Выделение и внутривенное введение мышиных костного мозга моноцитов

Краткое содержание

Здесь мы представляем протокол, который генерирует большое количество моноцитов мышей из гетерогенного костного мозга для трансляционных приложений. По сравнению с другими, этот новый метод помогает сократить количество приносимых в жертву животных и снижает затраты, избегая дорогостоящих методов, таких как высокоградиентное разделение магнитных клеток (MACS).

Аннотация

Как подтип лейкоцитов и предшественники макрофагов, моноциты участвуют во многих важных процессах организмов и часто являются предметом различных областей биомедицинской науки. Описанный ниже метод представляет собой простой и эффективный способ выделения мышиных моноцитов из гетерогенного костного мозга.

Костный мозг бедренной и большеберцовой костей мышей Balb/c собирают путем промывки фосфатным солевым буфером (PBS). Клеточную суспензию дополняют макрофагально-колониестимулирующим фактором (M-CSF) и культивируют на сверхнизких поверхностях прикрепления, чтобы избежать дифференцировки моноцитов, вызванной адгезией. Свойства и дифференцировка моноцитов характеризуются с различными интервалами. Для фенотипирования используется флуоресцентная сортировка активированных клеток (FACS) с такими маркерами, как CD11b, CD115 и F4/80. В конце культивирования суспензия состоит на 45%± на 12% из моноцитов. Удаляя адгезивные макрофаги, чистоту можно повысить до 86%± 6%. После выделения моноциты могут быть использованы различными способами, и одним из наиболее эффективных и распространенных методов доставки in vivo является внутривенное введение в хвостовую вену.

Этот метод выделения и применения важен для исследований мышиных моделей, особенно в области воспаления или иммунологии. Моноциты также могут быть использованы в терапевтических целях на моделях заболеваний мышей.

Введение

Выделение моноцитов важно и критично для многих исследований in vitro и in vivo. Эти клетки являются мишенями для таких заболеваний, как заболевание периферических артерий, ишемическая болезнь сердца или другие ишемические заболевания, поскольку рост коллатерального сосуда в значительной степени обусловлен местным воспалением. Воспалительные реакции включают активацию эндотелия и местное пополнение лейкоцитов, в основном моноцитов, которые затем созревают до макрофагов и создают высокоартериогенную среду путем секреции множественных факторов роста, чтобы индуцировать ремоделирование артериолы в функциональную коллатеральную артерию^1-3. Моноциты также созревают до дендритных клеток, которые часто используются для иммунологических исследований^4,5 и исследований рака^6,7.

Проблемой в подходе к выделению моноцитов из периферической крови⁸ является большое количество донорских животных, необходимых для получения достаточного количества моноцитов для большинства анализов. Прежние протоколы описывают такие методы, как центрифугирование с градиентом плотности и истощение клеток с помощью MACS⁹ при выделении моноцитов; Однако эти методы могут изменять характеристики и функциональность моноцитов, что может привести к трудностям в интерпретации^10,11. Кроме того, эти методы сложны и могут снизить экспериментальную воспроизводимость.

Наша цель с помощью этого протокола - предоставить простой и экономически эффективный метод получения большого количества моноцитов, полученных из костного мозга. Благодаря высокому выходу клеток 11 x 10⁶ ± 3 x 10⁶ клеток, полученным по этому протоколу, мы можем существенно сократить количество мышей, необходимых при выделении моноцитов, полученных из костного мозга. Процедура может быть выполнена в течение минимального периода времени и без использования дорогостоящих и сложных методов, о которых говорилось выше. Здесь мы извлекаем моноциты из суспензии нативного костного мозга мышей-доноров, культивируем суспензию на планшетах со сверхнизким уровнем прикрепления и добавляем в раствор 20 нг/мл M-CFS. На 5-й день инкубации происходит забор клеток и их характеристика для подтверждения функциональных и фенотипических свойств.

Для экспериментов в области артериогенеза, внутривенная трансплантация этих моноцитов, полученных из костного мозга, мышам является эффективным методом системной доставки лекарств, который может сочетаться с лигированием бедренной артерии в общих моделях заболеваний периферических артерий.

Протокол

Это исследование было выполнено с разрешения Саксонии и Саксонии-Ангальт, Regierungspraesidium Дрездене / Галле, в соответствии с разделом 8 Закона о Германии по защите животных (24D-9168.11-1 / 2008-24).

