Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Органотипической срез культуры для изучения постнатального нейрогенеза

12.3K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/52353

⸱

4 марта 2015 г.

 ,  ,  , 
1Department of Physiology, University of Toronto, 2Institute of Anatomy and Cell Biology, School of Medicine, National Yang-Ming University, 3Department of Education and Research, Taipei City Hospital

В этой статье

Краткое содержание

Здесь мы опишем технику для изучения гиппокампа послеродовой нейрогенез помощью органотипической технику ломтик культуры. Этот метод позволяет для манипуляций в пробирке нейрогенез и позволяет прямое применение фармакологических препаратов в культурной гиппокампа.

Аннотация

Здесь мы опишем технику для изучения гиппокампа послеродовой нейрогенез в мозге грызунов при помощи органотипической технику ломтик культуры. Этот метод сохраняет характерный топографическую морфологии гиппокампа, позволяя прямое применение фармакологических препаратов для развивающихся зубчатой ​​извилине гиппокампа. Кроме того, срез культуры может поддерживаться до 4 недель и тем самым позволяют изучать процесс созревания новорожденных нейронов гранул. Срез культуры обеспечения эффективного фармакологического манипуляции срезах гиппокампа, исключая сложные переменные, такие как неопределенности, связанные с глубокой анатомической локализации гиппокампа, а также гематоэнцефалический барьер. По этим причинам, мы стремились оптимизировать органотипической культур ломтик специально для послеродового исследования нейрогенеза.

Введение

Взрослый нейрогенез в гиппокампе млекопитающих представляет собой замечательный пример врожденной способности мозга к приспособляемости и пластичности. Зубчатые гранулярные клетки (DGC) генерируются из возобновляемого пула нейронных клеток-предшественников в зубчатой извилине гиппокампа, которая является одной из двух хорошо охарактеризованных в настоящее время нейрогенных областей в мозге млекопитающих и считается особенно важной для обучения и памяти. Гиппокамп является частью лимбической системы и имеет глубокое расположение в мозге млекопитающих, что делает его сложной мишенью для точных фармакологических манипуляций. Кроме того, аберрантный нейрогенез связан с такими состояниями, как эпилепсия, шизофрения и болезнь Альцгеймера, что вызвало интерес к пониманию влияния различных фармакологических агентов на созревание и выживание новорожденных нейронов. Различие между постнатальным и взрослым нейрогенезом размыто, и предыдущие исследования показали, что многие особенности развития нейронов in vivo в раннем постнатальном периоде и во взросломвозрасте схожи. Здесь мы делаем акцент на постнатальном нейрогенезе и предполагаем возможные его применения к нейрогенезу взрослых.

Органотипические культуры срезов обеспечивают эффективный метод in vitro для изучения различных физиологических свойств гиппокампа млекопитающих. Ценность культур срезов, приготовленных из мозгов грызунов, можно свести к трем основным качествам: 1) протокол прост и требует легкодоступных материалов; 2) срезные культуры позволяют проводить фармакологические исследования, которые устраняют сложные переменные, такие как глубокое анатомическое расположение гиппокампа, и обходят гематоэнцефалический барьер1; и 3) хорошо охарактеризованная структура гиппокампа и трисинаптической цепи сохранена2. Предыдущие исследователи использовали органотипическую культуру гиппокампа для изучения синаптического развития и физиологии3,4, глиогенеза5-7, ишемического повреждения мозга8,9, нейропротекции и нейрорепарации10-12, а также эпилепсии13-15. Культуры срезов также могут обеспечить полезную модельную систему, позволяющую отслеживать развитие клеток в сочетании с мечением клеток зеленым флуоресцентным белком (GFP) или другими жизненно важными маркерами.

