Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Восстановление трансмембранный белок, напряжения закрытого ионного канала, KvAP, в гигантском однослойные везикулы для микроскопии и локальной фиксации исследований

19.2K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/52281

⸱

22 января 2015 г.

 ,  ,  , 
1Institut Curie, Centre de Recherche, CNRS, UMR 168, PhysicoChimie Curie, Université Pierre et Marie Curie, 2Kavli Institute for Brain and Mind, University of California, San Diego, 3Molecular Physiology and Biophysics Section, National Institute for Neurological Disorders and Stroke, National Institute of Health

В этой статье

Краткое содержание

Восстановление трансмембранного белка, KvAP, в гигантские однослойные везикулы (GUVs) демонстрируется в течение двух методов дегидратации-регидратации - electroformation, и гель-помощь набухания. В обоих методах, небольшие однослойные везикулы, содержащие белок слиты вместе, чтобы сформировать GUVs, которые затем могут быть изучены с помощью флуоресцентной микроскопии и патч-зажим электрофизиологии.

Аннотация

Гигантский однослойные везикулы (GUVs) являются популярным биомиметический системой для изучения мембран связанные с ней явления. Тем не менее, обычно используются протоколы расти GUVs должны быть изменены, чтобы сформировать GUVs содержащие функциональные трансмембранных белков. Эта статья описывает два способа дегидратации-регидратации - electroformation и гель-помощь отеки - сформировать GUVs, содержащие калиевого канала потенциалзависимыми, KvAP. В обоих способах раствор белка, содержащего небольшие однослойные пузырьки частично обезвоженной чтобы сформировать стопку мембран, который затем дают набухнуть в буфере повторной гидратации. Для метода electroformation, пленка наносится на платиновыми электродами, так что поле переменного тока могут быть применены во пленки регидратации. В отличие от этого, способ отек гель-помощь использует агарозном геле подложку пленки для повышения регидратации. Оба метода могут производить GUVs в низких (например, 5 мМ) и физиологических (например, 100 мм) концентрации соли, Полученные GUVs характеризуются с помощью флуоресцентной микроскопии, и функция восстановленных каналов измеряется с использованием конфигурации патч-зажим наизнанку. В то время как опухоль в присутствии электрического поля переменного (electroformation) дает высокий выход бездефектных GUVs, метод отек гель-помощь производит более равномерное распределение белка и не требует никакого специального оборудования.

Введение

При изучении физических принципов, которые регулируют живые системы, снизу вверх подходы позволяют экспериментатор контролировать состав системы и другие параметры, которые не так легко манипулировать в клеточных систем 1. Для мембранных процессов на основе Giant однослойные везикулы (GUVs, диаметр ~ 1-100 мкм), оказались очень полезным Биомиметические Система 2 - 7, как они хорошо подходят для микроскопических исследований и микроманипуляций 8 - 10. В то время как есть много различных протоколов для производства GUVs, большинство делятся на две категории - эмульсия на основе подходов 11,12 и методы, основанные на станавливающим липидной пленки 13 - 16. В эмульсионных основе методов, внутренние и внешние листовки GUV мембран собраны последовательно от липидных монослоев на вода / масло интерфейсов. Этот подход является идеальным для инкапсуляции растворимые белки св GUVs, и для формирования GUVs с асимметричной композиции листовка липидов. Тем не менее, GUVs, образованные из эмульсий может сохранить следы растворителя, которые изменяют механические свойства мембраны 17, и подход не является особенно хорошо подходит для транс-мембранного восстановления белка.

Способы пленки регидратации рассчитывать на то, что сушка (обезвоживание) вызывает много смеси липидов с образованием нескольких слоистую стопку мембран. Если это стопка затем помещают в контакт с водным буфером, мембраны в стеке будет раздвигаться в качестве растворителя потоков между ними, а на поверхности штабеля, отдельные мембраны могут отделить, чтобы сформировать GUVs 13,18 (а настоящую зоопарка другие липидные объектов). Тем не менее, даже в оптимальных буферных и липидных композиций, этот метод классических "спонтанное набухание" имеет относительно низкий выход бездефектных GUVs. Один широко используемый метод для повышения урожайности бездефектных GUVs является "electroformation221 ;, в котором поле переменный ток (AC) применяется при фильма регидратации. В то время как механизм остается плохо изученным, "electroformation" может дать впечатляющие урожаи ПРАВ (> 90% при благоприятных условиях) для концентрации буферов с низким содержанием соли (<5 ммоль) 14,19, и может работать даже в физиологических буферов (~ 100 мм) с использованием Более высокая частота (500 Гц против 10 Гц) переменного поля и платиновые электроды 15. Альтернативный подход, чтобы повысить выход бездефектных GUVs является "гель-помощь отек", в котором липид раствор наносят на полимерную подложку гель, а не пассивным (например, стекло, PTFE) подложки используется в классической "спонтанной набухания ". Когда результате окисления липидов / гель фильм регидратации, GUVs может быстро сформировать даже по физиологическим буферов 16,20.

Все эти методы могут производить липидов только GUVs, которые могут быть использованы для изучения мембранных связаны такие явления, какВзаимодействие между растворимых белков и мембран. Тем не менее, чтобы включать транс-мембранного белка в GUVs, значительные изменения необходимы, чтобы гарантировать, что белок остается в функциональном состоянии в течение всей процедуры восстановления. В то время как растворы липидов в органических растворителях (например, хлороформ, циклогексан) идеально подходят для изготовления пленок липидов, транс-мембранные белки, как правило, только стабильны, когда их гидрофобным трансмембранным доменом встроен в липидный бислой или окружен моющего средства мицеллы ( например, во время очистки белков). Таким образом, исходный материал для восстановления, как правило, родной мембраны, очищенный белок в растворе моющего средства, или небольшие однослойные белка, содержащего везикулы (Proteo-внедорожников) и / или мульти-пластинчатые везикулы (Proteo-ГРЩ), образованные при удалении моющего средства в Наличие липидов. Большинство методов, чтобы включить эти мембранные белки в GUVs делятся на три категории.

Прямая Insertioн: Транс-мембранный белок приостановлено в производстве моющих средств смешивают с предварительно сформированным, липидов только, мягко моющих растворенных GUVs и моющим средством, затем удалить с помощью biobeads 21. В то время как концептуально простой, этот метод требует точного контроля концентрации моющего средства, а слишком высокая концентрация моющего средства может растворять GUVs то время как слишком низкой концентрации могут вызвать белок разворачиваться или агрегировать.

GUV / Proteo-внедорожник Fusion: Белок в протеобактерий-внедорожников в сочетании с заранее сформированным, липидов только GUVs и слияние способствует специальными фузогенные пептидов 22 или моющего средства 21. Обычно степень плавления в ограниченной приводит к GUVs с низкой плотностью белка.

Обезвоживание / Регидратация: белок, содержащий липидную пленку формируют путем частичного обезвоживания Proteo-SUV (или Proteo-MLV) раствора и GUVs которые затем выращивали в течение чистого липидной пленке. Очевидно, задача состоит в том, чтобы защитить белок во время частичного dehydratiна этапе 23, но метод был успешно использован для восстановления транс-мембранных белков, таких как Бактериородопсин, кальций-АТФазы, интегрина и VDAC в GUVs 7,23 - 25.

В этой статье описаны протоколы дегидратации / регидратации, чтобы GUVs содержащие калиевого канала потенциалзависимыми, KvAP, с гипер-термофильные археи, Aeropyrum pernix. KvAP имеет высокую степень гомологии в эукариотической напряжения зависимых калиевых каналов 26 и известную кристаллическую структуру 27 , что делает его хорошей моделью для изучения механизма напряжения стробирования. Производство протеобактерий-внедорожников был подробно описан ранее, и не является частью данного руководства 26,28,29. Важно отметить, что KvAP Proteo-внедорожников не должны быть подготовлены для каждого препарата ГУВ, как они могут быть сохранены в небольших (например, 10 мкл) аликвотах при -80 ° С в течение длительных периодов времени (> 1 год). Electroformationили гель-помощь опухоль может быть использован для выращивания GUVs от KvAP протеобактерий-внедорожников (или Proteo-ГРЩ).

Ключевые шаги для протокола electroformation показаны на рисунке 1. Капли раствора внедорожников, содержащих белок осаждаются на платиновых проводов (как показано на рисунке 2). Частичное обезвоживание суспензии на SUV приводит к образованию липидов белка пленки путем слияния внедорожников. Во время регидратации переменного поля, приложенного к электродам, чтобы помочь липидные слои отслаиваются и образуют GUVs. Поле 10 Гц работает хорошо при использовании "с низким содержанием соли" (<5 ммоль) регидратация буфер 28 и GUVs занять несколько часов, чтобы расти. В отличие от этого, физиологические буферы (содержащий ~ 100 мм соль) хорошо работают с меньшим напряжением, 500 поле Гц переменного тока, но требуют длительного (~ 12 ч) отек период 15. Этот метод основан на более ранней протокола с использованием ИТО скользит 24, но использует пользовательский камеры продолжениеAining два платиновых провода, как показано на рисунке 2 (см дискуссию для проектирования деталей и предложения по проще, самодельные камеры).

Фиг.3 иллюстрирует способ отек гель-помощь. Протокол хорошо работает с буферами с физиологических концентрациях соли, протекает быстро, и производит GUVs с более однородным распределением белка. Тем не менее, выход из изолированных, по-видимому, без дефектов GUVs (т.е. GUV мембрана однородна по оптической длины масштабах и не заключать какие-либо предметы) ниже, хотя он обеспечивает достаточное количество для патч-зажим и микро-манипуляции экспериментов , Этот метод был основан на протоколе с использованием агарозном геле с получением липидов только GUVs 16 и требует специального оборудования меньше, чем метод electroformation.

Характеристика GUVs с флуоресцентной микроскопии описано, а также процедуры с использованием стандартного патч-зажим набора кизмерения KvAP деятельность в "наизнанку" вырезали мембраны патчи.

