Методическая статья

Грипп Вирус Распространение в куриные эмбрионы

DOI:

10.3791/52421

⸱

19 марта 2015 г.

 , 
1Department of Medicine, Division of Pulmonary and Critical Care Medicine, Women's Guild Lung Institute, Cedars-Sinai Medical Center

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Оплодотворенные куриные яйца широко используются для производства большого количества вируса гриппа А человека, поскольку они обеспечивают удобную и экономически эффективную систему для доказательства высокого выхода вируса.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Инфекция гриппа связана с примерно 36 000 смертей и более 200 000 случаев госпитализации каждый год в Соединенных Штатах. Непрерывное появление новых штаммов вируса гриппа из-за мутации и повторного ассортимента усложняет контроль над вирусом и требует постоянного развития новых лекарственных препаратов и вакцин. Лабораторная исследование гриппа требуется надежный и экономически эффективный способ распространения вируса. Здесь полный протокол, предусмотрена гриппа A распространения вируса в плодородных куриных яиц, которые последовательно дает высокий титр вирусных акций. Вкратце, свободных от патогенов (SPF) оплодотворенные куриные яйца сыворотки инкубировали при 37 ° С и влажности 55-60% в течение 10 - 11 дней. За этот период, развитие эмбриона можно легко контролировать с помощью яиц Candler. Вирус прививки проводят путем инъекции вируса в наличии аллантоидной с помощью иглы. После 2 дней инкубации при 37 ° С, яйцаохлажденные в течение по меньшей мере 4 ч при 4 ° С. Теплый выше мешка воздуха и хориоаллантоисной мембране затем осторожно открывали и аллантоисной жидкости, содержащей вирус собирают. Жидкость очищается от мусора с помощью центрифугирования, аликвоты и переносят в -80 ° С в течение длительного хранения. Большое количество (5-10 мл вируса, содержащих жидкости в яйце) и высокий титр вируса, который, как правило, достигнутые с этим протоколом составил использование яиц для приготовления вируса наш способ выгодно, в частности, для исследований в пробирке, которые требуют больших количествах вируса, в которых необходимы высокие дозы одного и того же вируса складе.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Грипп продолжает оставаться серьезной угрозой для здоровья человека. Это потенциально разрушительными респираторное заболевание с большой глобальное бремя в результате чего до 500000 смертей в мире ежегодно 1. Вирусы гриппа в семье Orthomyxoviridae и нести 8 отрицательной смысле одноцепочечной РНК в их геноме 1,2. Высокая изменчивость (то есть, антигенная "дрейф") вирусного генома предотвращает длительный иммунитет. Кроме того, грипп является более устойчивым к антивирусным препаратам 3.

2009 пандемии гриппа H1N1 подчеркнул все сложные вопросы, связанные с болезнью гриппа (пандемического штамма, против вирусного сопротивления, отложенный вакцина). Вакцинный препарат определяется ежегодно Всемирной организацией здравоохранения для наиболее вероятно патогенных штаммов вируса гриппа (одной для H1N1, H3N2 и гриппа В) 4. Поскольку этот способ основан на предсказанной штамма вируса гриппас, патогенные штаммы иногда неправильно определены и эффективность вакцины резко падает. Кроме того, появление новых штаммов гриппа может обойти эти профилактические программы, вызывающие пандемию болезни 2.

Создание универсальной вакцины гриппа был неуловим 5. Таким образом, исследования должны продолжаться и в понимании патогенеза поражения легких. Для объекта лабораторных исследований, несколько методов были разработаны для выделения вируса и распространения 6. Вирусы гриппа человека могут быть усилены в различных млекопитающих клеточных субстратов. Тем не менее, генерирующие высокий титр вирусов в больших количествах лучше всего достигается в яйцах с эмбрионами. Следующий протокол описывает метод для гриппа A распространения вирусов и хранения из существующих запасов вируса.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ПРИМЕЧАНИЕ: Общие замечания: Выполните все процедуры, связанные с манипуляциями с яйцом в стерильных условиях и стерильно метод следует использовать соответствующим образом. Предварительная очистка всего оборудования с 70% этанола перед использованием. В общем, вирус гриппа прививки и урожай должен быть проведен в BSL-2 лаборатории. Однако, если этот протокол используется для распространения гораздо более патогенных вирусов гриппа (например, пандемии и предпандемические штаммы, штаммы, которые представляют собой опасность для скота и птицы, высоко патогенные штаммы птичьего гриппа, штамм 1918 Н1N1), более высокий уровень биобезопасности и в некоторых случаях, биозащиты меры предосторожности и разрешения не требуется. Комитет местные институциональные биобезопасности должен утвердить все исследования с участием вируса гриппа.

1. Подготовка яйца для прививки

  1. Получить сыворотке свободных от патогенов (SPF) недавно оплодотворенная птичьего яйца из подходящего поставщика. Как правило, используются куриные яйца. Яйца должны быть намиред сразу по прибытии.
  2. После прибытия помещают яйца в увлажненной яйца инкубатора с автоматическим яйца токарем, чтобы повернуть яйца, регулярно. Если автоматическая яйцо токаря нет, вручную поворачивать яйца, по крайней мере 2-3 раза в день (не забудьте надеть перчатки и держать все максимальную стерильность).
  3. Инкубируйте яиц при 37 ° С и 55-60% влажности в течение 10-11 дней.