Культуры срезов также ранее использовались для изучения постнатального нейрогенеза гиппокампа16-19, но одним из важных факторов в большинстве этих исследований является хорошо описанная дегенерация, которая возникает в результате эксплантации тканей у взрослых животных примерно через 2 недели in vitro20,21. По этой причине культуры срезов обычно получают от мышей или детенышей крыс в раннем постнатальном периоде (P5-P10), что позволяет использовать улучшенную жизнеспособность ткани мозга в раннем постнатальном периоде для культивирования22. В то время как предыдущие исследования показали, что ранний постнатальный и взрослый гиппокамп различаются в отношении синаптической физиологии и экспрессии специфических подтипов нейронов23,24, существует существенная консервация хореографической программы развития, через которую проходят зубчатые грануляторные клетки новорожденного в периодсозревания. Кроме того, недавние исследования показали, что физиологические характеристики новорожденных ДГК в культуре очень похожи на незрелые нейроны в препарате острого среза гиппокампа16.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: Все процедуры на животных соответствовала здоровья и благополучия руководящих принципов животных кафедры сравнительной медицины в университете Торонто.

1. Подготовка срезов гиппокампа

  1. Стерилизовать следующие инструменты применением сухого автоклав при 125 ° C: Скальпель ручку (# 3) (2), установленного образца щипцы, большой (1), Малый диссектор ножницами (под углом в сторону) (1), Micro ложка (ложка и плоским шпатель концы) (1), Микро-шпатели (округлые и округлые конические концы) (2), Тонкая кисть (1), Пожарная полированные пипетки Пастера (2), марлевые квадраты, 2 х 2 дюйма (5).
  2. Когда стерильной, вводятся инструменты в стерильный контейнер и держать крытая до использования. Непосредственно перед рассечением, погружают инструменты в 70% -ном растворе этанола.
  3. Подготовка культуры пластину 6-а с культурой вставки перед началом процедуры вскрытия путем добавления 1 мл культуральной среды / лунку и хранения пластину в инкубаторе при 35 ° C Aй 5% СО 2.

2. Организовать рассечение инструментов в капот Стерильный ламинарный поток

  1. Спрей капот ламинарного потока с 70% этанола и удалить стерилизованные рассечение инструментов от алкоголя. Разрешить инструменты, чтобы высушить во время отдыха на стерильную чашку Петри, чтобы избежать контакта между алкоголем и расчлененный мозговой ткани.
  2. Депозит 5-7 мл стерильной ледяной рассекает раствора в 2 больших стерильные чашки Петри. Один блюдо будет охладить и очистить голову (Dirty), другой для охлаждения и промывки зачерпнул мозг (чистый). Поместите стерильную фильтровальную бумагу в одном из тарелки крышками Петри для рассечения из мозга.
  3. Поместите небольшое, стерилизованное фильтровальную бумагу в одном из небольшой чашки Петри крышкой для рассечения из гиппокампа. Депозит 3-5 мл стерилизованной охлажденному льдом раствору вскрытии в два небольших стерильные чашки Петри. Один блюдо будет держать зачерпнул гиппокамп, продержится разделы в процессе разделения гиппокампа разделовпод микроскопом рассечение.
  4. Подготовка ткани вертолет лентой кусок стерилизованной фильтровальной бумаги на сцену резки и монтажа стерильную лезвие. Смочите фильтровальную бумагу со стерилизованным раствором вскрытии.
  5. Спрей чистой био-мешок с алкоголем и поместить его в ламинарный поток чистой поверхности.