Рост содержащие белок GUVs может быть более сложным, чем липидных только GUVs. В частности, конечный выход ГУВ может зависеть от чувствительно точно, как SUV раствор осаждают и обезвоженной, чтобы сформировать стопку мембран. Для человека без каких-либо предыдущий опыт с GUVs, это может быть полезно, чтобы первые растут липидов только GUVs после обычного протокола 15,16, в котором мембрана пленка, путем осаждения липидов из органического растворителя. После того, как обычный протокол работает хорошо, осаждение внедорожник и частичное обезвоживание может быть освоено с помощью липидов только внедорожники, которые также очень полезны при настройке протокола для нового состава липидов. Когда GUVs расти надежно от липидных только внедорожников, это то только маленький шаг для получения белка, содержащего GUVs из протеобактерий-внедорожников.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Решение Подготовка

  1. Подготовка 5 мл буфера "джипа", содержащего 5 мМ KCl, 1 мМ HEPES (рН 7,4) или трис (рН 7,5) и 2 мМ трегалозы. Фильтр буфер с шприцевой фильтр 0,2 мкм и разделить на 1 мл аликвоты, которые могут храниться при температуре -20 ° С.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Дополнительная информация для реагентов и приборов даны в списке материалов.
  2. Подготовка 40 мл ПРАВ "роста буфера", который наполнит ПРАВ интерьер во пленки регидратации. Для '' с низким содержанием соли роста, объединить 5 мМ KCl, 1 мМ HEPES (рН 7,4) или 1 мМ Трис (рН 7,5), и ~ 400 мМ сахарозы. Для '' физиологический солевой роста, объединить 100 мМ KCl, 5 мМ HEPES (рН 7,4) или 5 мМ Трис (рН 7,5), и ~ 200 мМ сахарозы.
  3. Подготовка 40 мл буфера 'наблюдения' для внешнего раствора в экспериментальной камере путем объединения 100 мМ KCl, 5 мМ HEPES (рН 7,4) или 5 мМ Трис (рН 7,5), и ~ 200 мМ глюкозы.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эти буферы только EXAmples. Смотрите обсуждение адаптировать буферы для других экспериментов.
  4. Измерьте osmolarities роста и наблюдения буферы с осмометра. Добавить гранулы сахарозы или глюкозы, чтобы соответствовать им в пределах 1%, так что GUVs не растворит или свернуть, когда перевели из камеры роста на смотровую камеру.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В этом диапазоне концентраций, добавив 1 мМ сахарозы (13,7 мг на 40 мл) или глюкозы (7,2 мг на 40 мл) повышает осмолярность от ~ 1 мОсм.
  5. Фильтр роста и наблюдения буферы с 0,2 мкм фильтр и хранить их при 4 ° С для ингибирования роста бактерий.
  6. Растворите 50 мг бета-казеина в 10 мл 20 мМ Трис (рН 7,5) буфера с образованием 5 мг / мл бета-казеина раствор, необходимый для пассивации поверхности экспериментальных камер, так что GUVs не прилипают, распространение и разрыва. После того, как бета-казеин полностью не растворится (до нескольких часов при 4 ° С), фильтр (0,2 мкм) его в 0,5 мл аликвоты, которые могут быть заморожены и хранитьсяпри -20 ° С для последующего использования (размороженных аликвоты хранили при 4 ° С, как правило, могут быть использованы на срок до 1 недели).

2. SUV Подготовка

  1. Подготовка и заморозить аликвот протеобактерий-внедорожников, следующих за ранее опубликованные подробный протокол 28. Используйте KvAP флуоресцентно меченных с Alexa-488 малеимид, восстановленного в DPhPC внедорожников (10 мг / мл) в соотношении белка в липидной 1:10 (по массе).
    ПРИМЕЧАНИЕ: дикого типа KvAP содержит один цистеин на мономер находится рядом с внутриклеточной С-конца (аминокислоты 247).
  2. Флуоресцентные липидные только внедорожники:
    ПРИМЕЧАНИЕ: Ручка хлороформ под вытяжкой носить нитриловые перчатки и защитные очки. Избегайте использования любого пластика, как хлороформ могут растворять их. Хлороформ растворы можно хранить в стеклянных флаконах янтарного с тефлоновыми крышками и переносят с помощью шприца стекла. Позаботьтесь, чтобы промыть все посуды по меньшей мере, от 5 до 10 раза хлороформом до и после пипетки липидов.
    1. Подготовьте 100 мкл10 мг / мл DPhPC внедорожников, содержащие 0,5 моль% от красного флуоресцентного липида, Texas Red-DHPE, путем смешивания 100 мкл раствора DPhPC (10 мг / мл в хлороформе) с 8,2 мкл раствора техасский красный-DHPE (1 мг / мл в метаноле) в стекл нный сосудик на 1,5 мл янтарного.
    2. Сушат липиды вниз под потоком азота в химической капотом при вращении флакона. Когда появится фильм должна быть сухой, положите липидов под вакуумом в течение 3 ч, чтобы удалить остатки растворителя.
    3. Добавить 100 мкл буфера для SUV липидов и вихревые энергично, пока не липидов не застревает на стенках флакона, и раствор равномерно молочно.
    4. Разрушать ультразвуком липидов раствора с образованием внедорожников. Отрегулируйте флакон позицию, пока УЗИ не вызывает наибольшее движение и поток внутри флакона, и заботиться, чтобы не нагревать решение без необходимости. Продолжить обработку ультразвуком до тех пор, пока раствор не станет прозрачным, и, когда это возможно, прозрачным (2-5 мин в течение наконечника ультразвуком, ~ 20 мин для ванной ультразвуком).
    5. Aliquoт внедорожники (например, 10 мкл или 20 мкл) и заморозить (-20 ° C) для последующего использования.
      ПРИМЕЧАНИЕ: липиды, особенно ненасыщенных липидов, может легко пробоя. Липидов Store Solutions при 20 ° C (или 80 ° C) в атмосфере аргона и использовать в течение 6 месяцев. Липидов продукты распада могут быть обнаружены при помощи тонкослойной хроматографии.

