Методическая статья

Прямая визуализация мышиный Спинной Cochlear Nucleus для Optogenetic стимуляции слухового пути

DOI:

10.3791/52426

⸱

20 января 2015 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Otology and Laryngology, Harvard Medical School, 2Department of Communication Sciences and Disorders, Worcester State University

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Цель этого протокола — описать хирургический подход для обеспечения прямого доступа к дорсальному кохлеарному ядру на мышиной модели.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Исследование в области использования вируса-опосредованного переноса генов, чтобы арестовать или обратить вспять процесс утраты слуха в значительной степени были отнесены к периферической слуховой системы. В нескольких исследованиях изучали перенос генов к центральной слуховой системы. Спинной Cochlear Nucleus (DCN) ствола мозга, который содержит второй нейронов порядка слухового пути, это потенциальное место для переноса генов. В этом протоколе, техника для прямого и максимальному облучению мышиного DCN через задней черепной ямки подхода продемонстрирована. Такой подход позволяет любой острой или выживания хирургии. После прямой визуализации DCN, хозяин экспериментов можно, в том числе инъекции опсинов в кохлеарной ядра и последующим стимуляции оптического волокна в сочетании с синим светом лазера. Другие эксперименты нейрофизиологии, такие как электрической стимуляции и нейронных начертаний форсунок также возможны. Уровень visualizaции и продолжительность стимуляции достижимо делают этот подход применим к широкому кругу экспериментов.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Вирус-опосредованный перенос генов для обратной потери слуха в основном сосредоточен на периферической слуховой системе. 1 Нацеливаясь на улитку, исследователи изучили множество путей доставки, включая осмотическую инфузию мини-насоса2, пропитанную векторно-трансгенным комплексом Gelfoam®2 или желатиновую губку3, прямую микроинъекцию4; многочисленные векторы переноса генов, включая аденоассоциированные вирусные векторы5,6, лентивирусные векторы7 и катионные липосомы2; и распространение векторов переноса генов за пределы ткани-мишени2. Совсем недавно аденоассоциированный вирус (AAV)-1 был введен в улитку для лечения глухоты у мышей из-за потери везикулярного транспортера глутамата-3. 8 Кроме того, недавно было описано применение оптогенетики в периферической слуховой системе. 9

Однако в немногих исследованиях изучался перенос генов в центральную слуховую систему. Дорсальное кохлеарное ядро (DCN) ствола мозга содержит нейроны второго порядка слухового пути. В то время как методы переноса генов в кохлеарном ядре (КН) могут быть использованы для множества исследований, перенос генов опсинов, светочувствительных белков, в DCN также может быть использован для создания экспериментальных методов, основанных на оптогенетике. После вирус-опосредованной доставки опсина, такого как каналродопсин-2 (ChR2), нейроны DCN становятся чувствительными к световым стимулам. Оптогенетический перенос генов ранее предпринимался в нескольких областях ствола мозга, включая ретротрапециевидное ядро крысы, локус coeruleus мыши, верхнюю колликулус обезьяны и вентральную область тела мыши. 10-14

лет

Недавно исследователи изучили использование оптогенетики в DCN. 15,16 DCN является местом размещения слуховых имплантатов ствола мозга у человека, что делает его привлекательной частью слуховой системы для изучения в рамках трансляционных исследований на слуховых нейропротезах. Однако, учитывая расположение DCN, хирургическое воздействие является сложной задачей. Описанный здесь метод обеспечивает протокол для максимального воздействия DCN через заднюю черепную ямку, что позволяет проводить перенос генов вирусного вектора и эксперименты на основе оптогенетики на мышиной модели. В предыдущих исследованиях использовали стереотаксическую микроинъекцию в DCN с каналродопсином-2. Стереотаксические инъекции, однако, потенциально менее точны, чем инъекции, сделанные путем прямой визуализации, особенно в ядро такого маленького и глубокого ствола мозга, как DCN. Трансгенные мыши, экспрессирующие тканеспецифичные белки в ЦН, также являются привлекательным вариантом и устраняют необходимость в переносе генов. Наш протокол воздействия DCN также будет работать на трансгенных мышах, поскольку DCN необходимо будет подвергать прямому воздействию для оптической стимуляции. Этот метод хирургического воздействия DCN адаптирован из предыдущих протоколов, включающих записи со слухового нерва и кохлеарного ядра у мышей и крыс. 15,17-20

