Соотнося геноспецифических метилирования ДНК изменения с выражением и транскрипционной активности астроцитарных KCNJ10 (Kir4.1)

Summary

Метилирование ДНК способно поддерживать стабильные уровни экспрессии генов, а также допускать динамические изменения экспрессии генов в ответ на различные стимулы. Мы подробно описываем методы, которые позволяют изучать генспецифичные изменения в метилировании ДНК и влияние этих изменений на экспрессию генов.

Abstract

Метилирование ДНК служит для регуляции экспрессии генов через ковалентное присоединение метильной группы к С5-положению цитозина в цитозин-гуанинеиндинуклеотиде. В то время как метилирование ДНК обеспечивает долгосрочные и стабильные изменения в экспрессии генов, паттерны и уровни метилирования ДНК также подвержены изменениям в зависимости от различных сигналов и стимулов. Таким образом, метилирование ДНК функционирует как мощный и динамичный регулятор экспрессии генов. Изучение нейроэпигенетики выявило множество физиологических и патологических состояний, которые связаны как с глобальными, так и с геноспецифическими изменениями метилирования ДНК. В частности, поразительные корреляции между изменениями в экспрессии генов и метилированием ДНК существуют при нейропсихиатрических и нейродегенеративных расстройствах, во время синаптической пластичности и после повреждения ЦНС. Однако, поскольку область нейроэпигенетики продолжает расширять свое понимание роли метилирования ДНК в физиологии ЦНС, определение причинно-следственных связей в отношении изменений в экспрессии генов и метилирования ДНК имеет важное значение. Более того, в более широкой области нейробиологии наличие обширных различий между регионами и клетками требует методов, которые учитывают эти различия при изучении транскриптома, протеома и эпигенома. Здесь мы описываем FACS-сортировку кортикальных астроцитов, которая позволяет впоследствии исследовать как транскрипцию РНК, так и метилирование ДНК. Кроме того, мы подробно описываем метод изучения метилирования ДНК, чувствительного к метилированию анализа расплава с высоким разрешением (MS-HRMA), а также анализа промотора люциферазы. Используя эти комбинированные методы, можно не только исследовать коррелятивные изменения между метилированием ДНК и экспрессией генов, но и непосредственно оценить, являются ли изменения в статусе метилирования ДНК данного участка гена достаточными для влияния на транскрипционную активность.

Introduction

Эпигенетика — это изучение химических модификаций, которые могут повлиять на транскрипционную активность генома. По существу, без изменения последовательности ДНК эпигенетические модификации, такие как метилирование ДНК, ацетилирование гистонов и метилирование гистонов, достаточны для обратимого изменения паттернов ^{экспрессии} генов. Метилирование ДНК, мощный регулятор экспрессии генов, является наиболее хорошо охарактеризованной эпигенетической модификацией. Метилирование ДНК — это ковалентное прикрепление метильных групп к С5-положению цитозина, обычно цитозина цитозин-гуаниндинуклеотида, также известного как сайт CpG. Области с высокой плотностью сайтов CpG известны как острова CpG (CGI). CGI часто связаны с сайтами транскрипционного старта (TSS) и промоторами генов ^1-3. Таким образом, в то время как изменения в метилировании ДНК в CGI не всегда сопровождаются изменениями в клеточной экспрессии или функции, изменения в метилировании ДНК в CGI могут оказывать мощное регулирование транскрипционной ^{активности.}

Исторически было замечено, что метилирование ДНК играет важную роль в эмбриогенезе, импринтинге и развитии, с небольшими изменениями в уровнях метилирования ДНК, происходящими в постмитотических клетках (за исключением изменений в генах, связанных с раком) ^4,5. Тем не менее, область нейроэпигенетики высветила важную роль метилирования ДНК, не связанную с развитием. В частности, когнитивная эпигенетика переопределила метилирование ДНК как высокопластичный механизм, являющийся неотъемлемой частью опосредования как транскрипционной активации, так и репрессии генов, необходимых для процесса обучения ^{и памяти.} Помимо когнитивной эпигенетики, исследования, моделирующие ишемическое повреждение и нейропатическую боль, характеризуют метилирование ДНК как лабильный механизм, который быстро реагирует на различные повреждения ЦНС. Что касается астроцитов, несколько линий данных свидетельствуют о том, что метилирование ДНК играет важную роль в астроглегенезе. Fan et al., обнаружили, что условный KO DNMT1 в нейральных клетках-предшественниках (NPC) приводит к преждевременному развитию астроцитов, согласующихся с глобальным состоянием гипометилирования^. Кроме того, Perisic et al. пришли к выводу о том, что дифференциальные уровни метилирования ДНК промотора GLT-1 опосредуют дифференциальные уровни экспрессии транспортера глутамата в коре и мозжечке, подчеркивая роль метилирования ДНК в установлении специфических для областей мозга паттернов ^{экспрессии} астроцитарных генов. В целом, многочисленные исследования подчеркивают динамическую и лабильную природу метилирования ДНК в ЦНС, поскольку было показано, что окружающая среда, лекарства и травмы изменяют метилирование ДНК и ^{часто экспрессию} генов. В совокупности эти нейроэпигенетические исследования указывают на то, что метилирование ДНК является возможной терапевтической мишенью с потенциалом для смягчения различных патологий ЦНС.