3. GUV рост за счет Electroformation

  1. Подготовка electroformation камеру.
    1. Если камера не была очищена, снимите окна, протрите все герметик и смазку, извлеките провода, и промойте и скраб камеру с ткани с использованием воды и этанола (≥70%) попеременно.
    2. Протрите провода и погрузите провода и камеру в ацетоне, и разрушать ультразвуком в течение 5 мин. Протрите все с ткани еще раз, используя ацетон. Поместите камеру в этаноле и разрушать ультразвуком в течение 5 мин.
    3. Соберите камеру, вставив провода через отверстия и поверните и протрите провода, чтобы убедиться, что они аре чистоте. Поместите камеру в дистиллированной воде, разрушать ультразвуком в течение 5 мин и сушат камеру с потоком азота или воздуха.
  2. Подготовка 30 мкл 3 мг / мл суспензии в SUV SUV буфера. Для формирования белка, содержащего GUVs, объединить 8 мкл протеобактерий-внедорожников (DPhPC 10 мг / мл KvAP 1:10), 2 мкл флуоресцентных внедорожников (10 мг / мл DPhPC, 0,5 моль% TexasRed-DHPE) и 20 мкл SUV Буфер в 1,5 мл микроцентрифужных трубки для окончательного белка липидов (по массе) соотношении 1: до 12,5 и 0,1 моль% TexasRed-DHPE. Смешайте раствор энергично.
    1. С другой стороны, на практике протокол с липидами только внедорожников, просто объединить 10 мкл флуоресцентных внедорожников (10 мг / мл DPhPC и 0,5 моль% TexasRed-DHPE) с 20 мкл буфера SUV.
  3. Депозит внедорожник решение.
    1. Используйте 2 мкл пипетки или 5 мкл стеклянный шприц для нанесения небольших (<0,2 мкл) капелек внедорожник решения на проводах. Приблизительно 1 мкл раствора необходимо, чтобы образовать ряд капель вдоль1 см проволоки. Убедитесь, что капли достаточно малы и расположены достаточно далеко друг от друга, что они не касаются или предохранитель.
    2. Пусть хранение внедорожники высохнуть в течение ~ 30 мин на открытом воздухе. Когда все капли поселились, поверните провод так, липидные отложения легче наблюдать под микроскопом.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если внедорожники не высыхают достаточно, они могут просто смыть проводов при буфера рост будет добавлен, время сушки слишком много может повредить белок. Потому что влажность воздуха влияет на скорость сушки, время сушки и / или влажности воздуха можно регулировать для достижения оптимальных результатов 30. Липидную пленку на проводах должны быть видны под микроскопом.
  4. Соберите камеру.
    1. Уплотнение основания камеры: С помощью шприца для применения вакуумной смазки в нижней части камеры вокруг трех скважин и пресс 40 мм х 22 мм покровное осторожно против него, чтобы запечатать дно камеры так, чтобы она прилипает без зазора. Печать стороны камеры (где выход провода) сгерметик. Применение вакуумной смазки на верхней части камеры с изложением три скважины.
    2. Медленно добавьте буфер роста, пока каждый хорошо не заполнен до самого верха. Избегайте быстрого движения раствора в лунках, так как это может лишить липидной пленки с электродами.
    3. Закройте камеру, нажав на верхнюю крышку слайд мягко на смазку, стараясь не сместить нижнюю покровное. Использование ткани, чтобы удалить любые капли буфера на краях верхней покровным.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это хорошее время, чтобы изучить камеру под микроскопом, чтобы подтвердить, что липидная пленка осталась на проводах.
  5. Подключите генератор сигнала к проводам с помощью двух зажимов-крокодилов. Установите частоту (10 Гц / 500 Гц синусоидальной волны для низкой / высокой солевого буфера) и с помощью мультиметра для измерения и регулировки напряжения на проводах до 0,7 / 0,35 В среднеквадратическое (Vrms) для низкой / высокой солевого буфера. Крышка камеры с алюминиевой фольгой для защиты от света флуорофоров. Оставьте тон GUVs расти в течение 2 до 3 ч на низкой солевого буфера и 12 ч или O / N для высокой солевого буфера.
  6. Отключите камеру от генератора и осторожно поместите его на инвертированный микроскоп, чтобы оценить рост ПРАВ. Используйте медленный и стабильный движения или потока жидкости в скважинах может преждевременно снять GUVs от проводов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: GUVs на проводе краям обычно видны в фазового контраста (40X большое рабочее расстояние объективной), в то время как GUVs в любом месте на нижней половине проводов можно увидеть эпифлуоресцентной. Если не видны GUVs, можно попробовать повернуть провода, чтобы посмотреть на верхней поверхности. GUVs можно хранить при 4 ° С в ростовой камере в течение нескольких дней.

4. GUV рост за счет Гель-помощь Отек

  1. Подготовка 10 мл 1% -ного раствора агарозы путем смешивания 100 мг агарозы с 10 мл чистой воды. Нагрейте его до кипения, поместив его в микроволновой печи при 480 Вт в течение ~ 20 сек. Движение, чтобы убедиться, что агарозы полностью не растворится.
    ПРИМЕЧАНИЕ: решениеможно хранить при 4 ° С и нагревают при необходимости.
  2. Плазма-чистые (воздушно-плазменной) крышка-слайд в течение 1 мин, так что раствор агарозы будет распространяться приятно на него. Используйте кавер-слайды в течение следующего 15 мин, как эффект плазменной очистки стирается быстро.
  3. Применение 200 мкл теплой агарозном раствора в каждую 22 х 22 мм 2 слайда так что раствор смачивает всю поверхность. Наклоните слайд вертикально и касаться нижнего края к ткани, чтобы удалить лишнюю жидкость и оставить только тонкий гладкий слой агарозы на слайде.
  4. Поместите слайд на горячей плите или в духовке при температуре 60 ° С и оставить его сохнуть в течение по крайней мере 30 мин. Агарозном фильм едва заметны на глаз. После того, как скользит остыть до комнатной температуры, использовать их немедленно или хранить их в течение одной недели в закрытом контейнере при температуре 4 ° С.
  5. Поместите в агарозном покрытием покровное в стандартном 3,5 см чашку Петри.
  6. Подготовка внедорожника решение, как в разделе 3.2, и применить ~ 15 мкл внедорожник раствора (3 мг / мл липидов) в~ 30 очень мелкие капли мягко на агарозном поверхности. Будьте осторожны, не искажают агарозном слой слишком много.
  7. Поместите слайд в слабом токе азота в течение приблизительно 10-15 мин и последующей испарение буфера на глаз, как капли высыхают.
  8. Как только внедорожников высохли, добавить буфер роста, чтобы покрыть поверхность скольжения. Для небольшого 3,5 см чашку Петри использованием ~ 1 мл буфера.
  9. Разрешить опухоль протекать в течение ~ 30 мин, а затем изучить рост GUVs в камере с использованием инвертированного микроскопа с фазовым контрастом или дифференциального интерференционного контраста (DIC).
    ПРИМЕЧАНИЕ: эпифлуоресцентной наблюдение затруднено из-за сильного фоне флуорофорами в геле и автофлуоресценции агарозы.

5. Заготовка и наблюдений GUVs

  1. Пассивировать наблюдения камеры (например, небольшой чашке Петри или покровного стекла), так что GUVs не придерживаться, распространение и взрыв на дно камеры. Обложка ЧамBER дно с бета-казеина раствором, инкубируют в течение 5 мин, промыть казеина раствор чистой водой, сушат в токе воздуха или азота, и, наконец, добавляют наблюдения буфер (например, ~ 5 мм глубина за небольшую чашку Петри).
  2. Урожай GUVs. Отрежьте конец 100 мкл наконечники пипеток так открытие больше (~ 2 мм в диаметре), и стремятся медленно, как стресс сдвига пипетки может легко разрушить GUVs.
    1. Для электро-образована GUVs, откройте камеру роста, аккуратно удалив верхний покровное. Поместите кончик пипетки прямо над каждой проволоки и аспирации ~ 50 мкл при перемещении пипетки вдоль провода, чтобы отделить GUVs.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это может помочь повернуть провод, чтобы собрать GUVs на "другой стороне" провода.
    2. Для "Гель-помощь отек" GUVs, сначала нажмите на сторону Петри несколько раз, чтобы помочь GUVs оторваться от поверхности покровного. Расположите кончик пипетки прямо над покровным и аспирации 50 мкл а рulling наконечник обратно на поверхность. Непосредственно передача собранных GUVs на смотровую камеру, или магазин в 1,5 мл трубки микроцентрифужных при 4 ° С в течение 1 недели.
  3. Поместите камеры для наблюдений на инвертированный микроскоп, добавьте GUVs на смотровую камеру и подождите несколько минут, для того GUVs, чтобы поселиться в дно камеры.
  4. Рассмотрите камеру с фазовым контрастом или DIC, чтобы быстро найти гладкие, сферические ('бездефектных') "GuV кандидатов". Исследуйте каждый "GuV кандидата" в эпифлуоресцентной, чтобы исключить любые, содержащие мелкие липосомы, вложенные в. И, наконец, проверить, что интенсивность флуоресценции липидов является однородным и совместимы с одной мембраной (например, однослойные).
    Примечание: В некоторых bilamellar (или нескольких пластинчатых) пузырьков, мембраны слишком близко друг к другу должны быть решены, чтобы они появились однослойными в фазового контраста или DIC изображений. Тем не менее, эти объекты можно отличить от фактического unilameLlar GUVs по их липидного флуоресценции, что в два раза (или больше) ярче.

6. Патч зажима GUVs

  1. Сделайте патч пипетки с диаметром кончика 1-2 мкм от стандартного боросиликатного капиллярного стекла с использованием программы рекомендуется для пипетки съемника.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Специальные методы лечения, такие как пожар полировки не нужны, и пипетки можно использовать в течение нескольких дней после того, как были вытащил, если они хранятся в закрытом ящике.
  2. Пассивации камеру путем инкубации с раствором бета-казеина (5 мг / мл), чтобы гарантировать, что GUVs не прилипают, распространение и разрыв на поверхности камеры. Промойте казеин отключается после 5 мин.
  3. Вставьте заземляющий электрод, заполнить камеру со смотровой буфера, трансфер 10 мкл ГУВ суспензии, как описано в шаге 5.2 и 5.3, и подождите несколько минут, для того GUVs, чтобы поселиться в нижней части.
  4. Заполните свежий патч пипетки раствором (наблюдение буфера или другого изо-осмотического раствора) изакрепить его на патч-зажим усилителя headstage.
  5. Поиск через камеру, чтобы найти "бездефектной" GuV, как описано в разделе 5.4, и убедитесь, что она содержит флуоресцентный белок.
  6. Нанесите постоянную положительную давление (> 100 Па, или примерно 1 см H 2 O в манометром), чтобы сохранить патч пипетки салон чистый, и вставьте патч пипетки в камере. Принесите патч пипетки в поле зрения, применять тестовые импульсы для измерения / компенсации пипетки напряжение смещения и сопротивления, и изучить пипетку под флуоресцентным освещением, чтобы подтвердить, что наконечник чистый.
  7. Принесите патч пипетки к GUV, и, если необходимо, одновременно снизить избыточное давление, так внешнем потоке из патча пипетки не делает ПРАВ "убежать". Когда патч пипетки близко к GUV, применять отрицательное давление (до 5 см H 2 O), чтобы вытащить ПРАВ против патча пипетки. Монитор сопротивление как "; Язык "из ГУВ мембраны входит патч пипетки и gigaseal формы.
  8. Если gigaseal не образуют, удалить патч пипетки из камеры и вернуться к шагу 6.4. Если мембрана патч сформировали gigaseal, но GUV остается прикрепленной к пипетки, вырезать патч, потянув от GUV, заливаясь в GuV против дно камеры, или, коротко, перемещая пипетку из раствора.
  9. Когда наизнанку мембраны патч был вырезан из GUV и gigaseal является стабильным, выключите испытательных импульсов и применять протокол напряжения, таких как показано на рисунке 13.
    ПРИМЕЧАНИЕ: На рисунке 13 следует стандартной электрофизиологические конвенции о наизнанку патч, в котором ток, протекающий в патч-электрод "позитивный", и V = V ванна - V пипетки. Проведение патч под отрицательным потенциалом (например, V = -100 мВ) в течение ~ 30 сек мест KvAP в состоянии покоя, в то время как шаги (100 мс до 5 сек) до более положительных потенциалах (например, V = 100 мВ) может загонять его в проводящих (например, открытых) активных состояний.
  10. После измерения на мембране патча закончена, разорвать патч с зап или импульса давления и убедитесь, что напряжение смещения патч электрода не дрейфовал. Удалить патч пипетки из камеры, и вернуться к шагу 6.4.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Рост GUVs может быть быстро оценена путем анализа ростовой камере под микроскопом. Для electroformation, что GUVs как правило, растут в пучки по платиновых проводов, как показано на рисунке 4. В гель-помощь отек, GUVs появляются в виде сферических структур, которые быстро растут и сливаются вместе (рис 5).