Общая цель протокола - обеспечить прямой контакт с ЦН, чтобы обеспечить методы переноса генов. В частности, этот подход совместим как с острой, так и с выживальной хирургией, и препарат может быть повторен на том же животном для последующих нейрофизиологических испытаний. Прямое воздействие протокола DCN имеет значение для экспериментов на основе оптогенетики и вирус-опосредованного переноса генов в других ядрах ствола мозга.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ПРИМЕЧАНИЕ: Все экспериментальные процедуры выполняются в соответствии с уходу и использованию комитета животных из Массачусетского глаз и ушей лазарет и Гарвардской медицинской школы, которые следуют национальные руководящие принципы по уходу за животными, в том числе политики общественного здравоохранения по гуманное лечение и использования лабораторных животных, ИЛАР Руководство и Закон защиты животных. Экспериментальные процедуры, перечисленные ниже подробно воздействии на левой DCN. Используйте стерильные инструменты при выполнении операции выживания.

1. Первичная Краниотомия и Спинной Cochlear Nucleus экспозиции

  1. Анестезия
    1. Обезболить мыши в возрасте 8-12 недель, весом 18-24 г, с ксилазина 20 мг / кг кетамина и 100 мг / кг через внутрибрюшинного введения. Подтвердите надлежащего анестезии сердечного ритма мониторинга, частоту дыхания, а также ног щепотку отмены рефлекса. Место ветеринар мазь на глазах, чтобы предотвратить сухость в то время как под наркозом. После того, как адекватно под наркозом, бритье волос, покрывающий тон скальп, чтобы обеспечить беспрепятственный доступ к хирургической операции.
  2. Хирургическое позиционирования
    1. Наведите надежно в небольшом владельца животного стереотаксической, удерживается на месте с помощью рыла зажима.
    2. Убедитесь, что морда зажим достаточно свободно, чтобы обеспечить адекватное дыхание, но достаточно плотно, чтобы полностью обездвижить голову мыши. Если головка мышь свободно, животное может выпасть из держателя головки во время краниотомии части процедуры.
    3. Поместите слуховые ствола мозга имплантатов электродов в стандартном моды, что позволяет для мониторинга сердечного ритма. Частота дыхания должны контролироваться визуализации. Следует отметить, что нормальный сердечный ритм и частота дыхания может изменяться в зависимости от возраста мыши.
    4. Термометр помещают и euthermia обеспечивается путем размещения на теплокровных одеяло отопления.
  3. Разрез кожи и разоблачение interparietal и затылочной костей черепа
    1. Под microscОПЕ, сделать вертикальный разрез через кожу, начиная с средней линии, непосредственно между ушной раковины, а также включить в каудальной части затылка. После срединный разрез кожи, вытеснять кожу с боков. Представьте мышцы, охватывающие левую заднюю сторону черепа.
    2. Удалить мышцы, покрывающий левую теменную, interparietal и затылочные кости черепа по экзартикуляции вложений мышечных их соответствующих костей с помощью скальпеля или радужной оболочки глаза ножницами. Соблюдайте небольшую степень кровотечения по разрезу мышечных краев. Свернуть это при слабом давлении с ватным наконечником аппликатора на 10-15 сек.
  4. Краниотомия вышележащих Cochlear Nucleus
    1. Определить соответствующие строки шов, в том числе в сагиттальной и лямбда швов линий (рис 1, слева).
    2. Использование кусачек, сделать трепанацию черепа над Кость инков, слева от срединной линии, ~ 2 мм каудально к лямбда шва. Этот регион покрывает DCN.
    3. Followinг трепанация черепа, наблюдать тонкий слой твердой мозговой оболочки, что перекрывает мозжечок. Использование лезвие скальпеля, удалить твердую мозговую оболочку. (Рисунок 1, средняя панель).
      Примечание: Удаление твердой мозговой оболочки может вызвать небольшую степень кровотечения. Этот процесс с использованием лезвие скальпеля, чтобы удалить твердую мозговую оболочку предназначен, чтобы уменьшить количество кровопотери во время мозжечка аспирации, которая будет бассейн на поверхности мозга и неясной идентификации DCN. Общий объем крови мыши ~ 1,5 мл не должна превышать> чем на 15%. Если кровотечение превышает эту сумму, мышь должна быть обеспечена с добавками жидкости.
    4. Удалить свернувшейся крови, покрывающий мозжечок ватным наконечником аппликатором. При желании, мягко капать солевой раствор с помощью зубной точку на мозжечке, чтобы очистить кровь от крови.
  5. Мозжечка Стремление
    1. Использование 5 французскую всасывания, аспирации в поперечном направлении наиболее части левой мозжечка, покрывающей DCN до DCN не по отношениюUAL (рис 1, справа). Удалить примерно от 1/4 до 1/3 от левой мозжечка. Главная достопримечательность рядом с DCN является ампула высшего полукружных каналов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Стремление мозжечка ключевым шагом протокола. Режиссер стремление мозжечка наиболее успешно выполняется, если это происходит в одной попытке, а не с несколькими проходами всасывания, так как это вызовет кровотечение. Чтобы помочь в стремлении, установлен в фокальной плоскости микроскопа на ожидаемой глубины CN, которая будет немного удален от поверхности мозжечка. Установка фокальной плоскости в CN улучшит визуализацию и обеспечить четкое изображение.
    2. После аспирации, в дальнейшем кровотечения, спинномозговой жидкости (ликвора) наращивание и мозжечок смещение на DCN ожидается. Привить 0,5 см стерильного физиологического раствора быстро в трепанации черепа, чтобы предотвратить свертывание крови. Сочетание нежного вытирать с зубной точки всасывания и может быть затемиспользуется для расчищать путь для прямой визуализации DCN. Есть непосредственно не контактирует с поверхностью DCN.

2. Давление Микроинъекция для Касперского опосредованного переноса гена и хирургической восстановления

  1. После DCN свободна от вышележащих крови и спинномозговой жидкости, и отчетливо видно, чтобы микроинъекций давления в DCN с использованием 10 мкл Hamilton шприца в течение 2 мин.
  2. не вносят иглу микроманипулятор до кончика больше не видны под поверхностью DCN.
  3. Для оптимальной производительности используйте 33 или 34 иглы (используйте герметичное шприц с 34 датчик иглы) с мелкой фаски, например, 45 °, чтобы свести к минимуму тупой травмы и локализовать объем впрыска в пределах DCN, который тонкий и мелкой структуры ствола мозга (<300 мкм).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Другие микроинъекции инструменты могут быть использованы на основе. В идеале, инъекции инструмент должен быть гибким, чтобы позволить некоторую небольшим Бенd, если нужно, чтобы непосредственно нацелены на DCN. Кроме того, как мышь слегка движется в течение всей процедуры за счет дыхания, прибор должен быть достаточно прочным, чтобы выдерживать незначительные количества движения.

3. Хирургическое восстановление

  1. Сразу после инъекции, вновь приблизить кожу и позволяют мышь, чтобы восстановить в стандартной процедуры восстановления. Оставшееся мозжечок и рубцовая ткань заполнит полости, вызванного стремлением мозжечка. Постоянно следить животных, пока достаточно сознание не восстанавливается поддерживать грудины лежачее положение. Монитор сердечного ритма, частоты дыхания, а также способность прокормить.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Нет животное, которое перенес операцию возвращается в клетку с другими животными, пока полностью выздоровел.
  2. Если мышь начинает ходить кругами после операции (<5% случаев), как правило, 2-4 часа после закрытия разреза кожи, немедленно пожертвовать мышь, так как это, скорее всего, имеют трудное время кормления. Tего побочный эффект, скорее всего, из-за стремления мозжечка. Животное должно контролироваться на боли в послеоперационном периоде, а также соответствующие наркотики следует уделять обеспечить комфорт животных на основе институциональных стандартов. Антибиотики могут быть необходимы, если признаков инфекции.

4. Средняя Краниотомия и Cochlear Nucleus экспозиции

  1. Через 2-4 недель заживления и вируса-опосредованного генного переноса инкубации, повторно обезболить ранее вводили мыши и повторите шаг 1,1-1,5 Оптимальное время инкубации зависит от типа гена перевода.
  2. Удалить рубцовой ткани над трепанации черепа сайте сочетанием пинцетом, скальпелем, и кусачек.
  3. После визуализации трепанацию черепа, определить комбинацию остальные мозжечок и рубцовой ткани, покрывающий DCN. Используйте 5 французскую всасывания аспирации лежащего мозжечок / рубцовой ткани (по аналогии с предыдущим мозжечка аспирация).
  4. После аспирации, ожидать дальнейшего кровотечения, CSF бuild-до, и оставшиеся биты мозжечка. Быстро ввести физиологический раствор в краниотомия, чтобы предотвратить свертывание крови. Используйте сочетание нежной зубной точки вытирая и всасывания, чтобы очистить путь для прямой визуализации DCN.
  5. Обратите внимание на поверхность DCN. Выполните Оптогенетика на основе экспериментов физиологии как DCN теперь доступна. Внедрение световой раздражитель, например, с помощью оптического волокна (рисунок 2), для привода эксперимент Оптогенетика основе.

5. Гистология

  1. После заключения экспериментов, усыпить мышь с передозировкой кетамина. Заливать мышь с физиологическим раствором, а затем 4% параформальдегидом.
  2. Экстракт ствол мозга из черепа и после исправления в течение 2 часов. Cryoprotect ствол мозга в 30% сахарозы в течение 24-48 часов. Раздел ствола головного мозга с помощью стандартного криостата с помощью 60 мкм разделов.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Частичное мозжечка Стремление Демонстрирует Доступ к Cochlear Nucleus

После кожу и мышцы вышележащих черепа удаляются, поверхности черепа ориентиры, такие как корональных и Lamda линий шва, показывают приблизительное локализацию краниотомия. После трепанации черепа с кусачек, мозжечок визуализируется. Тщательное стремление небольшой части мозжечка демонстрирует визуализацию CN, который затем может быть введен (рис 1).

Среднее Cochlea...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта статья описывает методику прямой визуализации DCN в мышиной модели для манипуляции центральной слуховой системы. Изложил подход непосредственной визуализации обеспечивает значительные преимущества по сравнению с основной альтернативы, которые стереотаксической подходы. В первую очередь, непосредственной визуализации DCN позволяет немедленного подтверждения месте в стволе головного мозга, тогда как стереотаксических подходы не обеспечивают прямой визуализации. В экспериментах, которые требуют длительных инкубационных...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы не имеют ничего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Финансирование: Эта работа была поддержана грантом Фонда Бертарелли (DJL), гранта MED-EL (DJL) и Национальных институтов здравоохранения грантов DC01089 (MCB).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Стереотаксический держательStoelting51500
Гомеотермическое одеялоHarvard507214
Лезвие скальпеля #11Тонкие хирургические инструменты10011-00
Ножницы радужной оболочкиглаза Тонкие хирургические инструменты14084-08
5 Французское отсасываниеSymmetry Surgical2777914
Dental Points Schein100-8170
Тонкие хирургические инструментыдля кости 16020-14
10 &; l Шприц HamiltonHamilton 7633-01
34 калибр, иглаHamilton 
RongeursТонкие хирургические инструменты16021-14
207434

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lalwani, A., Mhatre, A. Cochlear gene therapy. Ear Hear. 24 (4), 342-348 (2003).
  2. Lalwani, A., Jero, J., Mhatre, A. Current issues in cochlear gene transfer. Audiol Neurootol. 7 (3), 146-151 (2002).
  3. Jero, J., et al. Cochlear gene delivery through an intact round window membrane in mouse. Hum Gene Ther. 12 (5), 539-548 (2001).
  4. Koh, S., Pettis, R., Mhatre, A., Lalwani, A. Cochlear microinjection and its effects upon auditory function in the guinea pig. Eur Arch Otorhinolaryngol. 257 (9), 469-472 (2000).
  5. Lalwani, A., Walsh, B., Reilly, P., Muzyczka, N., Mhatre, A. Development of in vivo gene therapy for hearing disorders: introduction of adeno-associated virus into the cochlea of the guinea pig. Gene Ther. 3 (7), 588-592 (1996).
  6. Wareing, M., Lalwani, A. Cochlear gene therapy: current perspectives. Int J Pediatr Otorhinolaryngol. 5 Suppl 1. (49), 27-30 (1999).
  7. Han, J., et al. Transgene expression in the guinea pig cochlea mediated by a lentivirus-derived gene transfer vector. Hum Gene Ther. 10 (11), 1867-1873 (1999).
  8. Akil, O., et al. Restoration of hearing in the VGLUT3 knockout mouse using virally mediated gene therapy. Neuron. 75 (2), 283-293 (2012).
  9. Hernandez, V. H., et al. Optogenetic stimulation of the auditory pathway. J Clin Invest. 124 (3), 1114-1129 (2014).
  10. Adamantidis, A., et al. Optogenetic interrogation of dopaminergic modulation of the multiple phases of reward-seeking behavior. J Neurosci. 30 (31), 10829-10835 (2011).
  11. Kim, K., et al. Optogenetic mimicry of the transient activation of dopamine neurons by natural reward is sufficient for operant reinforcement. PloS One. 7 (4), e33612(2012).
  12. Britt, J., Bonci, A. Optogenetic interrogations of the neural circuits underlying addiction. Curr Opin Neurobiol. 23 (4), 539-545 (2013).
  13. Abbott, S., Coates, M., Stornetta, R., Guyenet, P. Optogenetic stimulation of c1 and retrotrapezoid nucleus neurons causes sleep state-dependent cardiorespiratory stimulation and arousal in rats. Hypertension. 61 (4), 835-841 (2013).
  14. Carter, M., et al. Tuning arousal with optogenetic modulation of locus coeruleus neurons. Nat Neurosci. 13 (12), 1526-1533 (2010).
  15. Darrow, K., et al. Optogenetic control of central auditory neurons. Assoc. Res. Otolaryngol. Abstr. (695), (2012).
  16. Shimano, T., et al. Assessment of the AAV-mediated expression of channelrhodopsin-2 and halorhodopsin in brainstem neurons mediating auditory signaling. Brain Res. 1511, 138-152 (2013).
  17. Doucet, J., Ryugo, D. Projections from the ventral cochlear nucleus to the dorsal cochlear nucleus in rats. J Comp Neurol. 385, 245-264 (1997).
  18. Brown, M., Drottar, M., Benson, T., Darrow, K. Commissural axons of the mouse cochlear nucleus. J Comp Neurol. 521, 1683-1696 (2013).
  19. Verma, R., et al. Auditory responses to electric and infrared neural stimulation of the rat cochlear nucleus. Hear Res. 310, 69-75 (2014).
  20. Taberner, A. M., Liberman, M. C. Response properties of single auditory nerve fibers in the mouse. J Neurophysiol. 93 (1), 557-569 (2005).
  21. Rolls, A., et al. Optogenetic disruption of sleep continuity impairs memory consolidation. Proc Natl Acad Sci. 108 (32), 13305-13310 (2011).
  22. Huff, M., Miller, R., Deisseroth, K., Moorman, D., LaLumiere, R. Posttraining optogenetic manipulations of basolateral amygdala activity modulate consolidation of inhibitory avoidance memory in rats. Proc Natl Acad Sci. 110 (9), 3597-3602 (2013).
  23. Stortkuhl, K., Fiala, A. The Smell of Blue Light: A New Approach toward Understanding an Olfactory Neuronal Network. Front Neurosci. 5 (72), (2011).
  24. Hira, R., et al. Transcranial optogenetic stimulation for functional mapping of the motor cortex. J Neurosci Methods. 179 (2), 258-263 (2009).
  25. Ayling, O., Harrison, T., Boyd, J., Foroshkov, A., Murphy, T. Automated light-based mapping of motor cortex by photoactivation of channelrhodopsin-2 transgenic mice. Nat Methods. 6 (3), 219-224 (2009).
  26. Boyden, E., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nat. Neurosci. 8, 1263-1268 (2005).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи