Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Физиология Лаборатория Демонстрация: клубочковой фильтрации у крыс

17K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/52425

⸱

26 июля 2015 г.

 ,  , 
1Tactical Combat Casualty Care Research, U.S. Army Institute of Surgical Research, 2Department of Pharmacology and Toxicology, Michigan State University, 3Southwest National Primate Research Center, Texas Biomedical Research Institute

В этой статье

Краткое содержание

Цель этого протокола — продемонстрировать принципы и методы измерения и вычисления скорости клубочковой фильтрации, скорости потока мочи и экскреции натрия и калия у крыс. Эта демонстрация может быть использована для того, чтобы дать студентам общее концептуальное представление о том, как измерять функцию почек.

Аннотация

Измерения скорости клубочковой фильтрации (СКФ) и фракционной экскреции натрия (Na) и калия (K) имеют решающее значение для оценки функции почек в норме и при заболеваниях. СКФ измеряется как установившийся почечный клиренс инулина, который фильтруется в клубочке, но не секретируется и не реабсорбируется вдоль нефрона. Фракционная экскреция Na и K может быть определена по концентрации Na и K в плазме и моче. Почечный клиренс инулина может быть продемонстрирован у животного, находящегося под наркозом, у которого катетеры находятся в бедренной артерии, бедренной вене и мочевом пузыре. Оборудование и расходные материалы, используемые для этой процедуры, обычно доступны в исследовательском центре, что делает эту процедуру практическим средством измерения функции почек. Цель этого видео — продемонстрировать процедуры, необходимые для проведения лабораторной демонстрации, в которой оценивается функция почек до и после приема диуретического препарата. Представленная методика может быть использована для оценки функции почек на крысовых моделях почечной недостаточности.

Введение

Наиболее важной функцией почек является гомеостатическая регуляция внеклеточной воды и содержания электролитов. Почки тесно регулируют внеклеточную воду, натрий (Na) и калий (K) для поддержания нормального физиологического уровня. Нарушения функции почек могут привести к серьезным метаболическим нарушениям, которые могут привести к летальному исходу. Основной почечный процесс происходит в нефроне и начинается с фильтрации плазмы у клубочка и заканчивается выведением мочи. Другими процессами, определяющими конечную концентрацию воды, Na и K в моче, являются секреция и реабсорбция внутри нефрона. Измерения скорости клубочковой фильтрации (СКФ) и фракционной экскреции Na и K имеют решающее значение для оценки функции почек в норме и при заболеваниях. Читатель отсылается к ранее опубликованным обзорным статьям и учебным пособиям для более подробного обсуждения функции почек1-4.

GFR можно измерить как стационарный почечный клиренс инулина, который фильтруется в клубочке, но не секретируется и не реабсорбируется вдоль нефрона5. Хотя этот метод требует анестезии, хирургической подготовки и заключительного эксперимента, он считается золотым стандартом измерения СКФ. Используя инулин, меченный флуоресцеин-изотиоцианатом (FITC), концентрацию FITC-инулина в плазме и моче можно легко измерить в небольших объемах и использовать для расчета СКФ в течение нескольких временных точек эксперимента. Фракционная экскреция Na и K может быть определена по концентрации Na и K в плазме и моче.

Концептуальное понимание того, как измерить функцию почек, может быть легко продемонстрировано в короткой лаборатории, разработанной таким образом, чтобы студенты могли активно участвовать в некоторых аспектах эксперимента. В этом видео показана предлабораторная подготовка, демонстрация функции почек и постлабораторная оценка результатов. Хирургические методы, необходимые для измерения СКФ, были продемонстрированы на крысе под наркозом. Кроме того, приведены примеры расчетов СКФ и фракционной экскреции Na и K до и после приема диуретического препарата.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

До любой процедуры животных, уход за животными институциональная и использование комитет (IACUC) должен утвердить протокол. Этот протокол был одобрен Университет штата Мичиган IACUC.

1. Предварительная подготовка лаборатории FITC-инулин решения

  1. Теплые 20 мл физиологического раствора до 70 ° С и медленно перемешивают в 100 мг FITC-инулин (5 мг / мл FITC-инулин), пока все инулин не растворится.
  2. Холодный раствор до комнатной температуры и добавить 800 мг бычьего сывороточного альбумина (40 мг / мл БСА, лиофилизированный порошок, по существу, глобулина, низкое эндотоксин, ≥98% чистоты электрофорезом в агарозном геле).
  3. Фильтр инулин-BSA решение с фильтровальной бумаги (сорт 1). Поместите отфильтрованного раствора в 20 мл шприц с шприц-фильтр наконечника (0,2 мкм) и накрыть фольгой, чтобы защитить от света.

