Здесь мы описываем высокопроизводительный метод жидкостной хроматографии-тандемной масс-спектрометрии (ВЭЖХ-МС/МС) для количественного определения иммунодепрессанта такролимуса в сухих пятнах крови с использованием простого ручного этапа осаждения белка и экстракции из онлайн-колонки.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Количественная оценка иммуносупрессором такролимуса на сухих пятен крови с использованием LC-MS / MS
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Ингибитор кальциневрина такролимуса является краеугольным камнем большинства иммуносупрессивных протоколов лечения после трансплантации солидных органов в Соединенных Штатах. Циклоспорин представляет собой узкий терапевтический индекс наркотиков и, соответственно, требует терапевтического мониторинга наркотиков и корректировка дозы на основе всей его концентрации корыто крови. Для облегчения домашнего терапевтический препарат и контроля за соблюдением, сбор сухих пятен крови является привлекательным понятием. После прокола пальца, пациент собирает капли крови на фильтровальной бумаге в домашних условиях. После того, как кровь сушат, она по почте в аналитическую лабораторию, где циклоспорин количественно с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии-тандемной масс-спектрометрии (ВЭЖХ-МС / МС) в сочетании с простой ручной стадии осаждения белка и экстракции онлайн колонки.
Для анализа такролимус, 6-мм диск выбиты из насыщенного центре пятна крови. Пятно крови гомогенизируют, используя пули смесителе сЗатем белки й осаждают метанолом / 0,2 М ZnSO 4, содержащий внутренний стандарт D 2, 13 С-такролимус. После вихревого и центрифугирования добавляли 100 мкл супернатанта вводят в колонну онлайн экстракции и промывают 5 мл / мин 0,1 муравьиной кислоты / ацетонитрила (7: 3, по объему) в течение 1 мин. Далее, переключающий клапан активируется и аналиты обратно промыть на аналитической колонке (и разделяли, используя 0,1% муравьиной кислоты / ацетонитрил градиент). Циклоспорин количественно в положительном режиме реакции несколькими (MRM) с использованием тандемной масс-спектрометра.
Анализ линейной от 1 до 50 нг / мл. Вариабельность-анализ (3,6% -6,1%) и точность (91,7% -101,6%), а проверяется в течение 20 дней отвечают критериям приемлемости. Средняя восстановление добыча 95,5%. Там нет соответствующих перенос, матричные помехи и матричные эффекты. Циклоспорин является стабильным в сухой капли крови при комнатной температуре и при + 4 ° С в течение 1 недели. Извлеченные образцы впробоотборник стабильны при температуре +4 ° С в течение, по крайней мере 72 часов.
Введение
Циклоспорин является мощным immonosuppressant 1-7, который имеет структуру макролидное 8 (рис 1). Благодаря цис - транс изомерии связей CN образует два ротамеров в растворе 9, которые могут быть разделены с обращенной фазой высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) Циклоспорин обладает липофильными и растворим в спиртах (метанол: 653 г / л, этанол: 355 г / л), галогенированные углеводороды (хлороформ: 573 г / л) и эфир. Это редко растворимы в алифатических углеводородов (гексан: 0,1 г / л и воды (рН 3:. 0,0047 г / л) 9 молекула не содержат каких-либо хромофора и его максимум УФ-пог....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Де-идентифицированные образцы крови от здоровых лиц были из университета Колорадо больницы (Аврора, Колорадо). Использование образцов крови банковских обезличенной для исследований по валидации, а также для подготовки калибраторов и контрольных образцов качества считалась "освобождаются" от Колорадо нескольких Экспертный совет (COMIRB, Аврора, Колорадо).
1. Подготовка справки и решения
- Покупка такролимус и внутренний стандарт D 2, 13 С-такролимус от поставщиков, перечисленных в Списке материалов.
- Подготовка исходных растворов в чистого метанола в концентрации 1 мг / мл для такролимуса и концентрац....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Типичные ионные хроматограммы холостой пробе, образец шипами на нижнем пределе квантификации и образца пациента показаны на рисунке 3.
Калибровочные кривые
Нижний предел обнаружения был 0,5 нг / мл, а нижний предел количественного составила 1,0 нг / мл. Пятьдесят нг / мл была выбрана в качестве наивысшего калибратора, как более высокие концентрации вряд ли будет достигнут в клинике при нормальных обстоятельствах.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Хотя, как указано выше, концепция терапевтического препарата и приверженности мониторинга такролимуса на основе сухих пятен крови является привлекательным, есть аналитические проблемы, которые выходят за рамки тех, как правило, связаны с анализом ЖХ-МС / МС такролимуса в венозной ЭДТА образцов цельной крови. Они включают, но не ограничиваются ими, с тем, что матрица выполнена капиллярная цельной крови впиталась в хлопковый пух материала фильтрующего материала карты, используемой здесь и низкого объема крови (20 мкл). Те.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторам нечего раскрывать.