3. гиппокампа Вскрытие

  1. Спрей крысят P7 Sprague Dawley с 70% этанола за пределами ламинарного потока чистой скамейке и быстро обезглавить животное с использованием больших стерильные хирургические ножницы внутри скамейке ламинарного потока. Пусть головки падение в охлажденному льдом раствору вскрытии в одном из чашек Петри.
  2. В чашке Петри, смыть кровь и быстро передавать с головы до стерилизованной фильтровальной бумаги, брюшной стороне вниз.
  3. Использование скальпеля, разрезать вдоль спинной поверхности в сагиттальной плоскости, чтобы выставить основной череп. Вырезать через кожу, но не основной кости, который является мягким и легко проницаемой у крыс тего возраст. Отложите эту «грязную» скальпель и не использовать на ткани головного мозга.
  4. Использование маленькие ножницы диссектора (расположенные под углом в сторону) и щипцы, разрезать череп вдоль сагиттального шва черепа, чтобы темени, анатомическую точку на черепе, где венечного шва пересекается перпендикулярно от сагиттального шва. Используйте пинцет, чтобы вытащить черепа закрылки вверх и в сторону от средней линии черепа.
  5. Поместите микро ложку на нижней части головного мозга, под ствола мозга, чтобы осторожно поднимите мозга из черепа. Поднимите мозг, чтобы разоблачить зрительные нервы и обонятельной луковицы на базальной поверхности мозга. Сокращение этих структур с маленькими ножницами, чтобы полностью отделить мозг от черепа. Снимите и передать нетронутыми мозга к другой большой чашке Петри, содержащей ледяной решение рассекает.
  6. Использование микро ложку, передача мозг небольшой крышкой чашки Петри, содержащей стерильную фильтровальную бумагу. С стерильной пастеровской пипетки, промыть мозг с помощью нескольких капель DISресекающихся решение сохранить ткани влажным.
  7. Использование "чистой" лезвие скальпеля вырезать два полушария друг от друга. Трансфер левое полушарие обратно в большую чашку Петри с микро ложкой и поместите полушария Пиа стороной вниз в ледяной рассекает решение для последующего использования.
  8. Просмотр медиальной поверхности правого полушария и определить края свода, известного полосу белого вещества вдоль медиального края гиппокампа. Используя стерильный скальпель, чтобы сагиттальный разрез через свод, но будьте осторожны, потому что только 0,5 см от кончика скальпеля будет достаточным, чтобы разрезать свода.
  9. Использование 2 микро-лопатки, удалить первый гиппокамп от правого полушария, помещая правой руки шпатель на стволе головного мозга и подъема лежащего кору с левой лопаткой. Аккуратно поднимите мозга, чтобы выявить бокового желудочка и медиальной поверхности гиппокампа. Белый изогнутые линии, бахромка, теперь должны быть видны.
  10. Совместите кривизну шпателем с Кервары из бахромка и слегка нажмите на шпатель под бахромка. Вставьте шпатель влево и ездить по ростральной-каудальном оси, а затем поднимите шпателем в направлении спинного удалить гиппокамп.
  11. Передача гиппокамп к 2-й небольшой чашки Петри с охлажденному льдом раствору вскрытии. Повторите ту же процедуру на левом полушарии, чтобы удалить левую гиппокамп.
  12. Использование микро шпателя, тщательно передачи гиппокампа на сцену ткани измельчителя. Расположить их рядом и параллельно друг другу и перпендикулярно к оси прерывателя лезвия. Используйте кисть, чтобы расположить ткань и добавить несколько капель вскрытии решения на верхней части гиппокампа.
  13. Отрежьте ткань в 400 мкм ломтиками, не останавливаясь, чтобы удалить отдельные кусочки (как правило, они не будут придерживаться лезвия). После Вся гиппокамп был сокращен, используйте кисть, чтобы мягко перевести к участку 2-й небольшой чашке Петри с рассечение решения.
  14. Под объявлениемissecting микроскоп, осторожно отделите плавающие фрагменты Используя amicro-шпатель и кисть.
  15. Снимите заранее подготовленный культуры пластины с культурой вставкой из инкубатора и место в ламинарном потоке.
  16. Использование огневой полировкой пипетки Пастера, рисовать 4-5 ломтика в пипетку и передачи ломтиками апикальной поверхности культура вставки мембраны. Затем отрегулируйте расположение с кистью и оставить пространство между отдельными секциями и границы культуры вставки.
  17. С помощью стерильной пипетки Пастера, удалить избыток рассекает раствор из апикальной поверхности мембраны.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При удалении решение не привлекать срезов ткани в пипетку. Кроме того, с помощью обычной пипетки (P200 или P1000) с стерилизованных наконечники пипеток медленно удалить решение.
  18. Место культуры пластины с содержащей сыворотку культуральной среды и в срезах гиппокампа обратно в инкубатор при 35 ° С и 5% СО 2.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если эксперимент звонкидля создания культур от нескольких животных, тщательно очистить ламинарного потока чистой скамейке между вскрытия. Вернуться инструменты, чтобы спиртового раствора и заменить все чашках Петри, фильтровальную бумагу и стерильные лезвия до второго вскрытия.