Бездефектной GUVs легче определить и оценить после передачи с камеры для наблюдений. Калибровочные измерения необходимы строго оценивать качество GuV и си...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Биомиметические модели системы являются важным инструментом для изучения свойств и взаимодействия белков и мембран. По сравнению с другими восстановленных систем, таких как БЛМ или поддерживаемых липидных мембран, GUV основе системы представляют несколько возможностей, включая значительный контроль состава мембраны, напряженности и геометрии, а также быть по-настоящему масла. Тем не менее, включение трансмембранных белков, таких как KvAP, в GUVs требует значительных адаптации традиционных протоколов для липидных только ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Мы благодарим Сюзанну Фенц за обсуждение возможности восстановления белков путем агарозного набухания, Фэн Чинг Цай за текущие измерения, а также нынешних и бывших членов группы Бассеро за поддержку и помощь. Проект финансировался Национальным агентством исследований (грант BLAN-0057-01), Европейской комиссией (NoE SoftComp), Университетом Пьера и Марии Кюри (грант FED21, Dynamique des Systèmes Complexes). М.Г. была поддержана Международной стипендией PhD Fellowship Института Кюри, S.A., стипендией Фонда медицинских исследований, G.E.S.T., международной стипендией Марии Кюри от Европейской комиссии и грантом Университета Пьера и Марии Кюри. Публикационные взносы были покрыты Labex 'CelTisPhyBio' (ANR-11-LABX0038).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
DPhPC (1,2-дифитаноил-sn-глицеро-3-фосфохолин)Avanti Polar Lipids 850356P
Яйцо ПК L-&альфа;-фосфатидилхолин (яйцо, курица)Avanti Polar Lipids 840051P
Яичный ПА L-&альфа;-фосфатидная кислота (Яйцо, Курица)Avanti Polar Lipids 840101P
18:1 (и Дельта; 9-cis) PC (DOPC) 1,2-диолеол-sn-глицеро-3-фосфохолинAvanti Polar Lipids 850375P
Холестерин (овечья шерсть, >98%) Avanti Polar Lipids 700000P
TRed-DHPEInvirtogenT-1395MPмеченый липид
BPTR-CeramideInvirtogenD-7540 меченый липид
CholoroformVWR22711.290AnalaR Normapur
AcetoneVWR20066.296AnalaR Normapur
EthanolVWR20821.330AnalaR Normapur
KimwipeKimtech7552
Шприцы Hamilton Hamilton Bonaduz AGразнообразные
Янтарные флаконы и тефлоновые чашкиSigmaSU860083 и SU860076
ParafilmVWR291-1214
Микроцентрифужная пробиркаEppendorfdiverse
AgaroseEuromexLM3 (1670-B, Tg 25.7C, Tm 64C)
СахарозаSigma84097-1кг
Глюкоза SigmaG8270-1кг
ТрегалозаSigmaT9531-25G
KClSigmaP9333-1кг
HepesSigmaH3375-100G
TRISEuromexEU0011-A Осмометр
WescorVapro
pH-метрSchott instrumentsLab850
Ультразвуковой аппаратElmasonicS 180 H
Шприцевой фильтр 0,2 & микро; mSartorius steimMinisart 16532
Генератор функцийTTiTG315
Платиновые проводаGoodfellowLS41307499,99+%, d = 0,5 мм
ПолитетрафторэтиленGoodfellow
Dow Corning 'высоковакуумная смазка'VWR1597418
уплотнительная пастаVitrex medical A/S, ДанияREF 140014Sigillum Восковые
слайды 22 x 40 мм No1.5VWR631-0136
Слайды 22 x 22 мм No1.5VWR 631-0125
Плазменный очистительHarrickPDC-32Gвоздушно-плазменный, устанавливающий 'высокий'
чашки ПетриFalcon BDREF 3530013,5 см x 1 см
патч-хомут усилительAxon instrumentsMulticlamp700B
DAQ CardNational InstrumentsPCI-6221
LabviewNational Instrumentsверсия 8.6
Стеклянные пипетки боросиликат OD 1  Внутренний диаметр 0.58  ммГарвардский аппаратGC100-15
Держатель электродовWarner Instruments Q45W-T10P
МикроманипуляторSutter MP-285
Съемник пипетокSutter -2000 
ФотоаппаратProSilica GC1380
Микроскоп Zeiss Axiovert135
ОбъективZeiss40X Большое рабочее расстояние, Фазовый контраст
Объектив Zeiss100X Plan-Apochromat NA 1.3
Filterset GFP (для Alexa-488)HoribaXF100-3
Filterset Cy3 (для TexasRed)HoribaXF101-2
бета-казеинSigma C6905-1G
Конфокальный микроскопNikon Eclipse TE 2000-ED-Eclipse C1 конфокальная головка
ОбъективNikonPlan Fluor 100X NA 1.3
MatlabMathworksдля обработки изображений и анализа текущих трасс

Ссылки

  1. Schwille, P. Bottom-Up Synthetic Biology: Engineering in a Tinkerer’s World. Science. 333 (6047), 1252-1254 (2011).
  2. Aimon, S., et al. Membrane Shape Modulates Transmembrane Protein Distribution. Developmental Cell. 28 (2), 212-218 (2014).
  3. Roux, A., et al. Membrane curvature controls dynamin polymerization. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (9), 4141-4146 (2010).
  4. Domanov, Y. A., et al. Mobility in geometrically confined membranes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (31), 12605(2011).
  5. Sorre, B., et al. Curvature-driven lipid sorting needs proximity to a demixing point and is aided by proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (14), 5622-5626 (2009).
  6. Faris, M. D. E. A., et al. Membrane Tension Lowering Induced by Protein Activity. Physical Review Letters. 102 (3), 038102(2009).
  7. Streicher, P., et al. Integrin reconstituted in GUVs: A biomimetic system to study initial steps of cell spreading. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1788 (10), 2291-2300 (2009).
  8. Walde, P., Cosentino, K., Engel, H., Stano, P. Giant Vesicles: Preparations and Applications. ChemBioChem. 11 (7), 848-865 (2010).
  9. Liu, A. P., Fletcher, D. A. Biology under construction: in vitro reconstitution of cellular function. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (9), 644-650 (2009).
  10. Sens, P., Johannes, L., Bassereau, P. Biophysical approaches to protein-induced membrane deformations in trafficking. Current Opinion in Cell Biology. 20 (4), 476-482 (2008).
  11. Pautot, S., Frisken, B. J., Weitz, D. A. Production of Unilamellar Vesicles Using an Inverted Emulsion. Langmuir. 19 (7), 2870-2879 (2003).
  12. Stachowiak, J. C., et al. Unilamellar vesicle formation and encapsulation by microfluidic jetting. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (12), 4697-4702 (2008).
  13. Reeves, J. P., Dowben, R. M. Formation and properties of thin-walled phospholipid vesicles. Journal of Cellular Physiology. 73 (1), 49-60 (1969).
  14. Angelova, M. I., Soléau, S., Méléard, P., Faucon, F., Bothorel, P. Preparation of giant vesicles by external AC electric fields. Kinetics and applications. Trends in Colloid and Interface Science VI. 89, 161-176 (1992).
  15. Bagatolli, L. A., Pott, T. Giant Unilamellar Vesicle Electroformation. Methods in Enzymology. 465, 161-176 (2009).
  16. Horger, K. S., Estes, D. J., Capone, R., Mayer, M. Films of Agarose Enable Rapid Formation of Giant Liposomes in. Solutions of Physiologic Ionic Strength. Journal of the American Chemical Society. 131 (5), 1810-1819 (2009).
  17. Campillo, C., et al. Unexpected Membrane Dynamics Unveiled by Membrane Nanotube Extrusion. Biophysical Journal. 104 (6), 1248-1256 (2013).
  18. Kwok, R., Evans, E. Thermoelasticity of large lecithin bilayer vesicles. Biophysical Journal. 35 (3), 637-652 (1981).
  19. Mathivet, L., Cribier, S., Devaux, P. F. Shape change and physical properties of giant phospholipid vesicles prepared in the presence of an AC electric field. Biophysical Journal. 70 (3), 1112-1121 (1996).
  20. Weinberger, A., et al. Gel-Assisted Formation of Giant Unilamellar Vesicles. Biophysical Journal. 105 (1), 154-164 (2013).
  21. Dezi, M., Di Cicco, A., Bassereau, P., Levy, D. Detergent-mediated incorporation of transmembrane proteins in giant unilamellar vesicles with controlled physiological contents. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (18), 7276-7281 (2013).
  22. Kahya, N., Pecheur, E. I., de Boeij, W. P., Wiersma, D. A., Hoekstra, D. Reconstitution of membrane proteins into giant unilamellar vesicles via peptide-induced fusion. Biophysical Journal. 81 (3), 1464-1474 (2001).
  23. Doeven, M. K., et al. Distribution, lateral mobility and function of membrane proteins incorporated into giant unilamellar vesicles. Biophysical Journal. 88 (2), 1134-1142 (2005).
  24. Girard, P., Prost, J., Bassereau, P. Passive or Active Fluctuations in Membranes Containing Proteins. Physical Review Letters. 94 (8), 088102(2005).
  25. Betaneli, V., Petrov, E. P., Schwille, P. The Role of Lipids in VDAC Oligomerization. Biophysical Journal. 102 (3), 523-531 (2012).
  26. Ruta, V., Jiang, Y., Lee, A., Chen, J., MacKinnon, R. Functional analysis of an archaebacterial voltage-dependent K+ channel. Nature. 422 (6928), 180-185 (2003).
  27. Jiang, Y., et al. X-ray structure of a voltage-dependent K+ channel. Nature. 423 (6935), 33-41 (2003).
  28. Aimon, S., et al. Functional Reconstitution of a Voltage-Gated Potassium Channel in Giant Unilamellar Vesicles. PLoS ONE. 6 (10), e25529(2011).
  29. Lee, S., Zheng, H., Shi, L., Jiang, Q. -X. Reconstitution of a Kv Channel into Lipid Membranes for Structural and Functional Studies. Journal of Visualized Experiments. (77), (2013).
  30. Baykal-Caglar, E., Hassan-Zadeh, E., Saremi, B., Huang, J. Preparation of giant unilamellar vesicles from damp lipid film for better lipid compositional uniformity. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1818 (11), 2598-2604 (2012).
  31. Suchyna, T. M., Markin, V. S., Sachs, F. Biophysics and Structure of the Patch and the Gigaseal. Biophysical Journal. 97 (3), 738-747 (2009).
  32. Hille, B. Ion Channels of Excitable Membranes. , Sinauer Associates, Inc. (2001).
  33. Finol-Urdaneta, R. K., McArthur, J. R., Juranka, P. F., French, R. J., Morris, C. E. Modulation of KvAP unitary conductance and gating by 1-alkanols and other surface active agents. Biophysical journal. 98 (5), 762-772 (2010).
  34. Schmidt, D., MacKinnon, R. Voltage-dependent K+ channel gating and voltage sensor toxin sensitivity depend on the mechanical state of the lipid membrane. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (49), 19276-19281 (2008).
  35. Quemeneur, F., et al. Shape matters in protein mobility within membranes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (2014).
  36. Parc, A. L., Leonil, J., Chanat, E. αS1-casein, which is essential for efficient ER-to-Golgi casein transport, is also present in a tightly membrane-associated form. BMC Cell Biology. 11 (1), 1-15 (2010).
  37. Garten, M., Toombes, G. E. S., Aimon, S., Bassereau, P. Studying Voltage Dependent Proteins with Giant Unilamellar Vesicles in a “Whole Cell” Configuration. Biophysical Journal. 104 (2), 466a(2013).
  38. Crowe, L. M., Reid, D. S., Crowe, J. H. Is trehalose special for preserving dry biomaterials. Biophysical Journal. 71 (4), 2087-2093 (1996).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Реконституция KvAPметод электроформированиянабухание с помощью геляфлуоресцентная микроскопиялипидно-белковая пленкадегидратация-регидратациявключение мембранного белка
Восстановление трансмембранный белок, напряжения закрытого ионного канала, KvAP, в гигантском однослойные везикулы для микроскопии и локальной фиксации исследований
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.