Благодарности
Эта работа была поддержана контрактным HHSF223201310224C Федерального управления по лекарственным средствам США (FDA) и грантом Национальных институтов здравоохранения США/FDA 1U01FD004573-01.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Такролимус | Фармакопейная конвенция США | 1642802 | |
| D2,13C-Tacrolimus | Toronto Research Chemicals Inc. | ||
| Эритроциты | Больница Университета Колорадо | W20091305500 V | |
| Плазма Больница | Университета Колорадо | W2017130556300Q | |
| Ацетон CHROMASOLV, ВЭЖХ и ге; 99,9% | Sigma-Aldrich | 439126-4 л | |
| Ацетонитрил Optima LC/MS, УВЭЖХ-УФ | Thermo Fisher Scientific | A955-4 | |
| Изопропанол 99,9%, ВЭЖХ | Fisher Scientific | BP2632-4 | |
| Метанол Optima LC/MS | Thermo Fisher Scientific | A452-4 | |
| Вода Optima LC/MS, УВЭЖХ-УФ | Thermo Fisher Scientific | W6-4 | |
| Муравьиная кислота | Thermo Fisher Scientific | A118P-500 | |
| Фосфатно-солевой буфер (PBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Сульфат цинка | Thermo Fisher Scientific | Z68-500 | |
| 0,5 – 10 – l пипетка, VoluMate LIQUISYSTEMS | Mettler Toledo | 17008649 | |
| 1,5 мл Eppendorf tube | Thermo Fisher Scientific | 02-682-550 | |
| 10 – 100 & микро; l пипетка, VoluMate LIQUISYSTEMS | Mettler Toledo | 17008651 | |
| 10 μ l наконечники для дозаторов с фильтром, стерильные | Neptune | BT 10XLS3 | |
| 100 – 1,000 &; l пипетки, VoluMate LIQUISYSTEMS | Mettler Toledo | 17008653 | |
| 100 μ l наконечники для пипеток с фильтром, стерильные | Neptune | BT 100 | |
| 1,000 μ l наконечники для пипеток с фильтром, стерильные | Multimax | 2940 | |
| 2 – 20 & микро; l пипетка, VoluMate LIQUISYSTEMS | Mettler Toledo | 17008650 | |
| 2 мл пробирка Eppendorf | Thermo Fisher Scientific | 02-681-258 | |
| 20 – 200 &m; l пипетка, VoluMate LIQUISYSTEMS | Mettler Toledo | 17008652 | |
| 20 μ l наконечники для пипеток с фильтром, стерильные | GeneMate | P-1237-20 | |
| 200 μ l наконечники для дозаторов с фильтром | Multimax | 2938T | |
| 200 μ l наконечники для пипеток с фильтром, стерильные | Multimax | 2936J | |
| 50 мл Falcon tube | BD Falcon | 352070 | |
| 300 μ l вкладыши для флаконов с ВЭЖХ | Phenomenex | ARO-9973-13 | |
| Balance PR2002 | Mettler Toledo | 1117050723 | |
| Balances AX205 Delta Range | Mettler Toledo | 1119343379 | |
| Bullet Blender Гомогенизатор | Next Advance | BBX24 | |
| Centrifuge Biofuge Fresco | Heraeus | 290395 | |
| одноразовые салфетки | PDI | Q55172 | |
| Стеклянные флаконы, 4 мл | Thermo Fisher Scientific | 14-955-334 | |
| Стеклянные флаконы, 20 мл | Thermo Fisher Scientific | B7800-20 | |
| Перчатки, нитрил | Titan Brand Gloves | 44-100S | |
| ВЭЖХ флаконы, 9 мм, 2 мл, прозрачные | Phenomenex | ARO-9921-13 | |
| Крышки для флаконов ВЭЖХ | Phenomenex | ARO- 8952-13-B | |
| Игла, 18 г 1,5 | Прецизионный глайд | 305196 | |
| штатив для пробирок Eppendorf | Thermo Fisher Scientific | 03-448-11 | |
| Штатив для флаконов с ВЭЖХ | Thermo Fisher Scientific | 05-541-29 | |
| Стальные бусины 0,9 – 2 мм | Next Advance | SSB14B | |
| Ящики для хранения морозильных камер / холодильников | Thermo Fisher Scientific | 03-395-464 | |
| Стандартный многотрубный вортексер | VWR Scientific Products | 658816-115 | |
| Ватман Бумага, 903 Protein Saver US 100/PK | GE Whatman | 2016-05 | |
| Автосэмплер | CTC PAL | приятель. HTCABIx1 | |
| Бинарный насос, Agilent 1260 Infinity | Agilent Technologies | 1260 G1312B | |
| Бинарный насос, Agilent 1290 Infinity | Agilent Technologies | 1290 G4220A | |
| Микровакуумный дегазатор, Agilent 1260 | Agilent Technologies | 1260 G13798 | |
| Колонная печь, Agilent 1290 с 2 позициями | Agilent Technologies | 1290 G1216C | |
| Термостатированный отсек для колонны со встроенным 6-портовым переключающим клапаном | Agilent Technologies | 1290 G1316C | |
| HPLC картридж предварительной колонки, Zorbax XDB C8 (5 & микро; m (размер частиц), 4,6 · 12,5 мм | Phenomenex | 820950-926 | |
| , Zorbax Eclipse-XDB-C8 (5 & микро; m (размер частиц), 4,6 · 150 мм | Phenomenex | 993967-906 | |
| Тандемный масс-спектрометр | |||
| API5000 MS/MS с источником TurboIonspray | AB Sciex | 4364257 | |
| Программное обеспечение для масс-спектрометрии | AB Sciex | Analyst 1.5.1 |
Ссылки
- Goto, T., et al. Discovery of FK506, a novel immunosuppressant isolated from Streptomyces Tsukubaensis. Transplant Proc. 19 (5 Suppl 6), 4-8 (1987).
- Kino, T., Hatanaka, H., Miyata, S.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
