ^6,7. Этот метод может быть использован для получения конкретной агонисты, обратные агонисты или антагонисты для изучения влияния различных фармакологических мишеней на нейронной активности. Такие эффекты могут быть изучены путем измерения изменения в нейронных ответов из дальних мест, что позволяет исследователям изучать отношения между различными корковыми и подкорковыми структурами.

Здесь мы демонстрируем сборку устройства, в injectrode, способный бой записи электрофизиологических сигналов и доставки небольших количеств препаратов в целевом местоположении. Мы продемонстрировать возможности этой системы путем введения ГАМК, общий ингибитор активности нейронов, в крысиной двухолмия. Этот регион является чувствительным к визуальной стимуляции, которая позволила нам использовать визуально вызвавший многоместными деятельность, чтобы подтвердить локализацию injectrode. Обратимость инактивации оценивали по восстановлению нормальной нейронной активности после окончания ГАМК инъекции.

Возможность контролировать мульти-блок активности из места инъекции позволяет тонкой настройки скоростей впрыска и объемов, необходимых для достижения желаемого фармакодинамического ответа. Таким образом, преимуществом этого метода является возможность ограничивающим повреждение тканей, вызванного microperfusion, так наименьшей эффективной объемы инъекции. Предложенный протокол обеспечивает экономически эффективный способ для генерации одноразового аппаратного necessarу для проведения экспериментов, в которых доставки лекарств и местных нейронов записи деятельность желаемых.

Протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: Все процедуры были выполнены в соответствии с директивами Канадского совета по защите животных и наблюдательный совет по этике в Университете Монреаля.

1. Ассамблея Запись впрыска пипетки

1. Потяните приблизительно 7 см длинный стеклянный капилляр (1 мм наружный диаметр), используя пипетки съемник.
2. Перерыв кончик капилляра и проверить отверстие под световым микроскопом. Убедитесь, что внутренний диаметр составляет от 30 мкм до 40 мкм.
3. Вставьте длиной 7 см серебряной проволоки с в стеклянный капилляр с примерно 1 см, выступающих из Неклиновидная конце стеклянной пипетки.
4. Изгиб избыток нити ортогонально стеклянного капилляра.
5. Нанесите капельку гибкой пластиковой клей на вал 30 G иглы для подкожных инъекций.
6. Вставьте 30 G иглу в стеклянной пипетки в соответствии с схемами, представленными в рисунке 1 .
7. Добавление второго покрытие клеем, чтобы обеспечить надлежащее уплотнение в сочленении между стеклянной пипетки и подкожных инъекций.
8. Оставьте пипетки для сухой с кончик направлен вверх около 12 часов, чтобы обеспечить надлежащее отверждение клея. Готовое Результат показан на рисунке 2.

Примечание: Эта процедура выполняется на острых опытах и ​​стерилизации наконечника пипетки не требуется.

2. Подготовка животных

1. Поместите крысу в анестезии поле.
2. Индуцировать анестезию с использованием 4% изофлуран от 5 до 10 мин.
3. Место животное на стереотаксической стол с грелку и ректального зонда, чтобы поддерживать температуру тела 37 ° С. Используйте носовой конус для поддержания анестезии с 2% изофлуран. Безопасный голову крысы с помощью уха баров и держатель зубы.
4. Применить глазная мазь или глазные капли, которые включают 1% атропина капли, чтобы помочь в расширением зрачка. Чтобы предотвратить сухость, применяются смазочные падениеS примерно каждые 30 мин.
5. Бритье головы и очистить его с 10% повидон-йод.
6. Для местной анестезии, вводят 0,5 мл 2% лидокаина в кожу головы 2-3 в местах, подняв кожу и вставки кончик иглы.
7. Подтвердите адекватный уровень анестезии, выполняя носок щепотку и наблюдая отсутствие движения. Кроме того, контролировать частоту сердечных сокращений, чтобы гарантировать, что он находится в пределах нормальных значений (от 300 до 400 уд / мин).
8. Надрезать кожу головы в прямой линии вдоль медианы с # 10 лезвие скальпеля, чтобы выставить как корональные и сагиттального швов.
9. Выявить лямбда и темени точки от расталкивая ткань, которая покрывает череп с хирургической шпателем.
10. Уровень череп, так что брегмы и лямбда-позиции в одной плоскости.
11. Чтобы установить точку отсчета, использовать стереотаксической устройства с установленным стеклянной трубки, чтобы установить его прямо над брегмы. Это будет "ноль" для передне-задней и медIAL-боковые измерения координат.
12. Установите точку интереса путем перемещения стереотаксической крепление к требуемые координаты, обратите внимание на стереотаксических координат и нарисовать квадрат вокруг целевой области, отмечает, где будет выполняться трепанация черепа.
13. Используйте хирургическую дрель с стерилизованной сверла вдоль отмеченной площади медленно, без давления медленно удалить материал костной ткани. Будьте осторожны, чтобы не просверлить слишком долго в том же районе, как это будет производить тепло и вызвать повреждения на коре.
14. Когда кости делимитации трепанацию черепа стала достаточно тонкой, осторожно удалите черепную раздел с помощью пинцета, чтобы разоблачить мозга.
15. Часто поливать открытую кору с искусственным спинномозговой жидкости, чтобы предотвратить обезвоживание тканей.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Дура-матер удаление ненужно на крысах, как верхушка injectrode достаточно крепким, чтобы проникнуть.

3. Заполнение и монтаж системы впрыска

1. Заполните5-10 мкл микрошприц стремлением с минеральным маслом.
2. Заполните шприц с фиксированной стеклянной пипетки с раствором 0,5% Чикаго голубой (CSB) и 300 мкМ γ-аминомасляной кислоты (ГАМК) или раствором 2% лидокаина с 0,5% CSB ^9. Развести все решения с физиологическим раствором.
   1. В случае обильного вещества, заполните с помощью регулярного шприц и использовать обычные методы предосторожности, чтобы избежать образования воздушных пузырьков.
   2. В случае более дорогих веществ, используют минеральное масло, чтобы заполнить injectrode и химический агент может быть введен с помощью аспирации. В отличие плотности между минерального масла и воды является относительно высокой, это вещество является хорошим кандидатом для инъекций водных растворов.
      Примечание: краситель может быть добавлен, чтобы подтвердить расстояние между обеих жидкостей.
3. Для заполнения инъекционной пипетки, заполнить шприц емкостью 1 мл с раствором аспирацией и затем медленно вводят растворв инъекционной пипетки.
4. Обратите особое внимание на герметичность в регионах, указанных на рисунке 1, моечные эти области чистой и наблюдая утечки путем дальнейшего нагнетания медленно раствор с шприцем.
5. Удалите шприц 1 мл. При этом, не забудьте сохранить светового давления на поршень таким образом, чтобы вакуум не удалить раствор из пипетки инъекции.
6. Заполните микрошприца с минеральным маслом стремлением и надежно прикрепите его к заполненной пипетки инъекции, затем тщательно вытереть излишки раствора из собранного injectrode марлей.
7. Убедитесь, что наконечник не блокируется путем введения очень небольшой объем, достаточный, чтобы увидеть небольшую каплю формирования на кончике стеклянной пипетки.
8. Установите injectrode в системе микронасосу и убедиться, что он хорошо фиксируется.
9. Осторожно установите наконечник injectrode в целевых координат и снизить наконечник к поверхности коры.
10. Медленно опустите injectrОда помощью стереотаксической аппарат к целевой структуре (двухолмия в данном случае), используя соответствующие анатомические координаты.
11. Накройте подвергается кору теплой агар, чтобы предотвратить высыхание ткани.

4. Инъекции и реверсивный Инактивация

1. Установите микроинъекции насос придать от 400 до 800 п на 40 л / мин и пресс-Run, чтобы начать инъекцию. Обратите внимание, что скорость шип покажет снижение во время инъекции.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В экспериментальной установке, нервная деятельность восстанавливается в течение часа после окончания поставки ГАМК. Любая калибровка механическое устройство может быть использовано, чтобы оказать давление на микроинъекции шприца для того, чтобы провести инъекцию.
2. После приобретения электрофизиологических данных, усыпить, используя метод, утвержденный местным животных этике сообщества.

Результаты

Конструкция injectrode показано на рисунке 1. серебряной проволоки (C) подается в стеклянную пипетку (D) с частью проволочной тяги и выступающие из отверстия. 30 G иглу (B) прикреплен и уплотнен к открытию стеклянной пипетки с клеем. После пипетка была заполнена веществом инъекции, стекло микро шприца (А) присоединен к игле. Важно, что есть хорошее уплотнение, где микро шприц соединяется с иглой (E) и где серебряный провод выступает из стеклянной пипетки (F). Рисунок 2 показывает фотогр...

Обсуждение

Предложенный протокол был разработан, чтобы решить проблемы, связанные с текущим обратимых методов инактивации. В частности, этот проект направлен на уточнение методов, используемых для химических микроинъекций веществ, модулирующих активность нейронов, особенно в глубинных структурах головного мозга. Техническая задача выхода из этого типа установки является необходимость для обеих зондов для локализуется в той же ограниченного пространства в естественных условиях в целях получения точных записей в месте инъек...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Инжекционный насос (UltraMicroPump III)	WPI
Инжекционная консоль (контроллер Micro4)	WPI	#SYS-MICRO4
Шприц Hamilton	Hamliton	(80301) 701LT 10 µ L SYR	Шприцы от 5 до 10 мкм; l
Используется гибкий пластичный клей	Lepage	393915	Гелевая форма легче наносится на вал 30  G игла для подкожных инъекций, образующая водонепроницаемое уплотнение при высыхании.
Стеклянные пипетки	WPI	#TW100F-4	тонкостенные, 1  мм OD, 0,75  мм ID с филаментными пипетками используется
720 Needle Pipette Puller	Kopf	720
Silver wire	A-M Systems, Inc.	782500	Голый 0.010"