4. Питание и обслуживание Органотипической фрагменты

  1. Кормовые культуры в стерильной ламинарного потока чистой скамейке.
  2. Выполнение первого кормления культивируемых участках 2 дней после вскрытия. Отберите старый культуральной среды с использованием стерилизованную стеклянную пипетку.
  3. Используйте стерильные 5 мл серологические пипетки для добавления 1 мл свежей, стерильной, не содержащей сыворотки среде, содержащей в лунки.
  4. Аккуратно поставьте культуры вставки и заботиться, чтобы удалить воздушные пузырьки, которые могли образоваться под поверхности мембраны.
  5. После первого кормления, изменить средний через день.

5. Инкубация ткани Ломтики тимидином аналогов Этикетка новорожденных Нейроны

  1. С целью изучениясозревание и интеграция зубчатой ​​зернистых клеток в гиппокампе, инкубировать органотипической ломтики с аналог тимидина, таким как бромдезоксиуридин (BrdU) или Chlorodeoxyuridine (CldU). Здесь мы используем CldU из-за его высокой растворимости в солевом растворе.
  2. После 3DIV, добавить 1 мкл 10 мг / мл CldU маточного раствора в физиологическом растворе в 1 мл культуральной среды до конечной концентрации 10 мкг / мл. Если используется BrdU, исправить концентрацию различий в молекулярной массе. Добавить среду с CldU с культурой скважин и инкубировать ткани с CldU среде, содержащей в течение 2 ч при 35 ° С.
  3. После 2 ч инкубации при 35 ° С, удалить CldU среде, содержащей и заменить регулярной среде подачи, чтобы возобновить нормальный график подачи (описанной выше).

6. Ткань Фиксация и хранение

  1. Создать график для применения процедуры и фиксации образцов тканей перед началом культуры экспериментов (рис 2б).
  2. в заданном день после вскрытия, подготовки следующих в лабораторных вытяжном шкафу: 10-50 мл химический стакан, содержащий 4% параформальдегида (PFA) в фосфатном буферном солевом растворе (PBS); пустой стакан выброшенные культуральной среде; небольшие щипцы; и 1000 мл пипетки с одноразовыми наконечниками.
  3. Снимите культуры пластину (ы) из инкубационной камеры и передачи в вытяжном шкафу. Наклоните отдельных скважин пластины-вставки пинцетом. Затем, с помощью пипетки, чтобы удалить культуральную среду и перенос в стакан утилизации. Наклоните культуры пластины под углом, чтобы обеспечить, что все культуры среду удаляют.
  4. Завершение удаления среды для одного культурального планшета одновременно. Когда среда была удалена, добавьте 1 мл 4% PFA для каждой культуры хорошо и печатью луночного планшета с парафином. Повторите столько культуральных планшетах, при необходимости, и передачи пластин в холодильнике при 4 ° С в течение 24 ч.
  5. После 24 часов, подготовить следующее в вытяжном шкафу: 10-50 мл химический стакан, содержащий 0,1% азид натрия в PBS; пустоМЕНЗУРКУ выброшенные PFA (соблюдать меры предосторожности по безопасности, в которой удаление токсичных веществ); небольшие щипцы; и 1000 мл пипетки с одноразовыми наконечниками.
  6. Следуйте указаниям, приведенным в 6.4 для добавления PFA, но добавить 1 мл PBS с азида натрия вместо этого. После того, как полностью переданы, уплотнение луночные планшеты для использования в будущем путем обертывания краев в парафином и хранить в холодильнике при 4 ° С.