2. Анестезия и хирургия

  1. Поместите крысу в индукционной камере, заполненной 5% изофлуран для индукции анестезии. Запись Совет директорову вес (250-350 г) и поместить крысу на платформе хирургической нагретого предназначена для поддержания 37 ° С температуру тела в течение всего эксперимента. Аккуратно закрепите крысу на платформу с лабораторным ленты на лапах. Поддержание анестезии с 1-2% изофлуран с медицинской ранга 100% O 2 при скорости воздушного потока 0,8-1,0 л / мин.
  2. Вставьте коническую катетер (внутрисосудистого наконечник OD, 2.7F) в бедренную артерию для кровяного давления и сердечного ритма мониторинга и отбора проб крови.
  3. Вставьте катетер (РЕ-50) в бедренную вену для инулина инфузии. Закрепите катетер окружающие ткани с 5-О плетеные шелковой хирургической нити 6.
  4. Прикрепите артериальный катетер с тензометрическим избыточного давления. Запись кровяное давление и частоту сердечных сокращений с помощью программного обеспечения сбора данных и отображение на экране компьютера в режиме реального времени. Этот метод показал подробно на видео 6.
  5. Expose мочевого пузыря с помощью надлобковой разрез. Вырезать небольшойотверстие в кончике мочевого пузыря и вставить канюлю (РЕ-190) с тепловой вспыхнул наконечник внутри мочевого пузыря для сбора мочи. Закрепите канюли мочевого пузыря с кошелька струн шва.

3. Моча и забор крови

  1. Поместите шприц FITC-инулин в шприцевой насос с расходом набор 1 мл / ч на 100 г массы тела (3 мл / ч для крысы весом 300 г). Прикрепите шприц к бедренной вены катетер. Начните инулина настой и позволяют период уравновешивания 1-2 ч. Держите шприц покрытый фольгой, чтобы защитить от света.
  2. Определить, если скорость потока мочи является стабильным и достаточно для анализа образца (20 мкл / мин) путем сбора мочи в предварительно взвешенную пробирку для сбора в течение 10 мин. Определить объем мочи гравиметрическим с цифровой шкалой. Адекватный объем мочи в течение 10 мин сбора составляет 0,2 мл. Продолжайте собирать образцы мочи до двух последовательных коллекции не указать скорость потока мочи от 20 мкл / мили более.
  3. Образцы предварительно наркотиков
    1. Соберите образец мочи в течение периода 20 мин. Собирают пробы крови (0,5 мл) с артериальным катетером в середине периода сбора мочи. Будьте осторожны, чтобы полностью очистить артериального катетера физиологического раствора перед сбором образца крови в пробирку, содержащую сбора 1 U гепарина. Используйте сбора флаконов с маркировкой объема для облегчения сбора 0,5 мл артериальной крови.
    2. Флеш артериальный катетер с гепарин-физиологический раствор (20 ед / мл), чтобы удалить катетер крови (прибл. 0,1 мл). Длина артериальный катетер должен быть как можно короче, чтобы ограничить объем физиологического раствора гепарин-необходимого для очистки.
      Примечание: Разведенные образцы крови производят неточные расчеты СКФ и фракционной экскреции Na и К.
    3. Подождите 10 мин, и повторить сбор мочи второго предварительного наркотиков и пробы крови.
  4. После сбора двух образцов Предварительная наркотиков, администрировать мочегонным Дрюг, фуросемид (10 мг / кг), через артериальный катетер. Промойте артериальный катетер с гепарином физиологического раствора, чтобы очистить катетер препарата. Позаботьтесь, чтобы предотвратить инъекции воздуха через артериальный катетер. Запишите время на фуросемид инъекции.
  5. Образцы после наркотиков: На каждом из 3 временных точках ниже, собирают мочу в течение периода сбора 10 мин, и пробы крови (0,5 мл) в середине периода сбора мочи.
    1. Для пост-наркотическими образца 1 - собрать пять минут после фуросемида.
    2. Для пост-наркотическими Пример 2 - собрать десять минут после фуросемида.
    3. Для образца Сообщение с наркотиками 3 - собрать пятнадцать минут после фуросемида.
  6. После того как все образцы были собраны, усыпить крысу в соответствии с институциональными процедурами по торакотомии и удаления сердца. Снимите обе почки. Decapsulate (удалить окружающий мембрану) и промокните почки, чтобы удалить лишнюю кровь. Взвесьте почки.

4. Анализ проб

  1. Измерьте все объемы проб мочи гравиметрически с цифровой шкале, и записывать вес.
  2. Центрифуга образцы цельной крови с настольной центрифуге (1800 XG), чтобы отделить плазму. Перевести образцы плазмы малых маркированных флаконах.
  3. Анализ концентрации Na и К в моче и плазме образцов с помощью анализатора натрия / калия.
  4. Измерение FITC-инулина в плазме и моче
    1. Развести мочу до наркотиков (от 1: 200 до 1: 400) и моче после лекарственной (1:10) с HEPES буфера (500 мМ, рН 7,4).
    2. Добавить 40 мкл стандарта или пробы и 60 мкл HEPES буфера в 96-луночный планшет (один образец на лунку) и позволяют смешиваться в течение 10 мин, а покрытые алюминиевой фольгой.
    3. Создание стандартной кривой для FITC-инулин для концентрации 6,25, 12,5, 25, 50, 100, 200, 400 мкг / мл (рис 1). Определить FITC-инулин флуоресценции в образцах и стандартам с использованием планшетного с эксцитата и выбросов длины волн 485 и 538 нм, соответственно.
    4. Установите флуоресцентные значения стандартов в 4-параметра Я логистической функции регрессионного анализа. Параметры функции регрессии используются для вычисления концентрации ФИТЦ-инулин в плазме и моче образцов (таблица 1).

5. После лабораторного анализа результатов: Расчеты

  1. Рассчитать скорость потока мочи (UV; мл / мин): [объем собранной мочи (мл)] ÷ [время сбора (мин)]
  2. Рассчитать клубочковой фильтрации (СКФ; мл / мин): [Моча концентрация инулина (мкг / мл) х UV (мл / мин)] ÷ [плазменным инулин конц. (Мкг / мл)]
  3. Рассчитать Filtered нагрузки натрия (мкмоль / мин): концентрация натрия плазмы (мкмоль / мл) х СКФ (мл / мин)
  4. Рассчитать натрия экскреции Оценить (U Na V; мкмоль / мин): Моча концентрация натрия (мкмоль / мл) х UV (мл / мин)
  5. Рассчитать фракционная экскреция натрия (Na FE;%): [U Na V (мкмоль / мин)] ÷ [Отфильтрованный нагрузки натрия (мкмоль / мин)] х 100
  6. Рассчитать Отфильтровано калия Load (мкмоль / мин): концентрация калия в плазме (мкмоль / мл) х СКФ (мл / мин)
  7. Рассчитать калия экскреции Оценить (U K V; мкмоль / мин): Моча концентрация калия (мкмоль / мл) х UV (мл / мин)
  8. Рассчитать фракционная экскреция калия (K FE;%): [U К V (мкмоль / мин)] ÷ [с фильтром калия нагрузки (мкмоль / мин)] х 100

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Мочегонное используется в лабораторной демонстрации был фуросемид, который очень быстро ингибирует реабсорбцию Na и K фильтруется почками, что приводит к увеличению Na, К и воды экскреции в течение нескольких минут введения препарата. По его основного механизма, фуросемид должна иметь минимальное воздействие на СКФ и отфильтрованного нагрузки Na и К, но увеличит поток мочи, и фракционная экскреция Na и К.

Представительные результаты в таблице 3, показывают, что в анестезиров...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Соответствующий маркер для измерения СКФ должны соответствовать четырем критериям: быть свободно фильтруется в клубочках, несвязанного быть с белками плазмы, и ни поглощается ни секретируется в нефрона. Инулин фруктозы полимер, который удовлетворяет этим критериям. В результате, почечный клиренс инулина считается золотым стандартом для измерения СКФ 7. Продемонстрировали технику представляет традиционный подход определения почечного клиренса инулина, используя приурочен сбора мочи во время постоянной инфузии ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов. В мнения или утверждения, содержащиеся в данном документе, являются частные мнения автора и не должны быть истолкованы в качестве официальной или как отражающие взгляды Департамента армии или министерства обороны.

Благодарности

Источник финансирования для лабораторной демонстрации был NIGMS грант: GM077119. Мы благодарим д-р Джозеф Р. Хейвуд и д-ра Питера Коббет за их поддержку в коротких Couse в интегративной и органов системы фармакологии. Мы также благодарим г-жу Ханна Гарвер за техническую поддержку лаборатории демонстрации.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
5-0 Плетеный шелковый хирургический шовный материалSurgical Specialties CorpSP1033
Пробирная пластина, 96-луночныйCostar 3922
Бычий сывороточный альбуминSigma Chemical CoA2934-25G
ЦентрифугаBeckman CoulterMicroFuge 18, 357160
Конические пробиркидля образцов Dot Scientific Inc. #711-FTG
Аппликаторы с хлопковыми наконечникамиSolon Manufacturing Co56200
Программное обеспечение для сбора данныхADInstrumentsLabChart Pro 7.0
Цифровые весы Denver InstrumentAPX-4001
FITC-инулинSigma Chemical CoF3272-1G
Марлевые губкиCovidien2146
Хирургическая кровать с подогревомEZ-212
ГепаринСагнетNDC 25021-402-10
HEPESSigma Chemical CoH3375
ИзофлуранAbbott Animal HealthIsoFlo, 5260-04-05
Изофлуран ВапорайзерEZ-АнестезияEZ-190F
Микрорассекающие щипцыBiomedical Research Instruments Inc.70-1020
Считыватель микропланшетов - FluoroskanThermoScientificAscent FL, 5210460
NOVA 5+ Анализатор натрия/калияNOVA BioMedical14156
Иглодержатели Ольсена-Хегара с ножницамиFine Science Tools12002-12
PE-190 (для катетера мочевого пузыря)BD Медицинский427435
Преобразователь давления& НБСП;ПриложенияMLT1199
Pyrex Culture TubesCorning Inc.99445-12
Крысиный катетер бедренной артерииStrategic Applications Inc.RFA-01
Salix Furosemide 5%Intervet#34-478
Косоглазие НожницыFine Science Tools14075-11
Студенческие хирургические ножницыFine Science Tools91402-12
Хирургические перчаткиKimberly-ClarkSterling Nitrile Gloves
Шприцевой насосRazel ScientificR99-E
Тканевые щипцыFine Science Tools91121-12
Тканевые ножницыGeorge Tiemann  Co105-420

5-0 Плетеный шелковый хирургический шовный материал Surgical Specialties Corp SP1033 Оценочная пластина, 96-луночный costar  3922 Бычья сыворотка Альбумин Sigma Chemical Co A2934-25G Центрифуга Beckman Coulter MicroFuge 18, 357160 Конические пробирки для образцов Dot Scientific Inc.  #711-FTG Аппликаторы с хлопковыми наконечниками Solon Manufacturing Co 56200 Программное обеспечение для сбора данных ADInstruments LabChart Pro 7.0 Digital Весы  Denver Instrument APX-4001 FITC-Инулин Sigma Chemical Co F3272-1G Марлевые губки Covidien 2146 Хирургическая кровать с подогревом EZ-212 Гепариновый сагнет NDC 25021-402-10 HEPES Sigma Chemical Co H3375 Изофлуран Abbott Animal Health IsoFlo, 5260-04-05 Испаритель изофлурана EZ-Anesthesia EZ-190F Микрорассекающие щипцы Biomedical Research Instruments Inc. 70-1020 Считыватель микропланшетов - Fluoroskan ThermoScientific Ascent FL, 5210460 NOVA 5+ Анализатор натрия/калия NOVA Biomedical 14156 Olsen-Hegar Иглодержатели с ножницами Fine Science Tools 12002-12 PE-190 (для катетера мочевого пузыря) BD Medical 427435 Преобразователь давления  Инструменты MLT1199 культуральных пробирках Pyrex Corning Inc. 99445-12 Катетер для бедренной артерии крысы Strategic Applications Inc. RFA-01 Salix Furosemide 5% Intervet #34-478 Ножницы для косоглазия Fine Science Tools 14075-11 Хирургические ножницы Student Fine Science Tools 91402-12 Хирургические перчатки Kimberly-Clark Sterling Nitrile Gloves Шприцевая помпа Razel Scientific R99-E Тканевые щипцы Fine Science Tools 91121-12 Тканевые ножницы George Tiemann  Ко 105-420

Ссылки

  1. Silverthorn, D. U. Human Physiology: An integrated approach. , Pearson. (2012).
  2. Hall, J. E. Guyton and Hall Textbook of Medical Physiology. , 303-344 (2011).
  3. Levey, A. S. Measurement of renal function in chronic renal disease. Kidney International. 38 (1), 167-184 (1990).
  4. Thurau, K., Valtin, H., Schnermann, J. Kidney. Annual Review of Physiology. 30, 441-524 (1968).
  5. Shannon, J. A., Smith, H. W. The excretion of inulin, xylose, and urea by normal and phoriziniaed man. Journal of Clinical Investigation. 14, 393-401 (1935).
  6. Jespersen, B., Knupp, L., Northcott, C. A. Femoral arterial and venous catheterization for blood sampling, drug administration and conscious blood pressure and heart rate measurements. Journal of Visualized Experiments. (59), (2012).
  7. Sterner, G., et al. Determining 'true' glomerular filtration rate in healthy adults using infusion of inulin and comparing it with values obtained using other clearance techniques or predictive equations. Scandinavian Journal of Urology and Nephrology. 42, 278-285 (2008).
  8. Toto, R. D. Conventional measurement of renal function utilizing serum creatinine, creatinine clearance, inulin and para-aminohippuric acid clearance. Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 4 (6), 505-509 (1995).
  9. Matavelli, L. C., Kadowitz, P. J., Navar, L. G., Majid, D. S. Renal hemodynamic and excretory responses to intra-arterial infusion of peroxynitrite in anesthetized rats. Americam Journal of Physiology. 296, F170-F176 (2009).
  10. Davidson, W. D., Sackner, M. A. Simplification of the anthrone method for the determination of inulin in clearance studies. Journal of Laboratory, & Clinical Medicine. 62, 351-356 (1963).
  11. Symes, A. L., Gault, M. H. Assay of inulin in tissues using anthrone. Clinical Biochemistry. 8 (1), 67-70 (1975).
  12. Shalmi, M., Lunau, H. E., Petersen, J. S., Bak, M., Christensen, S. Suitability of tritiated inulin for determination of glomerular filtration rate. Americam Journal of Physiology. 260 (2 Pt 2), F283-F289 (1991).
  13. Denton, K. M., Anderson, W. P. Glomerular untrafiltration in rabbits with superficial glomeruli. EUropean Journal of Physiology. 419 (3-4), 235-242 (1991).
  14. Jobin, J., Bonjour, J. -P. Measurement of glomerular filtration rate in conscious unrestrained rats with inulin infused by implanted osmotic pumps. Americam Journal of Physiology. 248 (5 Pt 2), F734-F738 (1985).
  15. Lorenz, J. N., Gruenstein, E. A simple, nonradioactive method for evaluating single-nephron filtration rate using FITC-inulin. Americam Journal of Physiology. 276 (1 Pt 2), F172-F177 (1999).
  16. Qi, Z., et al. Serial determination of glomerular filtration rate in conscious mice using FITC-inulin clearance. Americam Journal of Physiology. 286 (3), F590-F596 (2004).
  17. Bivona, B. J., Park, S., Harrison-Bernard, L. M. Glomerular filtration rate determinations in conscious type II diabetic mice. Americam Journal of Physiology. 300 (3), F618-F625 (2011).
  18. Rosen, S. M. Effects of anaesthesia and surgery on renal hemodynamics. British Journal of Anesthesiology. 44, 252-258 (1972).
  19. Cousins, M. J. Anesthesia and the kidney. Anaesthesia and intensive care. 11 (4), 292-320 (1983).
  20. Walter, S. J., Zewde, T., Shirley, D. G. The effect of anaesthesia and standard clearance procedures on renal function in the rat. Quarterly Journal of Experimental Physiology. 74, 805-812 (1989).
  21. Rieg, T. A. A high-throughput method for measurement of glomerular filtration rate in conscious mice. Journal of Visualized Experiments. (75), (2013).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Физиология Лаборатория Демонстрация: клубочковой фильтрации у крыс
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.