1 Выделение клеток

1.1 Подготовка бедра и голени

1. Обезболить мыши, используя 5% изофлуран концентрации путем испарения изофлуран в закрытой емкости. После мыши перестал двигаться в течение 3 секунд, выполните шейки дислокации.
2. Дезинфекцию задних конечностей с этанолом (96%). Удалить кожу и мышцы и отделить кости с помощью стерильного скальпеля.
   1. Начнем с паховой разрез кожи и продлить разрез по направлению к медиальной лодыжки и выполнять круговое рассечение кожи вокруг нижней теленка. Снимите кожу ног полностью очищая это проксимально.
   2. Снять четырехглавой мышцы от бедра с острым скальпелем, удалить оба передних малоберцовойи группы икроножных мышц и разъединять ногу в тазобедренном суставе, обнаруживая и рассечения связки.
   3. Начните вперед и приступить вокруг сустава, тщательно поворачивая ногу и пересекающих связки, тем самым disarticulating сустав.
3. Промыть бедра и голени с 96% -ным этанолом в течение как минимум 90 секунд, чтобы гарантировать асептические клеточный препарат. Продолжить процесс стирки стерильной PBS, чтобы смыть оставшийся этанол.
   Примечание: Все последующие шаги должны быть стерильными, чтобы избежать загрязнения.

1.2 Сбор костного мозга

1. Вырезать проксимальный и дистальный конец каждой кости с парой тонких ножниц, чтобы получить доступ к бедренной и большеберцовой кости валов. Будьте осторожны с этим шагом, так как эти кости сломать очень легко.
2. Флеш кости с теплой средой (M199 + 10% фетальной телячьей сыворотки (FCS), + 1% пенициллина / стрептомицина). Использование стерильного 28-G иглу, 1 мл шприц, а также между 10-15 мл среды накости для полоскания.
3. Держите кости с тонким пинцетом и промыть один за другим, пока она не станет полупрозрачный. Осторожно давить на конце поршень шприца, чтобы минимизировать нагрузку клеток.
4. Фильтр костный мозг через нейлоновую сети 70 мкм и собрать фильтрат. Чтобы извлечь максимальное количество костного мозга, промыть несколько раз в дистальных и проксимальных концах.
5. Промойте сито с PBS и собрать фильтрат. Осторожно выбить мусора и клеточных конгломератов осторожном перемешивании пипеткой.

1.3 Выращивание

1. Центрифуга клеточной суспензии при 250 х г в течение 10 мин при комнатной температуре. Жидкость над осадком сливают и клетки вновь суспендируют в приблизительно 25 мл среды. Повторить один раз.
2. Ресуспендируют клеток в 6 мл среды после второй стадии промывки. Смешайте 50 мкл раствора клеток с 50 мкл трипанового синего. Граф клеток в счетной камере под световым микроскопом. Подсчитать количество Cлоктей в растворе, используя эту формулу:
   
3. Семенной клеток на 6-луночных поверхности сверхнизким крепления пластин, чтобы предотвратить постоянное сцепление с нижней части пластины. Использование концентрации 10 ⁶ клеток на мл до 6 мл на лунку.
4. Дополнение суспензии с 20 нг / мл M-CSF, чтобы способствовать клеточной дифференциации.
5. Культуры клеток в течение 5 дней при 37 ° С и 5% диоксида углерода и наблюдать ежедневно.

1.4 Сбор клеток

Примечание: Эти шаги должны быть выполнены на льду. Продолжайте либо 1.4.1 или 1.4.2 соответственно.

1. На данный момент, урожай всю культуру, в том числе дифференцированных макрофагов, которые присоединятся к культуре пластин, даже если они ультра-низким крепления на поверхности пластины.
   1. Заготавливают всю культуру, осторожно пипеткой и снятие с раствором 4 ° C PBS, 0,5% бычьего сывороточного альбумина (БСА) и 2 мМ ЭДТА. Повторяйте, пока плиты не ясны оставшихся прилипшие клетки - подтвердить под микроскопом, если не уверены.
2. С другой стороны, отбросить прилипшие макрофаги, собирая супернатант с клетками в суспензии, которые содержат преимущественно моноциты.
   1. Урожай неадгезированных клетки с раствором ЭДТА бесплатно PBS и 0,5% БСА. Не наносите слишком много сил для того, чтобы избежать выбивании мягко прикрепленных макрофаги.

1,5 FACS-анализа (Необязательно)

Примечание: Можно разрушают клеточную суспензию CD117 ⁺ stem- и клеток-предшественников с использованием MACS. Используйте протоколы производителя для этой процедуры.

1. Сбора клеток по любому шаги 1.4.1 или 1.4.2.
2. Центрифуга клетки при 250 х г в течение 10 мин при 4 ° С и повторить этот шаг снова.
3. Ресуспендируют, по меньшей мере 250000 клеток в 300 мкл FACS бuffer за зондом.
4. Передача раствора клеток на 96-луночного планшета (30 мкл на лунку).
5. Центрифуга клеточной суспензии при 250 х г в течение 5 мин при 4 ° С.
6. Удалить супернатант и добавить 25 мкл антитела в каждую лунку (использование изготовлением разбавления).
7. Пятно клеток с антителами (следующих протоколов производителя для сотового фенотипирования после стадий 1.5.1-1.5.6. Часто используемые маркеры для идентификации моноцитов / макрофагов включают CD11b, F4 / 80 (рис 3), CD115 (Рисунок 2), и Gr- 1.
   Примечание: Для дальнейшего описания сотовых решений, использование маркеров, таких как CD4, CD8a, CD11c, CD25, CD45, CD45R, CD62L, CD80, CD86, CD145, CD117, MHCⅡ, Ly6C, Ly6G и CD192 рекомендуется. Сотовые характеристики были описаны ранее ^12.
8. Инкубируйте зондов в течение 20 мин при 4 ° С.
9. Центрифуга зонды на 250 мкг в течение 5 мин при 4 ° С и ресуспендируют в 200 мкл FACS буфера. Повторите йэто шаг в два раза.
10. Передача зонды в FACS труб и выполнить анализ FACS ^12.
11. Выполнение анализа FACS ¹² в день 0, 3 и 5 для анализа клеточной дифференциации.

2. Хвост вену

2.1 Подготовка

1. Теплый животных на нагревательной плитке при 37 ° С в течение примерно 10 мин. Соблюдайте животных при нагревании распознавать признаки перегрева.
2. Ресуспендируют моноциты, выделенные с шагом 1.1- 1,4, в 150 мкл NaCl, и загрузить клеток в 1 мл инсулиновый шприц с иглой в 30G. Слегка вихрь решение перед загрузкой в ​​шприц, чтобы обеспечить все моноциты вводили. Всегда обрабатывать клетки на льду, чтобы избежать приложение тепла и опосредованной активации моноцитов.

2.2 Удерживающие

1. Не беспокоить других мышей в клетке при выборе мыши для внутривенной инъекции.
2. Наведите в фиксатор. Избегайте слишком много прEssure и будьте осторожны с задних конечностей. (Рисунок 4)
   Примечание: В качестве альтернативы, использовать общую анестезию, чтобы гарантировать стресс свободное обращение с животными.
3. Убедитесь, что мышь имеет пространство для дыхания перед закрытием фиксатор.

2.3 Injection

1. Лечить инъекции с дезинфицирующего средства. Спрей на хвосте мыши и дать постоять по крайней мере, 1 мин.
2. Остановка венозного кровотока хвоста, слегка надавливая на боковую хвостовую части выше места инъекции, для лучшей видимости вен.
3. Включить задние 90 градусов, перед инъекцией. (Рисунок 5)
4. Вводите под углом 45 градусов. Вводите медленно и не более 5 мкл на грамм не допустить причинения вреда животным.
5. Если есть волдырь, который является признаком неудачной инъекции, немедленно прекратить и повторить инъекцию проксимальнее.
6. Остановить кровотечение на стороне впрыска путем легкого рия около 1 мин.
7. В конце процедуры, открыть втягивающим и поместить курсор в клетке.
8. Обратите внимание на мышь в течение 20 мин, чтобы гарантировать, что животное не страдают от инъекции и грудины лежачее положение сохраняется. Увеличьте время наблюдения до мыши не восстановит достаточное сознание. Вернуться мышь, чтобы компании других животных только после того, как он полностью выздоровел.

Результаты

Раствор экстрагировали клеток из мышиного костного мозга состоит из различных типов клеток. Основные типы клеток являются лимфоциты, гранулоциты и моноциты. Типы клеток можно оценить по размеру и степени детализации, который показан на фиг.1 как для нативных суспензий и клеток, полученных после 5 суток дифференцировки. Обратите внимание на зыбучих клеточный состав в процессе культивирования. Тем не менее, точная классификация населения должны полагаться на отличительные экспрессии клеточных маркеров.

Обсуждение

Мы опишем простой и экономичный способ, чтобы изолировать большое количество крысиных моноцитов из костного мозга. По сравнению с другими протоколов, использующих периферической крови, которые получают моноцитов урожайности ⁵ 1,4 x10 ^6, мы можем получить более высокие урожаи от 11 х 10 ⁶ ± 3 х 10 ⁶ моноцитов от одного донора мыши.

При рассмотрении проблемы с этим методом, важно отметить, потенциал для загрязнения при работе в нестерильных условиях....

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
6-луночная сверхнизкое крепление	Corning Incorporated, Нью-Йорк, США		6-луночная сверхнизкое крепление, с колпачком, стерильный
8-12 недель, самец, Balb/c мыши	Charles River, Зульцфельд, Германия
96-луночная пластина	Greiner bio one GmbH, Фрикенхаузен, Германия
Окрашивание мертвыми клетками Blue Life	technologies GmbH, Дармштадт, Германия
Бычья сыворотка альбумин	GE Healthcare, Фрайбург, Германия		Фракция V, pH 7.0
Canules	B. Braun, Melsungen AG, Мельзунген, Германия		28G, 30G
CD115	eBioscience, Сан-Диего, США	12-1152
CD11b	eBioscience, Сан-Диего, США	53-0112
Чашка для клеточных культур	Greiner Bio-One GmbH, Фрикенхаузен, Германия		С крышкой, стерильная
центрифуга Beckman	Coulter GmbH, Крефельд, Германия		Allegra® X-15R центрифуга
для депиляции	Veet, Мангейм, Германия
Дезинфицирующее средство	Schü lke& Mayr GmbH, Norderstedt, Германия		Kodan Tinktur forte
Одноразовый скальпель No10	Безопасная бритва для перьев Co.Ltd, Осака, Япония
ЭДТА	Сигма Олдрич, Гамбург, Германия
Этанол 96%	Otto Fischar GmbH und Co KG, Saarbrü cken, Германия
Экстракционная установка Pipetus	Hirschmann Laborgerä te GmbH & Co.KG, Эберштадт, Германия
F4/80	AbD Serotec, Dü Ссельдорф, Германия	MCA497APC
буфер FACS	Изготовлено нашей группой из отдельных компонентов		PBS, 0,5% BSA, 0,1% NaN3
FACS устройство	Becton, Dickinson and Company, Franklyn Lakes, Нью-Джерси, США		трубки BD FACS Canto II
FACS	Becton, Dickinson and Company, Франклин Лейкс, Нью-Джерси, США
Falcon® пипетка	Becton Dickenson Labware, Нью-Йорк, США
Фетальная сыворотка для икр	Sigma Aldrich, Гамбург, Германия
Тонкие щипцы	Rubis, Stabio, Швейцария
Перчатки	Rö sner-Matby Meditrade GmbH, Киферсфельден, Германия
Gr1	eBioscience, Сан-Диего, США	53-5931
Нагревательная плита	Labotect GmbH, Gö Тинген, Германия		Конфорка 062
Инкубатор	Ewald Innovationstechnik GmbH, Бад Ненндорф, Германия		Incu safe
Isofluran	Baxter Deutschland GmbH, Unterschleiß heim, Германия
Световой микроскоп	Carl Zeiss SMT GmbH, Оберкохен, Германия		Axiovert 40 ° c
Макрофаг-колониестимулирующий фактор	Sigma Aldrich, Hamburg, Germany	SRP3110
Механический шейкер	IKA, Штауфен, Германия		ms2 минишейкер
Medium 199	PAA Laboratories GmbH, Пашинг, Австрия		Теплый в 37 ° C водяная баня перед использованием
Микропробирки	Eppendorf AG, Гамбург, Германия
Микробиологический верстак	Thermo Electron, LED GmbH, Лангензельбольд, Германия		Hera safe
Monocyte wash buffer	Производится нашей группой с отдельными компонентами		PBS, 0,5% BSA, 2 mM EDTA
Удерживающий устройство для мышей	Various
NaCl	Berlin Chemie AG, Берлин, Германия
NaN3 (sodium acide)	Sigma Aldrich, Hamburg, Германия
Счетная камера Neubauer	Paul Marienfeld GmbH und Co.KG, Lauda-Kö нигсхофен, Германия
Нейлоновое клеточное сито	Becton, Dickinson and Company, Франклин Лейкс, Нью-Джерси, США		Клеточное ситечко, 70 & микро; m размер ячеек
Пенициллин/стрептомицин	Sigma Aldrich, Гамбург, Германия
Фосфат буферизованный солевым раствором	Life technologies GmbH, Дармштадт, Германия		pH 7,4, стерильные
пипетки	Eppendorf AG, Гамбург, Германия		10&микро; l/100&микро; l/200&микро; l/1,000&микро; l
Головки для дозирования	Eppendorf AG, Гамбург, Германия
Серологическая пипетка	Greiner Bio-One GmbH, Фрикенхаузен, Германия		Cellstar 5 мл, 10 мл
Аспиратор	Integra bioscience, Фернвальд, Германия		Vacusafe comfort
Хирургические ножницы	Word Precision Instruments, Inc., Сарасота, США
Шприц	B. Braun, Melsungen AG, Мельзунген, Германия		1 мл Omnifix® -F инсулиновый шприц
Пробирки с колпачком	Greiner bio one GmbH, Фрикенхаузен, Германия		15 мл/50 мл Пробирки Cellstar
Ванна с теплой водой	Julabo Labortechnik GmbH, Зельбах, Германия		Julabo SW22