7. Структурирование ткани для иммуногистохимии

  1. Выполните ткани секционирования с помощью vibratome. Следующая серия шагов поможет максимизировать выход пригодных срезов ткани органотипических культур.
    Примечание: Сразу же после вскрытия гиппокампа и обшивки ломтиками, ткань имеет толщину примерно 400 мкм. Тем не менее, через 2-3 недели в инкубационной камере, кусочки ткани начнет выравниваться, в результате чего в конечной толщины сечения 150-300 мкм.
  2. Подготовьте следующие пункты в раздел культурного ткани: A # 11 скальпель бобременял и обрабатывать, стекло чашку Петри, содержащую ледяной PBS, микро-рассечение пинцет и чистую этап vibratome резки монтировать ткани.
  3. Использование скальпель, чтобы сократить тщательно по периметру круговой вставки мембраны таким образом, что он может быть отделен от пластикового корпуса вставки. Оставьте достаточно места между культурной фрагмента и скальпеля.
  4. Передача удаленные вставки мембраны в чашку Петри, содержащую PBS. После промывки в PBS, использовать щипцы для передачи мембрану на монтажном этапе vibratome.
  5. Затем, используя скальпель, чтобы устранить излишки мембраны, окружающей культурные кусочками и отрезать излишки материала, чтобы создать чистые края. Этот шаг обеспечит мембрану является плоской и может легко прилипают к режущей поверхности.
  6. Поместите 1-2 капли клея на сцене vibratome резки и распространение в ровным слоем с помощью иглы 22 G. Распространение клея в форме прямоугольника с длинной кромке параллельно режущей лопасти vibratome. Выполните этот шагбыстро, чтобы предотвратить клей от высыхания.
  7. Используйте пинцет, чтобы передать обрезанную мембрану, содержащую срезах гиппокампа на сцену резки и аккуратно поместите мембрану на клей и убедитесь, что нет пузырьков воздуха.
  8. Как суперклей сохнет, передача этап vibratome с клееного мембраны обратно в PBS, содержащем Петри. Подготовка лезвие vibratome и 48-луночного планшета азид, содержащий натрия для хранения срезов тканей.
  9. Использование vibratome генерировать 30 мкм секций Органотипической среза ткани и передачи в 48-луночный планшет, содержащий азид натрия для хранения и последующего иммуногистохимического окрашивания.
  10. Обратитесь к ранее существовавшего протоколы для иммуногистохимического окрашивания 26,29.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Определение, если органотипической культуры были бы пригодны для нейрогенез исследований, необходимых, чтобы они удовлетворяли двум критериям: 1), что ломтики сохранить характерные морфологические особенности срезах гиппокампа после 10-21 дней в пробирке (DIV), и 2) что новорожденные РСК может быть количественно с использованием стандартных иммуногистохимических методов, обычно используемые во взрослой исследований нейрогенез. Что касается первого критерия, 1А и 1В выделить сох...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

После CldU (BrdU) или введения, график применения фармакологических агентов могут быть выбраны для целевой новорожденных РСК в течение определенных окон развития. Например, гипотетический агент может быть применен во второй инъекции неделю после CldU, который предложил совпадают с возрастом незрелых нейронов, которые находятся на стадии развития, где ГАМК деполяризующими. Будущие исследования, использующие этот протокол может адаптировать фармакологический агент и окно экспозиции «портной» подход к конкретной эксперимен...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

Эта работа была поддержана исследовательским грантом MOP 119271 JMW от Канадского института исследований в области здравоохранения. Авторы хотели бы поблагодарить г-жу Яо Фан Тан за ее выдающуюся техническую помощь.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
5-хлор-2'-дезоксиуридин (CldU)MP Биомедицинские 105478опасные, канцерогенные
вкладыши для клеточных культур, диаметр 30 мм, 0,4 и микро; m размер порThermo scientific Nuclon 140660на этих вставках обеспечивает лучшую адгезию тканей и улучшает качество среза.
Конические центрифужные пробирки (стерильные)Fisher Scientific14-432-22
Диссекторные ножницы (под углом в сторону)Fine Science Tools 14082-09
Минимальная необходимая среда (MEM)Gibco11095; жидкостьХранить при температуре 4 °°; C
Eclipse Ni-U флуоресцентный микроскопNikon
Клей для тканиKrazy GlueKG585Используйте минимальное количество клея для достижения адгезии, так как любая ткань, подвергшаяся воздействию клея, будет непригодна для IHC.
Хэнк s Сбалансированный солевой раствор (HBSS) (500 мл)Gibco14025-092Хранить при 4 ° C
Horse Serum Heat Inactivated (500 мл)Gibco16050-122Сделайте 50 мл аликвот и храните при -20 °°; C
KimwipesKimberly-ClarkeTW 31KYPBX
Модифицированные стеклянные пипетки (дно пипетки Пастера удалено и края сглажены пламенем Бунзена)
Чашка Петри (100 мм x 15 мм) и (60 мм x 15 мм)Fisher BrandFB0875712 и FB0875713A
#11 Инструменты для тонкой науки10011-00
Ручка скальпеля # 3Fine Научные инструменты10003-12
Серологические пипеткиSorfa Medical Plastic Co.P8050
Щипцы стандартной формыFine Science Tools11000-12
Стерильный вакуумный фильтрThermo-Scientific565-0020
Хирургические ножницыFine Science Tools14054-13
Фильтрующий блок с приводом от шприцаMillipore-MillexSLGP033RS
Измельчитель тканей с подвижной ступеньюStoelting& НБСП;51425
с тонким кончиком
Дельта-покрытие Лезвия скальпеля Кисть

Ссылки

  1. Buchs, P. A., Stoppini, L., Muller, D. Structural modifications associated with synaptic development in area CA1 of rat hippocampal organotypic cultures. Brain research. Developmental Brain Research. 71 (1), 81-91 (1993).
  2. Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. Journal of Neuroscience Methods. 37 (2), 173-182 (1991).
  3. Opitz-Araya, X., Barria, A. Organotypic hippocampal slice cultures. Journal of Visualized Experiments. (48), (2011).
  4. Muller, D., Buchs, P. A., Stoppini, L. Time course of synaptic development in hippocampal organotypic cultures. Developmental Brain Research. 71 (1), 93-100 (1993).
  5. Rio, J. A., Heimrich, B., Soriano, E., Schwegler, H., Frotscher, M. Proliferation and differentiation of glial fibrillary acidic protein-immunoreactive glial cells in organotypic slice cultures of rat hippocampus. Neuroscience. 43 (2-3), 335-347 (1991).
  6. Ziemka-Nalecz, M., Stanaszek, L., Zalewska, T. Oxygen-glucose deprivation promotes gliogenesis and microglia activation in organotypic hippocampal slice culture: involvement of metalloproteinases. Acta Neurobiologiae Experimentalis. 73 (1), 130-142 (2013).
  7. Subramanian, L., et al. Transcription factor Lhx2 is necessary and sufficient to suppress astrogliogenesis and promote neurogenesis in the developing hippocampus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (27), E265-E274 (2011).
  8. Strassburger, M., Braun, H., Reymann, K. G. Anti-inflammatory treatment with the p38 mitogen-activated protein kinase inhibitor SB239063 is neuroprotective, decreases the number of activated microglia and facilitates neurogenesis in oxygen-glucose-deprived hippocampal slice cultures. European Journal Of Pharmacology. 592 (1-3), 55-61 (2008).
  9. Sadgrove, M. P., Chad, J. E., Gray, W. P. Kainic acid induces rapid cell death followed by transiently reduced cell proliferation in the immature granule cell layer of rat organotypic hippocampal slice cultures. Brain Research. 1035 (2), 111-119 (2005).
  10. Wise-Faberowski, L., Robinson, P. N., Rich, S., Warner, D. S. Oxygen and glucose deprivation in an organotypic hippocampal slice model of the developing rat brain: the effects on N-methyl-D-aspartate subunit composition. Anesthesia and Analgesia. 109 (1), 205-210 (2009).
  11. Cho, S., Wood, A., Brain Bowlby, M. R. slices as models for neurodegenerative disease and screening platforms to identify novel therapeutics. Current Neuropharmacology. 5 (1), 19-33 (2007).
  12. Noraberg, J., et al. Organotypic hippocampal slice cultures for studies of brain damage, neuroprotection and neurorepair. Current Drug Targets. CNS And Neurological Disorders. 4 (4), 435-452 (2005).
  13. Berdichevsky, Y., et al. PI3K-Akt signaling activates mTOR-mediated epileptogenesis in organotypic hippocampal culture model of post-traumatic epilepsy. The Journal Of Neuroscience : The Official Journal Of The Society For Neuroscience. 33 (21), 9056-9067 (2013).
  14. Koyama, R., et al. GABAergic excitation after febrile seizures induces ectopic granule cells and adult epilepsy. Nature Medicine. 18 (8), 1271(2012).
  15. Staley, K. J., White, A., Dudek, F. E. Interictal spikes: harbingers or causes of epilepsy. Neuroscience Letters. 497 (3), 247-250 (2011).
  16. Lee, H., Lee, D., Park, C. H., Ho, W. K., Lee, S. H. GABA mediates the network activity-dependent facilitation of axonal outgrowth from the newborn granule cells in the early postnatal rat hippocampus. The European Journal Of Neuroscience. 36 (6), 2743-2752 (2012).
  17. Raineteau, O., et al. Conditional labeling of newborn granule cells to visualize their integration into established circuits in hippocampal slice cultures. Molecular and Cellular Neurosciences. 32 (4), 344-355 (2006).
  18. Raineteau, O., Rietschin, L., Gradwohl, G., Guillemot, F., Gahwiler, B. H. Neurogenesis in hippocampal slice cultures. Molecular And Cellular Neurosciences. 26 (2), 241-250 (2004).
  19. Kamada, M., et al. Intrinsic and spontaneous neurogenesis in the postnatal slice culture of rat hippocampus. The European Journal Of Neuroscience. 20 (10), 2499-2508 (2004).
  20. Kim, H., Kim, E., Park, M., Lee, E., Namkoong, K. Organotypic hippocampal slice culture from the adult mouse brain: a versatile tool for translational neuropsychopharmacology. Progress in Neuro-Psychopharmacology & Biological Psychiatry. 41, 36-43 (2013).
  21. Legradi, A., Varszegi, S., Szigeti, C., Gulya, K. Adult rat hippocampal slices as in vitro models for neurodegeneration: Studies on cell viability and apoptotic processes. Brain Research Bulletin. 84 (1), 39-44 (2011).
  22. Sadgrove, M. P., Laskowski, A., Gray, W. P. Examination of granule layer cell count, cell density, and single-pulse BrdU incorporation in rat organotypic hippocampal slice cultures with respect to culture medium, septotemporal position, and time in vitro. The Journal of Comparative Neurology. 497 (3), 397-415 (2006).
  23. Mielke, J. G., et al. Cytoskeletal, synaptic, and nuclear protein changes associated with rat interface organotypic hippocampal slice culture development. Developmental Brain Research. 160 (2), 275-286 (2005).
  24. Fabian-Fine, R., Volknandt, W., Fine, A., Stewart, M. G. Age-dependent pre- and postsynaptic distribution of AMPA receptors at synapses in CA3 stratum radiatum of hippocampal slice cultures compared with intact brain. European Journal of Neuroscience. 12 (10), 3687-3700 (2000).
  25. Laplagne, D. A., et al. Functional convergence of neurons generated in the developing and adult hippocampus. PLoS Biology. 4 (12), e409(2006).
  26. McDonald, H. Y., Wojtowicz, J. M. Dynamics of neurogenesis in the dentate gyrus of adult rats. Neuroscience Letters. 385 (1), 70-75 (2005).
  27. Stone, S. S., et al. Functional convergence of developmentally and adult-generated granule cells in dentate gyrus circuits supporting hippocampus-dependent memory. Hippocampus. 21 (12), 1348-1362 (2011).
  28. Wang, S., Scott, B. W., Wojtowicz, J. M. Heterogenous properties of dentate granule neurons in the adult rat. Journal of Neurobiology. 42 (2), 248-257 (2000).
  29. Wojtowicz, J. M., Kee, N. BrdU assay for neurogenesis in rodents. Nature Protocols. 1 (3), 1399-1405 (2006).
  30. Fritsch, R. S. E. R., Weibel, E. R. Stereological Methods, Vol. 1: Practical Methods for Biological Morphometry. Zeitschrift für Allgemeine Mikrobiologie. 21 (8), 630-630 (1981).
  31. Bunk, E. C., Konig, H. G., Bonner, H. P., Kirby, B. P., Prehn, J. H. NMDA-induced injury of mouse organotypic hippocampal slice cultures triggers delayed neuroblast proliferation in the dentate gyrus: an in vitro model for the study of neural precursor cell proliferation. Brain Research. 1359, 22-32 (2010).
  32. Kolb, B., Pedersen, B., Ballermann, M., Gibb, R., Whishaw, I. Q. Embryonic and postnatal injections of bromodeoxyuridine produce age-dependent morphological and behavioral abnormalities. The Journal Of Neuroscience : The Official Journal Of The Society For Neuroscience. 19 (6), 2337-2346 (1999).
  33. Morris, S. M. The genetic toxicology of 5-bromodeoxyuridine in mammalian cells. Mutation Research. 258 (2), 161-188 (1991).
  34. Bannigan, J., Langman, J. The cellular effect of 5-bromodeoxyuridine on the mammalian embryo. Journal Of Embryology And Experimental Morphology. 50, 123-135 (1979).
  35. Breunig, J. J., Arellano, J. I., Macklis, J. D., Rakic, P. Everything that glitters isn't gold: a critical review of postnatal neural precursor analyses. Cell Stem Cell. 1 (6), 612-627 (2007).
  36. Duque, A., Rakic, P. Different effects of bromodeoxyuridine and [3H]thymidine incorporation into DNA on cell proliferation, position, and fate. The Journal Of Neuroscience : The Official Journal Of The Society For Neuroscience. 31 (42), 15205-15217 (2011).
  37. Namba, T., Mochizuki, H., Onodera, M., Namiki, H., Seki, T. Postnatal neurogenesis in hippocampal slice cultures: early in vitro labeling of neural precursor cells leads to efficient neuronal production. Journal of Neuroscience Research. 85 (8), 1704-1712 (2007).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Больше статей

Органотипическое культивирование срезовнейрогенез в гиппокампезубчатая извилинамаркировка митотических маркеровиммуногистохимическое окрашиваниесекционирование тканейсекционирование на вибратомеанализ подсчета клетокфармакологическое воздействиепостнатальное созревание нейронов
Органотипической срез культуры для изучения постнатального нейрогенеза
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.