По мере того как область эпигенетики расширяет свое понимание роли метилирования ДНК в развитии нервной системы и заболеваниях, задача перемещения метилирования ДНК к терапевтической мишени заключается в проведении не только коррелятивных, но и причинных исследований, которые определяют конкретные генные мишени и сайты. Кроме того, изучение изменений в метилировании ДНК, специфичных для области мозга и типа клеток, остается постоянной и достойной времени задачей, уникальной для области нейроэпигенетики. В этом протоколе используются различные методы, включая флуоресцентно-активируемую сортировку клеток (FACS) астроцитов, чувствительный к метилированию анализ расплава с высоким разрешением (MS-HRM) и анализ метилирования люциферазы для исследования статуса метилирования ДНК KCNJ10, гена, который кодирует Kir4.1. Kir4.1 представляет собой глиальный специфический калиевой канал, который демонстрирует как область мозга, так и специфические для клеток паттерны экспрессии в ЦНС ^12-16. Экспрессия Kir4.1 увеличивается при движении из ростральной в каудальную области ЦНС, при этом наибольшая экспрессия наблюдается в спинном мозге ¹⁵. Несмотря на то, что канал экспрессируется в эпендимальных клетках, олигодендроцитах и их предшественниках, Kir4.1 преимущественно экспрессируется в астроцитах и считается необходимым для поддержания гомеостатического уровня калия, а также для поддержки поглощения глутамата путем установки потенциала астроцитарной мембраны покоя на гиперполяризованном -80 мВ ^12,16-19. Важно отметить, что экспрессия Kir4.1 нестатична как во время развития, так и после множественных форм повреждения ЦНС ^20-25. Мы хотели изучить эпигенетическую регуляцию этого канала, в частности, в астроцитах во время развития. Используемые методы предлагают геноспецифический и целенаправленный анализ сайта CpG, который предоставляет причинно-следственные доказательства роли метилирования ДНК в регуляции экспрессии гена KCNJ10. Эти методы могут быть применены и к другим генам.

Protocol

Все животные были обработаны в соответствии с Национальными Институтами Здоровья принципов. Уход и использование комитета животных в университете штата Алабама в Бирмингеме одобрил использование животных.

1. Получение РНК и ДНК из обогащенной астроцитов населения с помощью флуоресцентного Активированный сортировки клеток (FACS) астроцитов из полного ткани головного мозга

1. Седативный животное с _CO 2 в течение 1 мин и затем быстро обезглавить. Проанализируйте кору, как описано в Альбукерке и др, ^26. это не является необходимым для удаления оболочки мозга.
   Примечание: Трансгенные крысы, выражающие EGFP под S100β (астроцитов маркер) промотор были порождены Итакура др ^{27 и} используется для FACS сортировки астроцитов..
2. Подготовьте всю гомогената мозга с использованием папаин комплект диссоциации в нестерильных условиях в соответствии с протоколом производителя. Тепло активировать папаин при 37 ° С на водяной бане в течение 10 мин. Примечание:Папаин решение обеспечивается производителем и содержит L-цистеин и ЭДТА (см таблицу материалов).
   1. Вырезать или Dremel отверстие в верхней части 50 мл коническую пробирку, чтобы трубка проведении 95% O _2: 5% СО ₂ должен быть подан в закрытом коническую пробирку (фиг.1А). Поместите расчлененные кору в 10мм блюдо культуры, содержащие диссоциации СМИ (MEM с добавлением 20 мМ глюкозы и пенициллин / стрептомицин (500 ед / мл) и уравновешенной до 95% O _2: 5% СО ₂₎ и использовать чистую лезвие рубить ткани в 1 х 1 мм ^{2 шт.}
3. Передача ткани с помощью 10 мл эксплуатации Pipetman 50 мл коническую трубку содержащих папаин решение. Разрешить ткани оседают на дне пипетки перед сбросом, чтобы минимизировать количество диссоциации СМИ, перенесенные. Держите папаин решение, уравновешенной 95% O _2: 5% CO _{2 через} поверхность теплообмена газа в течение всего срока инкубации. Не пузырь папаин Solutiна. Выдержите ткани в течение 20 мин в 37 ° С на водяной бане.
4. После инкубации в растворе папаина, растирают ткани в 10 раз с 10 мл пипетки в медленной скорости. Центрифуга подвески облачно клеток при 1000 мкг в течение 5 мин при комнатной температуре.
   1. Равновесие ДНКазы / раствор альбумина ингибитор (предоставляется изготовителем) через поверхность теплообмена газа и повторно приостанавливать осажденные клетки в 3 мл ДНКазы альбумина ингибитор / раствор. Подготовка коммерческих градиент разрывной плотностью, следуя инструкциям производителя.
5. Спин градиент разрывной плотностью в 1000 мкг в течение 6 мин. Изолировать диссоциированных клеток из нижней части трубки всасывания нижнюю гранул с помощью пипетки.
6. Повторное приостановить диссоциированных клеток в 2-3 мл DPBS с 0,02% альбумина бычьей сыворотки и 1 мг / мл ДНКазы или предпочтительных HEPES буферных культуральные среды. Пройдите через 40 мкм фильтр, перед FACS (2А). Держите клетки на льду до сортировки.
   1. Выполните FACS ^28.
   2. Гранул клетки в 1,5 мл центрифужные пробирки при 2000 х г в течение 5 мин при 4 ° С.
      Примечание: осаждали астроциты могут быть использованы немедленно или не хранится в -80 ° С до выделения ДНК.
7. Извлечение РНК и ДНК, используя предпочитаемый метод изоляции ^{29 30.} Оценка РНК и ДНК концентрации и качества с помощью спектрофотометра и Bioanalyzer ^31.
   Примечание: Используйте только высокое качество РНК и ДНК в последующих шагов, 260/280 = 2,0-2,2 и 1,8-1,9 соответственно. Анализ Bioanalyzer важно оценить для деградации РНК или ДНК фрагментации. РНК или ДНК может быть использована немедленно или хранить в -80 ° С или -20 ° С, соответственно, для последующих исследований.

2. Оценка состояния метилирования ДНК гена с использованием Метилирование чувствительных высокого разрешения расплава анализа (MS-HRMA)

1. Введите гена последовательность интерес в привилегированные программного обеспечения онлайн отображения метилирование выявить любые островов CpG в генеинтерес ^32.
   1. Дизайн праймеров против бисульфит преобразуются последовательность ДНК ³³ и усиливать с помощью предпочтительного ДНК-полимеразы в соответствии с протоколом производителя. Проверка усиленный размер продукта путем запуска 1% агарозном геле ДНК при 100 V в течение 45 мин. Хранить грунтовки при концентрации запас 20 мкм, -20 ° С.
2. Бисульфит преобразовать 500-1000 нг ДНК каждого образца и метилированной ДНК, начиная от стандартов 0-100% из тех же видов животных ^34. Образцы элюирования, чтобы обеспечить концентрацию 20 нг / мкл. Проверьте концентрацию бисульфита преобразованного ДНК с помощью спектрофотометра ^31.
3. Настройка 20 мкл реакции для MS-HRM амплификации с использованием предпочтительного ДНК-полимеразы и праймеров в концентрации 5 мкМ в соответствии с таблицей 1 и 2. Выполнить все образцы, включая FACS ДНК и метилированных стандартов, в трех экземплярах.
4. В зависимости от программного обеспечения для анализа, установить до и после запуска и остановки параметрывокруг переходов кривой плавления. Набор предварительно расплава начала и до расплава параметры остановки, так что разница между ними составляет 0,2 - 0,5 ° С. Установите после расплава начало и пост-расплава остановить аналогично. Экстракт пиковые разница температур данные для каждого образца.
5. Использование процентов метилированных стандартов (Y-значение) и соответствующие им средние различия пиковой температуры (X-значение) генерировать уравнение линейной регрессии (3А-В, Таблица 3-4). Используйте этот линейное уравнение регрессии для оценки статуса метилирования неизвестных образцов ^35.

3. Оценка Hyper-метилированных Promoter активность с помощью использования Пробирной люциферазы

1. Определить CpG островки гена-мишени (этап 2.1). ПЦР-амплификации представляющих интерес областей ^{36 и} клона вверх по течению от luc2 люциферазы светляков гена-репортера, чтобы произвести CpG-островков luc2 плазмиды ^37.
2. Линеаризуем 30 мкг CpG-островков luc2 плазмиды через ограничениеФермент пищеварение ^38. Проверьте сайты рестрикции дайджеста и избегать двойных сокращений, используя предпочтительный резака программное обеспечение ^38. Тепло-инактивации ферментов на соответствующем температуре и продолжительности следующие пищеварение в соответствии с протоколом производителя. Минимальная потеря ДНК происходит во время стадии линеаризации.
3. Метилировать линеаризованные плазмиды с использованием CpG-метилазы (M.Sssl) O / N на 30 ° C или оставить необработанной следующее производителя протокол для следующих корректировок кроме.
4. Выполните 50 мкл реакции.
5. Используйте 5 единиц CpG метилазой метилировать 700 нг линеаризованной плазмиды.
6. Запуск реакции O / N для 13-19 часов.
7. После CpG реакции метилазой, выполните очистку ДНК с использованием стандартных, коммерчески доступны силикагель мембраны очистить комплект в соответствии с протоколом производителя. Значительные потери ДНК происходят следующие CpG метилазой реакцию, потеря 30-60%.
8. Убедитесь, метилирование плазмид с помощью ограничения Хпа II дайджеста.
9. Принимать по 1 мкг метилированного или не метилированной ДНК и переваривают с ограничением Хпа II в течение 1 часа при 37 ° С. Используйте 5-10 единиц Хпа II для каждого мкг ДНК. После Хпа II пищеварения, выполните очистку ДНК с использованием предпочтительного, в продаже силикагель мембраны очистить комплект. Выполнить обе CpG метилированных и не метилированные плазмиды на 1% геле агарозы ДНК в ТАЕ буфере TBE или на 100 В в течение 45 мин для визуализации (фиг.4В).
10. Тема и метилированных и не-метилированных плазмид двойного расщепления с соответствующими ферментами рестрикции, чтобы освободить полнометражный Люк 2 (вектор) и CpG острова (вставка) Фрагменты ^38. Выполните двойной пищеварения O / N в соответствующей температуре и тепло инактивации ферментов после расщепления в соответствии с протоколом производителя. Минимальная потеря концентрации ДНК происходит во время двойного ограничения дайджеста.
11. Запустите двойным усваивается плазмиды на 1% агарозном геле ДНК при 100 V в течение 1 часа, чтобы позволить разделения ое вектор и вставьте (рис 4C). Внимание. Ношение защитной UV маску, гель разместить ДНК на столе черном свете, чтобы визуализировать полос. На основании размера, акцизного метиловым и не денатурированного вставкой и без метилированным вектора, используя чистую хирургическую лезвие.
12. Гель экстракт ДНК, используя насыщенный фенол, рН 6,6. Вкратце, весят гель, содержащий ДНК вектора или вставки. Использование 100 мкл фенола на 0,1 г геля ДНК. Перемешать гель ДНК в фенол с помощью стекло Dounce гомогенизатора.
13. Добавить хлороформ (используя 1/5 объема фенола) и встряхните образцов в течение 20 сек. Инкубируйте образцы при комнатной температуре в течение 2-3 мин. Центрифуга течение 15 мин при максимальной скорости (16,1 х ​​1000 х г) при 4 ° С.
14. Удалить водный раствор и добавить объем 0.1x 3 м ацетата натрия и 2.5X объема этанола. Инкубируйте образцы в течение 1 ч при -80 ° С. После инкубации удаления этанола и повторно приостанавливать ДНК в 30 мкл буфера предпочтительной. Значительные потери ДНК происходит следующее изоляции вставками и векторы, 30-50% вотпесчаники
15. Re-перевязывать метилированных и не метилированных вставками в не-метилированных вектор с помощью ДНК-лигазы Т4 ^38. Используйте соотношение 1: 4 вектора для вставки на лигирования реакций. Реакция установки в соответствии с инструкциями производителя. Использование общего объема 50 мкл для реакций и инкубируют O / N при -20 ° С или на льду с крышкой над ведро льда.
16. После перевязки, выполните очистку ДНК с использованием предпочтительного, в продаже силикагель мембраны очистить комплект. Значительные потери происходят ДНК после лигирования реакции, приблизительное потери ДНК 30-50%. Проверка повторного лигирования, запустив на 1% агарозном геле ДНК при 100 V в течение 45 мин и оценить концентрацию повторно лигировали плазмид (рис 4D).
17. Трансфекции метилированные или не метилированных плазмид в D54 клеток с использованием коммерческой реагента для трансфекции в соответствии с протоколом производителя. Семенной D54 клеток на 12-луночный планшет при 0,14 ^× 10 6 клеток / лунку.
18. После 24 часов, трансфекции клеток Wiго равные концентрации либо (1) не-CpG-methyated luc2 плазмиды + Renilla или другого вектора управления люциферазы или (2) метилированного CpG-luc2 плазмиды + Renilla или другого вектора управления люциферазы.
19. Разрешить клетки для трансфекции в течение 24 часов перед проведением анализа двойную люциферазы. Выполните анализ в соответствии с инструкциями производителя. Выполните показания, используя люминометра. Читайте каждую лунку в трех экземплярах.
20. Рассчитать соотношение активности люциферазы Firefly, чтобы Renilla или другой контроль активности люциферазы. Нормализовать метилированное Светлячок: управления активности люциферазы к не-метилированных Firefly: управления активности люциферазы путем деления метилированное активность люциферазы не-денатурированного активности люциферазы

Results

Обогащенный население астроцитов была приобретена с помощью FACS сортировки EGFP-S100β трансгенных животных ^27. В связи с ухудшением качества клеток и молекулярных молекул, выделенных из животных старше послеродовой день 50 (p50), животных в возрасте р0-р40 являются оптимальными для подобных экспериментов. Кортикальной тканью был использован для этих экспериментов. Коры от двух до шести животных были объединены вместе. FACS была выполнена в ЗАО Комплексный проточной цитометрии основной комплекс. Сортировка бы...

Discussion

Этот протокол описывает выделение обогащенной популяции астроцитов с помощью FACS, а также различные методы, которые позволяют проводить как коррелятивные, так и причинные исследования между метилированием ДНК и экспрессией генов. Эти методы, используемые по отдельности или в комбинации, особенно полезны для лабораторий, которые работают с тканями с высокой клеточной гетерогенностью или заинтересованы в статусе метилирования ДНК конкретного гена или области гена в сравнении с глобальными изменениями метилирования ДНК. Од...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Система диссоциации папаина	Worthington Biochemical Corporation	LK003150
AllPrep DNA/RNA Mini Kit	Qiagen	80204
Methyl Primer	Applied Biosystems	онлайн	программное обеспечение для локализации CpG Острова
EZ Набор для метилирования ДНК	Zymo Research	D5001
Стандарт калибровки предварительно смешанных материалов	EpiGenDx	80-8060R-премикс
CpG метилаза (M.SSSL)	Zymo Research	E2010
QIAquick Gel Extraction	QIagen	28704	Используется для экстракции геля и очистки ДНК
Ферменты рестрикции	New England BioLabs
NEB cutter	New England BioLabs	онлайн	проверить рестрикцию дайджест сайты
Dual Luciferase Reporter Assay System	Promega	E1910
Luc2 вектор, pGL4.10	Promega	E6651
renilla vector, pGL4.74	Promega	E2241
TD-20/20 Люминометр			Тернера
Lipofectamine LTX and Plus Reagent	Life Technologies	A12621
Фенол, насыщенный pH 6,6/6,9	Fisher Scientific	BP 17501-100
Nanodrop 2000/2000c Спектрофтометр	ThermoScientific
MeltDoctor Master Mix	Life Technologies	4415440
Программное обеспечение для плавления с высоким разрешением (HRM) v2.0	Life Technologies	4397808
программное обеспечение AB SDS v2.3	Life Technologies	онлайн
AB Руководство по началу работы с плавкой с высоким разрешением	Life Technologies	онлайн
AB 7900HT Быстрая система реального времени	Life Technologies