2. Яйцо Просвечивание

  1. Используйте яичный Candler изучить яйцо против яркого света в темной комнате, чтобы проверить яйца на бесплодия просвечивании примерно через 7 или 8 дней инкубации.
    1. Протрите яйца Candler с 70% этанола. Изменить перчатки часто и дезинфицировать 70% -ным этанолом, чтобы минимизировать риск загрязнения патогенными микроорганизмами.
    2. Удалите яйца из инкубатора и поместить их в пустых упаковок для яиц.
    3. Выключите свет в комнате.
    4. Держа большой конца каждого яйца по одному в отношении Candler.
    5. Соблюдайте яйца всего определитсяе, если он является плодородной или бесплодной.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Тонкие кровеносные сосуды, ведущие к бобовидным эмбриона должны быть четко видны. Неоплодотворенных яиц будет выглядеть как небольшое пятно крови с видимой яичным желтком.
  2. Отменить яйца, которые неоплодотворенных, и вернуть жизнеспособных яиц в инкубатор. Не оставить снаружи яйца в инкубаторе в течение более чем 30 мин. Если статус яйцо не может быть подтверждена, выделите ее и соблюдать его позже.

3. Подготовка Касперского инокулята

  1. Развести вируса гриппа запас до приблизительно 10 3 - 10 4 БОЕ / мл в стерильном PBS, содержащем 10 мМ HEPES (рН 7,4). Критический шаг: Развести вирус Stock непосредственно перед использованием и держите разбавленный вирус на льду все время.

4. гриппа Вирус Прививка с помощью аллантоисной пути

  1. В день введения вируса (день 10 или 11), свечи яйца снова и устранить мертвые эмбрионы. Различают живые эмбрионы отИщу движения внутри яйца.
  2. Удалите три яйца из инкубатора, а также организовать яйца в отдельном держателе с воздушный мешок вверх.
  3. Отметить воздушное пространство из яиц с перманентным маркером.
  4. Вымойте яичной скорлупы над воздушным пространством с 70% этанола.
  5. Положите яйца с воздушным пространством вверх в яйце коробке и в области биобезопасности капот (BSL-2).
  6. Используйте стерильную 18G иглу, чтобы пробить небольшое отверстие в оболочке над воздушной мешка каждого яйца. Будьте осторожны, чтобы не вставить иглу слишком глубоко, чтобы избежать колоть эмбрион или желток.
  7. Составьте разбавленный вирус гриппа в стерильный шприц 1 мл и приложить 22G иглу.
  8. Тщательно продвижения шприц с иглой под углом 45 ° в аллантоидной.
  9. Внедрить 0,2 мл разбавленного вируса гриппа.
  10. Повтор инъекции с двумя другими яиц, а затем выбросить в шприц и иглу.
  11. Печать отверстие каплю клея из клеевого пистолета (или растопленного парафина). Ве осторожны, чтобы клей не просачивается внутрь яйца.
  12. Место яйца обратно в яйца инкубатора воздушное пространство указал вверх.
  13. Повторите шаги 4.2 - 4.12, пока все яйца не были привиты.

5. Время инкубации

  1. Инкубируйте инфицированных яиц без поворота на 37 ° С и ~ 60% влажности.
  2. Выбор оптимального времени инкубации в зависимости от типа вируса гриппа. Выдержите гриппа A в течение 48 ч; инкубировать гриппа В и С в течение 72 ч.

6. гриппа Вирус урожая

  1. После инкубационного периода, охладить яйца при 4 ° С в течение минимум 4 ч (или O / N), чтобы убить зародыш и сужают кровеносные сосуды, чтобы уменьшить риск загрязнения зараженный аллантоисной жидкость с кровью. Для этого, чтобы предотвратить эритроциты поглощать вирус, который снижает выход. Кроме того, охлажденные яйца в течение 30 мин при -20 ° С; Однако это увеличивает риск загрязнения крови.
  2. После того, как яйца были достаточно охлажденные, передавать яйца капюшоном биобезопасности. Положите яйцо в твердой держатель воздушный мешок вверх. Очистите поверхности яйца с 70% этанола.
  3. Используйте стерильные ножницы, чтобы открыть выше воздушного мешка скорлупы. Снимите оболочку вокруг воздушного мешка, стараясь при этом не разрушить хориоаллантойной мембрану.
  4. Откройте хориоаллантойной мембрану с стерильных тупыми щипцами. Аккуратно отодвиньте эмбриона и желточного мешка с небольшим шпателем или ложкой. Будьте осторожны, не разорвать желток.
  5. Использование 1 мл Eppendorf пипетки, тщательно собрать аллантоисной жидкости. При необходимости, наклоните яйцо немного в сторону, чтобы собрать как можно больше жидкости, как это возможно.
  6. Зерноуборочный аллантоисной жидкости из всех яиц в 50 мл коническую трубку из пластика. Держите труб на льду в течение всего времени сбора урожая вируса. Одно яйцо дает 5 - 10 мл слегка желтоватым жидкости.
  7. Спин-вирус, содержащий аллантоисной жидкости в 1000 х г в течение 10 мин при 46; С для осаждения мусора. Передача прозрачную жидкость в новую пробирку на 50 мл хранили на льду. Утилизация яйца в BSL-2 контейнер для отходов.

7. Хранение

  1. Сразу аликвоту очищенного аллантоисной жидкости (например, 50, 100 или 500 мкл аликвоты) и оснастки заморозить в жидком азоте. Трансфер замороженных запасов вируса до -80 ° C морозильник для длительного хранения.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Различные способы были разработаны для титр вируса гриппа. Одно соображение при выборе подходящего метода является то, что некоторые определения всех частиц, независимо от жизнеспособности (например, гемагглютинина анализа), тогда как другие на основе инфекционной, которые будут оценивать жизнеспособных вирионов (например, бляшек) 6. Здесь титр вируса аллантоисной жидкости собраны из куриных яиц, зараженных вирусом гриппа мыши адаптированы (/ PR / 8/34) была определена методом бляшек

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Грипп вызывает большое глобальное бремя болезней, и работа продолжается в понимании патогенеза поражения легких 7. Для облегченного исследований в этой смертельной болезни, различные методы были разработаны для распространения вируса гриппа 6. Здесь мы опишем технику для производства вируса гриппа в куриных яйцах. Преимущество этого метода состоит в том, что он является высокой воспроизводимостью и приводит к большим количеством высоким титром вируса гриппа запасов, которые часто необходимо для исс...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Данное исследование было поддержано грантами NIH HL120947 (P.C.), HL103868 (P.C.) и грантом Американской кардиологической ассоциации (P.C.)

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Фосфатно-солевой буфер (PBS)Cellgro 21-040-CV
сывороточные оплодотворенные куриные яйца без патогенов (SPF VALO BioMedia
 FARM iNNOVATORSМодель 2100
автоматический переворачиватель яицFARM iNNOVATORSМодель 3200
свечник для яиц FARM iNNOVATORSМодель 3300 
Шприц 1 млBD Bioscience309659
игла 18G BDBioscience305196
игла 20G / 22G иглаBD Bioscience305176 / 305156
HEPESSigma-AldrichH3375
Этанол>99,5%Sigma-Aldrich459844разбавить до 70% с помощью пистолета для водного
клея "Ad tech Hi Temp Проект "Рекламная техника", Adhesive Technologies, Inc.Модель 1105
клей "Ad tech MINI SIZE, Multi Temp"Ad tech, Adhesive Technologies, Inc.220-34ZIP30
MDCK клеткиATCCCRL-2935
Промытые объединенные эритроциты индейки, 10%Lampire Biological Laboratories724908
Инкубатор для увлажненных яиц

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Centers for Disease Control and Prevention (CDC). Estimates of deaths associated with seasonal influenza --- United States, 1976-2007. MMWR. Morbidity and mortality weekly report. 59 (33), 1057-1062 (2010).
  2. Neumann, G., Noda, T., Kawaoka, Y. Emergence and pandemic potential of swine-origin H1N1 influenza virus. Nature. 459 (7249), 931-939 (2009).
  3. Tumpey, T. M., Garcia-Sastre, A., et al. Pathogenicity of Influenza Viruses with Genes from the 1918 Pandemic Virus: Functional Roles of Alveolar Macrophages and Neutrophils in Limiting Virus Replication and Mortality in Mice. J Virol. 79 (23), 14933-14944 (2005).
  4. Doherty, P. C., Turner, S. J., Webby, R. G., Thomas, P. G. Influenza and the challenge for immunology. Nat Immu. 7 (5), 449-455 (2006).
  5. Webster, R. G., Govorkova, E. A. Continuing challenges in influenza. Ann N Y Acad Sci. 1323 (1), 115-139 (2014).
  6. Szretter, K. J., Balish, A. L., Katz, J. M. Unit 15G.1 Influenza: propagation, quantification, and storage. . Current protocols in microbiology. , Wiley. (2006).
  7. Short, K. R., Kroeze, E. J. B. V., Fouchier, R. A. M., Kuiken, T. Pathogenesis of influenza-induced acute respiratory distress syndrome. Lancet Infect Dis. 14 (4), 57-69 (2014).
  8. Ito, T., Suzuki, Y., et al. Differences in sialic acid-galactose linkages in the chicken egg amnion and allantois influence human influenza virus receptor specificity and variant selection. J Virol. 71 (4), 3357-3362 (1997).
  9. Robertson, J. S., Nicolson, C., Major, D., Robertson, E. W., Wood, J. M. The role of amniotic passage in the egg-adaptation of human influenza virus is revealed by haemagglutinin sequence analyses. J Gen Virol. 74 (Pt 10), 2047-2051 (1993).
  10. Gaush, C. R., Smith, T. F. Replication and plaque assay of influenza virus in an established line of canine kidney cells). Appl Microbiol. 16 (4), 588-594 (1968).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи