Method Article

Генетический штрих кода с флуоресцентных белков для мультиплексированных приложений

DOI:

10.3791/52452

⸱

April 14th, 2015

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biology, San Diego State University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

С момента открытия гена зеленого флуоресцентного белка, флуоресцентные белки повлияли на молекулярную клеточную биологию. Этот протокол описывает, как экспрессия различных флуоресцентных белков с помощью генной инженерии используется для штрихкодирования отдельных клеток. Эта процедура позволяет отслеживать отдельные популяции в клеточной смеси, что идеально подходит для мультиплексных приложений.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Флуоресцентные белки, флуоресцентные красители и флуорофоры в целом произвели революцию в области молекулярной клеточной биологии. В частности, открытие флуоресцентных белков и их генов позволило спроектировать слияния белков для локализации, анализа транскрипционной активации и трансляции интересующих белков или общего отслеживания отдельных клеток и клеточных популяций. Использование генов флуоресцентных белков в сочетании с ретровирусной технологией позволило в дальнейшем стабильно и надежно экспрессировать эти белки в клетках млекопитающих. Здесь показано, как можно использовать эти гены для придания клеткам в популяции клеток их собственной биосигнатуры. Поскольку биосигнатура достигается с помощью ретровирусной технологии, клетки получают штрих-коды «на неопределенный срок». Таким образом, они могут быть индивидуально отслежены в смеси клеток со штрих-кодом и использоваться в более сложных биологических приложениях. Отслеживание отдельных популяций в смеси клеток идеально подходит для мультиплексных приложений, таких как обнаружение лекарств против множества мишеней или профиля активации различных промоторов. В протоколе описывается, как элегантно разрабатывать и амплифицировать штрихкодированные клетки млекопитающих с помощью различных генетических флуоресцентных маркеров, а также как использовать несколько маркеров одновременно или один маркер с разной интенсивностью. Наконец, в протоколе описывается, как клетки могут быть дополнительно использованы в сочетании с клеточными анализами для увеличения мощности анализа за счет мультиплексирования.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Такие технологии, как флуоресцентной спектроскопии, флуоресцентной микроскопии и проточной цитометрии, все полагаются на флуоресценции, недвижимость широко используется в биохимических, медико-биологических и химических применений. Флуоресценции, будь внутренняя или с помощью маркировки, эксплуатируется для анализа белковых паттернов экспрессии и профилей, клеточной судьбы, белковых взаимодействий и биологических функций 1-9, а через флуоресценции / Ферстер резонансный перенос энергии для обнаружения биомолекул взаимодействий и конформационных изменений 10-13. Так изоляции Aequorea Виктория зеленого флуоресцентного белка (GFP) 14, открытие дополнительных природных флуоресцентных белков из других кишечнополостных, в частности, кораллы, в значительной степени увеличилось число существующих флуоресцентных белков с различимым спектров возбуждения / эмиссии. Эти, а также с введением мутаций в генах 15-19, ВГАе расширена возможности, получение истинного палитру флуоресцентных белков в распоряжение ученых, которые используют микроскопии, проточной цитометрии и другие флуоресценции на основе технологии для их исследования.

Параллельно, хотя независимо, развитие ретровирусной технологии резко способствовали стабильной экспрессии эктопического генетической информации в клетках млекопитающих 20-23. Таким образом, не удивительно, что эта технология используется для передачи гены флуоресцирующих белков в широком ряде типов клеток и тканей 24-28 или для производства трансгенных животных 29-31. После природе ретровирусов, генетическую информацию о внематочной флуоресцентного белка вводят в геном клетки 32 и клетка становится люминесцентные `для ever'. Это свойство позволило отслеживать судьбу клеток, или из одной клетки в популяции клеток. Теперь люминесцентные ячейка имеет, таким образом, Акуикрасный свою biosignature и может быть определена как Barcoded. Его уникальная biosignature идентифицирует его от других клеток, и, что важно, отличает его от клеток генетически измененных выразить различные белки люминесцентные различимы спектров поглощения / излучения. Биологические приложения, такие как отслеживание факторов перепрограммирования к плюрипотентности 33, анализ субъядерных факторов для выяснения ядрышек локализации 34, строительство люминесцентных репортер плазмид для транскрипции исследований 35 или генетического маркирования нейронов для изучения нейронной сети архитектуры 36 , всего четыре примеры многих, которые эксплуатируются различные гены флуоресцентного белка для той же экспериментальной установке.

Проточной цитометрии был широко используются для анализа биологических процессов на уровне одной клетки, такие как экспрессии генов, клеточного цикла, апоптоза и передачи сигналов через фосфорильнойция 37-43 .The стабильная экспрессия люминесцентных генов белков в клетках млекопитающих еще больше повышает полезность проточной цитометрии для анализа клеток 38,44 и лиганд-рецепторных взаимодействий 45. Расширенные возможности позволили проточной цитометрии, чтобы стать широко используются методология высокой пропускной и высокого содержания скрининга 46. Несмотря на в настоящее время расширенного ряда флуорометры и робототехника технологий, которые могут систем читатель пара плита, изображения и проточной цитометрии, там, кажется, отсутствие в опытно-конструкторских, которые могут использовать и подходят эти расширенные технологические возможности.

Быстрый, надежный, простой и надежной методологии на основе клеток являются резко необходимы для мультиплексированных приложений, которые дальнейшего повышения высокой пропускной способности. Это особенно верно в области открытия лекарств, где анализы инженерные основе клеток в мультиплексной формате может повысить мощность высокопроизводительного скрининга 39,47-50 . Multiplexing, так как она позволяет одновременно анализ в одном образце, еще больше повышает возможности с высокой пропускной способностью 51-54. Флуоресцентный генетического штриховое кодирование позволяет не только элегантной мультиплексирования, но после того, как инженерии, избежать необходимости протоколов времени, снижает затраты в сопровождении с антителами, шариков и пятен 39,52,55, и может уменьшить количество экранов, необходимые для высокого высокой пропускной способности. Недавно мы описали, как ретровирусный технологии могут повысить мультиплексирование через флуоресцентного генетического штрих-кодирования для биологических применений, путем экспрессии продукта по результатам анализа ранее разработанный, чтобы контролировать ВИЧ-1 протеазы с различными 56,57 клинически распространенных вариантах 58. Методология поясняется в более описательный характер внимание на том, как выбрать и усилить генетически флуоресцентные штрих-кодом клетки и как производить панели клоновых популяциях, выражающие различные флуоресцентные белки и / или другой флуоресценции intensitх гг. Панели клеточных популяций различимых на основе их флуоресцентных характеристик повышения мультиплексированных возможности, которые могут быть дополнительно эксплуатируемых в комбинации с анализов на основе клеток, направленных на решение различных биологических вопросы. Протокол также описывает, как спроектировать панель со штрих клеток, несущих один из анализов на основе клеток ранее разработанных в лаборатории, в качестве примера 59. Этот протокол, таким образом, не предназначены, чтобы показать устоявшуюся ретровирусную / Lentiviral технологии для передачи генетического, значение флуоресцентных белков или приложения проточной цитометрии 60,48, а чтобы показать повышая мощность объединения трех для мультиплексированных применений.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Подготовка клетках млекопитающих, вирусный производства и трансдукции генной штриховое кодирование

  1. Пластинчатые 2,5 × 10 6 адгезивные клетки в 10 см пластины (или около 50-60% слияния) за один день до трансфекции в модифицированной Дульбекко среде Игла (DMEM) с добавлением 10% фетальной телячьей сыворотки (FCS). Для ретровирусов использование для производства упаковки клеточной линии выбора, таких как Феникс-GP (своего рода подарок от Гарри Нолан, Стэнфордский университет).
    ПРИМЕЧАНИЕ: упаковка клеточная линия стабильно выражает Gag и Pol протеинов для формирования ретровирусов частиц в транс. Убедитесь, что клетки здоровы и присоединились к пластине в виде монослоя, до трансфекции.
  2. 24 ч спустя, подготовить трансфекции ДНК смесь.
    1. 125 мкл бессывороточной DMEM добавить 3 мкг Вирус везикулярного стоматита гликопротеина оболочки вектор (PCI-VSVg) и 3 мкг передачи вектора, несущего ген флуоресцентного белка. Смешайте и добавьте 15 мкл polyethylimine (2 мг / мл).
    2. Инкубируют смесь при комнатной температуре в течение 15 мин и добавляют к клеткам каплям.
      Примечание: Polyethylimine добавляется к однородной смеси ДНК в качестве реагента для трансфекции для формирования polyplexes. Для того чтобы получить вирусные частицы, несущие различные флюоресцентные маркеры белка, выполнять каждый независимо друг от друга трансфекции с маркером по выбору. Следует помнить, что ретровирусный вектор переноса составляет около 7 кб в длину и не могут быть упакованы, если выше 10 кб.
  3. Планшеты инкубируют при 37 ° С. Для того чтобы увеличить производство вирусных место пластины при температуре 30 ° С или 32 ° C вместо.
    Примечание: 24 ч после трансфекции носители могут быть заменены 7 мл свежей среды, и, хотя это может улучшить здоровье клеток, что может снизить вирусную нагрузку в надосадочной жидкости.
  4. 48 часов после трансфекции собрать супернатант, содержащий вирусные частицы и фильтр с размером пор 0,45 мкм политетрафторэтилена фильтра. Используйте только что собранной вирусной супернатант для трансдукции. Othслучае производимые держать супернатант в аликвотах при -80 ° C и избежать замораживания-оттаивания. Помните, что титр вируса будет уменьшаться, вероятно, до 50% с каждого цикла замораживания-оттаивания.
  5. Линия Plate ячейка выбор 24 ч до трансдукции, если единомышленником, или непосредственно перед трансдукции, если не соблюдают. Семенной 2,0 х 10 5 до 3,0 × 10 5 прилипшие клетки (в данном случае Ха 7.5.1 и НЕК 293Т) или 5,0 х 10 5 на 1 × 10 6, не прилипшие клетки (здесь SupT1) на лунку в 6-луночный планшет.
    Примечание: Убедитесь, что для калибровки количество клеток, чтобы быть заполнена до трансдукции, особенно для адгезивных клеток, так клетки достичь слияния составляет около 60% в момент трансдукции.
  6. Добавить 5 мкг / мл Полибрен (hexadimethrene бромид), чтобы посеянных клеток, а затем добавить ранее собранной вирусной супернатант, чтобы получить 20-40% инфекции (здесь 2 мл).
    ПРИМЕЧАНИЕ: МВД или процент заражения в основном произвольным, поскольку сортировка позволит усилить и любое subpopulatионов из клетки. Очевидно, что более высокий уровень заражения облегчает и ускоряет процесс усиления.
  7. Трансдукции клеток центрифугированием в роторе ковша висит в 1500 мкг в течение 120 мин при 32 ° С. Ресуспендируют неадгезированных клеток свежей средой перед инкубацией. Для адгезивных клеток, заменить свежей средой 24 ч после трансдукции.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется, чтобы запечатать пластины перед центрифугированием с парафином, чтобы избежать выплескивания. Для увеличения генетически штрих-кодом разнообразие клеток, преобразовывать клетки с вирусными частицами, осуществляющих различные флуоресцентные белки (полученный на стадии 1.4). При выборе флуоресцентных маркеров, убедитесь, что они совместимы с приборами, и они имеют различимые флуоресцентные параметры.

2. Выбор и усиления генетически Barcoded клеток

  1. Анализ трансдуцированных клеток млекопитающих с помощью проточной цитометрии по меньшей мере, 72 часов после трансдукции для количественного определения процентной ставки трансдукции, Используйте сравнимую линии, не трансдуцировали клеток в качестве отрицательного контроля.
    ПРИМЕЧАНИЕ: как сортировка будет использоваться для очистки отдельных популяций штрих-кодом клеток, высокой процентной ставкой первоначального трансдукции, в то время как не надо, следует ускорить процесс усиления.
  2. Использование сотового сортировщик выбора, чтобы получить клетки, которые экспрессируют белок, представляющий интерес.
    1. Для этого, убедитесь, что ворота правильно установить в нужных каналов.
      1. Для этого используйте один и тот же наивный клеточной линии в качестве отрицательного контроля и установить напряжение параметр / канал, так что отрицательный население ниже значения 10 3 на каждой люминесцентной оси. Определить стробирования для положительного флуоресценции как события, которые появляются выше, чем отрицательного контроля для каждого флуоресцентного канала.
    2. Помните, что каждый инструмент может изменяться и правильное напряжение для определения стробирования должны быть соответствующим образом скорректированы, делая положительные и отрицательные контроли императив в каждом ехрerimental настройки.
      1. Для обнаружения флуоресценции в этой экспериментальной установки использовать канал FITC (530/30 полосовой фильтр сопровождаемое 502 длинный пас фильтра) для EGFP, РЕ канал (585/42 полосовой фильтр сопровождаемое 556 длинный пас фильтра) для тд Помидор и канал АРС (660/20 полосовой фильтр) для Е2 Темно-красного.
        ПРИМЕЧАНИЕ: 488 нм лазер возбуждает EGFP и т.д Помидор, а E2 Багровый возбуждается 633 нм лазера.
  3. Сортировка в 15 мл конические пробирки с 1 мл 100% FCS.
    ПРИМЕЧАНИЕ: процесс сортировки флуоресцентные клеточных популяций не является обязательным, как можно непосредственно приступить к своего рода индивидуальных клонов (см ниже). Сортировка жесткие населения зависят от выбранной флуоресценции обеспечивает население резервного копирования для будущего выбора отдельных клонов. Имейте в виду, что отдельные клетки порой трудно расти, а большая популяция клеток может быть легко заморожены, а затем разморожены и усиливается на более позднем этапе.
  4. Spв вниз отсортированных населения в подвесной ведро ротора центрифуги на 524 г при 32 ° С в течение 5 мин для осаждения клеток. Повторное приостановить в 1 мл свежей средой и повторно пластины клеток таким образом, что клетки конфлюентности ниже 60%, чтобы обеспечить рост и деление, по крайней мере, двух дней.
    1. Например, пластины прилипшие клетки в около 3 х 10 5 клеток в 2 мл среды на лунку в 6-луночный планшет и 2 × 10 6 клеток в 2 мл среды в 6 см пластины. Использование DMEM для адгезивных клеток и RPMI для не-адгезивные клетки (или любой указанной среде при необходимости). Поместите плакированные клетки в инкубаторе при 37 ° С в течение нескольких дней, чтобы позволить амплификации.

3. Получить клоновых популяциях генетически Barcoded клеток с различной интенсивностью

  1. Получение клональных популяций клеток из первоначально трансдуцированных (шаг 1,7) или из отсортированного населения (этап 2.3).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это обеспечит равномерное или аналогичный уровень экспрессии флуоресцентного белка среди всех клеткес в популяции (плотно население с небольшим резюме в средней интенсивности флуоресценции на 40%).
    1. С этой целью, вроде отдельные клетки в 96-луночных планшетах с блоком автоматизированной осаждения клеток (АСДУ). Установите ворота для сортировки по населению, представляющих интерес. Обеспечить ворота устанавливаются по крайней мере, один журнал масштаба на части, чтобы получить различимые населения при выборе клеток при различных флуоресцентных интенсивности. Для процедуры, показанной здесь, используют один и тот же проточной цитометрии экспериментальной установки, как описана на стадии 2.2.
  2. Amplify отдельных клонов в термостате при 37 ° С в течение по меньшей мере 2 недель. Через процесс амплификации анализа клеток под микроскопом, чтобы гарантировать, что рост численности населения возникают из отдельных клеток, а не из более чем одного.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Помните, что сортировщик будет разместить одну ячейку на лунку в среднем, и, хотя некоторые скважины не могут иметь любую ячейку на всех, другие могут иметь более чем один.
    1. Чтобы убедиться, что ПОмахинация развивается из одной клетки только чрезвычайно нежны с плиты и никогда не беспокоить скважин с помощью пипетки. Обратите внимание на пластину, а хорошо, под микроскопом.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Хотя отдельные клетки могут порой трудно определить, когда они начинают делиться, они будут легко узнаваемы.
    2. Помните, что часто клетки "комок" по краям. Отменить эти скважины, где можно наблюдать несколько клоновых населения и сохранить те, что есть один жесткий населения.
      Примечание: Желательно, чтобы передать те, в более крупные пластины для усиления.
  3. Экран предполагаемые клоновых населения путем анализа их с помощью проточной цитометрии. Сравнение их отрицательного контроля с использованием того же проточной цитометрии экспериментальной установки.
    1. Анализ только процент от образца и держать остальных в качестве резервного. Выберите наиболее отчетливо отдельные популяции, основанные на средней интенсивности и плотности населения. Усильте их по мере необходимости или заморозить акции взамораживания средств массовой информации с 20% глицерина при -80 ° С в течение коротких периодов времени или жидким азотом для дольше.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Помните, что "истинный" клональный население должно иметь очень плотный узор флуоресценции.

4. Убедитесь, мультиплексирования возможности для высокопроизводительного скрининга (HTS)

  1. Зерноуборочный как много различных клоновых популяций, которые при необходимости могут быть дополнительно использованы в мультиплексном формате. Выберите клонов с различимым поглощения / спектрах испускания и / или разной интенсивности. Если формат 96-луночный планшет используется, который подходит для HTS, семян 50000 клеток в 200 мкл на лунку.
    Примечание: имейте в виду, что количество клеток только ориентировочным и может быть изменяются в зависимости от типа клеток и является ли это приверженец или нет.
  2. Анализ образца с помощью проточной цитометрии, чтобы гарантировать, что каждый из независимых установленных клеточных линий флуоресцентных можно отличить друг от друга. Перед анализом готовят отрицательноеи одиночные управления цветом для настройки параметров и значений компенсации.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Настройка параметров четко различать смешанные популяции позволит им в дальнейшем использоваться в мультиплексной формате.

5. Адаптация генетически Barcoded клеточных линий на биологической применения выбор

  1. Трансдукции, установленные генетически Barcoded клеточных линий с вирусными частицами, которые содержат анализа элементов выбора, как описано здесь, в Stolp и др., 2013 59. Следует помнить, что этот анализ выбора должен занимать дополнительные и различимый флуоресцентный канал и, таким образом, он должен быть переведен в соответствующее Barcoded клеточной линии.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Каждый штрих-кодом клеточная линия может нести различное анализа.
  2. Сортировать генетически флуоресцентные Barcoded клетки для тех, которые содержат опробования элементов.
    Примечание: Аналитические элементы могут быть сконструированы в сочетании с меткой или флуоресцентного белка (в виде гибрида или через внутренний сайт входа рибосомы) Fили просто обнаружение через вестерн-блоттинга, проточной цитометрии или микроскопии. Система используется в данном протоколе зависит от эпитопа HA поверхностной экспрессии в одиночку, или с дополнительной экспрессии эпитопа FLAG.
    1. Пятно клоновых населения, содержащие анализ с HA и APC-флуоресцентной связанных антител. Тогда проанализировать клоновых населения с анти-FLAG и окрашивания FITC-конъюгированных антител.
    2. Для отслеживания обратно анализ, анализ или «декодировать» население в соответствующем канале, где различные генетически Barcoded клеточные линии могут быть выделены. Здесь декодировать природы подложки на основе анализа в канале PE для обнаружения тд томатов.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мультиплексирование флуоресцентный генетически Barcoded клеток с целью биологических применений может быть достигнуто только когда отдельные клоновых популяции были получены. Multiplexing является наиболее эффективным, когда штрих-кодом группы населения имеют четкие различных флуоресцентных характеристик с минимальными спектрального перекрытия. В примере, показанном на фиг.1, с клональных популяций млекопитающих SupT1 клетки показывает, что Barcoded клетки с mCherry и циано флуоресцентного белка (CFP) м...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Вот два хорошо установленных процедур были объединены; генная инженерия через ретровирусов технологии и обнаружения флуоресцентных белков с использованием проточной цитометрии. Флуоресцентного белка на основе генетического штрих кода для производства уникальных клеточных линий обеспечивает надежную и простой способ для мультиплексированных применений. Создание генетически модифицированных штрих-кодом клетки через ретровирусов технологии, изначально длительный процесс, но позволяет получить после того, как установлено, н...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы не имеют ничего раскрывать.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы хотели бы поблагодарить д-ра Гарри Нолан из Стэнфордского университета для обеспечения упаковки клеточной линии Phoenix GP для производства ретровирусных частиц. Мы благодарим доктора Роджера Цяня из Калифорнийского университета в Сан-Диего для обеспечения TD помидор. Мы хотели бы также поблагодарить Сан-Диего государственный университет проточной цитометрии основной комплекс для их обслуживания и помощи.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Шприцы 10 млBD309604используются для фильтрации вируса
0,45 мкм; m ploytetrafluoroethylene filterPall Corporation4219используется для фильтрации вируса
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)Corning45000-304клеточная питательная среда для клеток HEK 293T
PEI (Polyethylenimine)poly sciences23966-2используемая концентрация 2 мг/мл
Висячая центрифуга (охлаждаемая)Eppendorf5805 000.017используемая для Спиновая инфекция
PBS (фосфатно-солевой буфер)Corning21-040-CVиспользуется для промывания клеток
Полибрен (гексадиметрина бромид)Sigma-Aldrich107689используется для повышения эффективности вирусной инфекции. Используется в 5 & микро; Концентрация г/мл.
Прибор FACSAriaBD Biosciencesдля сортировки клеточных популяций
Прибор FACSCantoBD Biosciencesдля анализа клеток
Phoenix-GPGift от Гэри Ноланадля производства ретровирусных частиц
Сыворотка теленкаплода MediatechMT35015CVдля выращивания и сортировки клеток
SupT1 ATCCCRL-1942Человеческие Т-лимфобласты
HEK 293T клеткиATCCCRL-11268Эмбриональные клетки почек человека, которые также содержат SV40 большой Т-антиген
RPMI 1640Corning10-040-CVклеточная питательная среда для клеток SupT1

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W. W., Prasher, D. C. Green fluorescent protein as a marker for gene expression.Science. 263 (5148), 802-805 (1994).
  2. Misteli, T., Caceres, J. F., Spector, D. L. The dynamics of a pre-mRNA splicing factor in living cells. Nature. 387 (6632), 523-527 (1997).
  3. Godwin, A. R., Stadler, H. S., Nakamura, K., Capecchi, M. R. Detection of targeted GFP-Hox gene fusions during mouse embryogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (22), 13042-13047 (1998).
  4. Irish, J. M., et al. Single cell profiling of potentiated phospho-protein networks in cancer cells. Cell. 118 (2), 217-228 (2004).
  5. Natarajan, L., Jackson, B. M., Szyleyko, E., Eisenmann, D. M. Identification of evolutionarily conserved promoter elements and amino acids required for function of the C. elegans beta-catenin homolog BAR-1. Dev Biol. 272 (2), 536-557 (2004).
  6. Tumbar, T., et al. Defining the epithelial stem cell niche in skin.Science. 303 (5656), 359-363 (2004).
  7. Valencia-Burton, M., et al. Spatiotemporal patterns and transcription kinetics of induced RNA in single bacterial cells.Proc. Natl Acad Sci U S A. 106 (38), 16399-16404 (2009).
  8. Mahmoud, L., et al. Green fluorescent protein reporter system with transcriptional sequence heterogeneity for monitoring the interferon response.J Virol. 85 (18), 9268-9275 (2011).
  9. Saunders, M. J., et al. Fluorogen activating proteins in flow cytometry for the study of surface molecules and receptors.Methods. 57 (3), 308-317 (2012).
  10. Wang, Y. L., Taylor, D. L. Probing the dynamic equilibrium of actin polymerization by fluorescence energy transfer. Cell. 27 (3 Pt 2), 429-436 (1981).
  11. He, L., et al. Flow cytometric measurement of fluorescence (Forster) resonance energy transfer from cyan fluorescent protein to yellow fluorescent protein using single-laser excitation at 458 nm. Cytometry A. 53 (1), 39-54 (2003).
  12. Stephens, D. J., Allan, V. J. Light microscopy techniques for live cell imaging. Science. 300 (5616), 82-86 (2003).
  13. Clayton, A. H., et al. Ligand-induced dimer-tetramer transition during the activation of the cell surface epidermal growth factor receptor-A multidimensional microscopy analysis. J Biol Chem. 280 (34), 30392-30399 (2005).
  14. Prasher, D. C., Eckenrode, V. K., Ward, W. W., Prendergast, F. G., Cormier, M. J. Primary structure of the Aequorea victoria green-fluorescent protein.Gene. 111 (2), 229-233 (1992).
  15. Heim, R., Cubitt, A. B., Tsien, R. Y. Improved green fluorescence. Nature. 373 (6516), 663-664 (1995).
  16. Shaner, N. C., et al. Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein. Nat Biotechnol. 22 (12), 1567-1572 (2004).
  17. Ai, H. W., Shaner, N. C., Cheng, Z., Tsien, R. Y., Campbell, R. E. Exploration of new chromophore structures leads to the identification of improved blue fluorescent proteins.Biochemistry. 46 (20), 5904-5910 (2007).
  18. Mishin, A. S., et al. The first mutant of the Aequorea victoria green fluorescent protein that forms a red chromophore. Biochemistry. 47 (16), 4666-4673 (2008).
  19. Tsien, R. Y. Constructing and exploiting the fluorescent protein paintbox (Nobel Lecture). Angew Chem Int Ed Engl. 48 (31), 5612-5626 (2009).
  20. Naldini, L., et al. In vivo gene delivery and stable transduction of nondividing cells by a lentiviral vector. Science. 272 (5259), 263-267 (1996).
  21. Klages, N., Zufferey, R., Trono, D. A stable system for the high-titer production of multiply attenuated lentiviral vectors. Mol Ther. 2 (2), 170-176 (2000).
  22. Lai, Z., Brady, R. O. Gene transfer into the central nervous system in vivo using a recombinanat lentivirus vector. J Neurosci Res. 67 (3), 363-371 (2002).
  23. Wolkowicz, R., Nolan, G. P., Curran, M. A. Lentiviral vectors for the delivery of DNA into mammalian cells. Methods Mol Biol. 246, 391-411 (2004).
  24. Grignani, F., et al. High-efficiency gene transfer and selection of human hematopoietic progenitor cells with a hybrid EBV/retroviral vector expressing the green fluorescence protein. Cancer Res. 58 (1), 14-19 (1998).
  25. Ramezani, A., Hawley, T. S., Hawley, R. G. Lentiviral vectors for enhanced gene expression in human hematopoietic cells. Mol Ther. 2 (5), 458-469 (2000).
  26. Roddie, P. H., Paterson, T., Turner, M. L. Gene transfer to primary acute myeloid leukaemia blasts and myeloid leukaemia cell lines. Cytokines Cell Mol Ther. 6 (3), 127-134 (2000).
  27. Zhang, X. Y., et al. Lentiviral vectors for sustained transgene expression in human bone marrow-derived stromal cells. Mol Ther. 5 (5 Pt 1), 555-565 (2002).
  28. Rossi, G. R., Mautino, M. R., Morgan, R. A. High-efficiency lentiviral vector-mediated gene transfer into murine macrophages and activated splenic B lymphocytes. Hum Gene Ther. 14 (4), 385-391 (2003).
  29. Hamra, F. K., et al. Production of transgenic rats by lentiviral transduction of male germ-line stem cells.Proc. Natl Acad Sci U S A. 99 (23), 14931-14936 (2002).
  30. Chan, A. W., Chong, K. Y., Martinovich, C., Simerly, C., Schatten, G. Transgenic monkeys produced by retroviral gene transfer into mature oocytes. Science. 291 (5502), 309-3012 (2001).
  31. Linney, E., Hardison, N. L., Lonze, B. E., Lyons, S., DiNapoli, L. Transgene expression in zebrafish: A comparison of retroviral-vector and DNA-injection approaches. Dev Biol. 213 (1), 207-2016 (1999).
  32. Engelman, A., Mizuuchi, K., Craigie, R. HIV-1 DNA integration: mechanism of viral DNA cleavage and DNA strand transfer. Cell. 67 (6), 1211-1221 (1991).
  33. Tiemann, U., et al. Optimal reprogramming factor stoichiometry increases colony numbers and affects molecular characteristics of murine induced pluripotent stem cells. Cytometry A. 79 (6), 426-435 (2011).
  34. Leung, A. K., Lamond, A. I. In vivo analysis of NHPX reveals a novel nucleolar localization pathway involving a transient accumulation in splicing speckles. J Cell Biol. 157 (4), 615-629 (2002).
  35. Malone, C. L., et al. Fluorescent reporters for Staphylococcus aureus. J Microbiol Methods. 77 (3), 251-260 (2009).
  36. Livet, J., et al. Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system. Nature. 450 (7166), 56-62 (2007).
  37. Krutzik, P. O., Nolan, G. P. Intracellular phospho-protein staining techniques for flow cytometry: monitoring single cell signaling events. Cytometry A. 55 (2), 61-70 (2003).
  38. Violin, J. D., Zhang, J., Tsien, R. Y., Newton, A. C. A genetically encoded fluorescent reporter reveals oscillatory phosphorylation by protein kinase. C.J Cell Biol. 161 (5), 899-909 (2003).
  39. Krutzik, P. O., Nolan, G. P. Fluorescent cell barcoding in flow cytometry allows high-throughput drug screening and signaling profiling. Nat Methods. 3 (5), 361-368 (2006).
  40. Edwards, B. S., Ivnitski-Steele, I., Young, S. M., Salas, V. M., Sklar, L. A. High-throughput cytotoxicity screening by propidium iodide staining. Curr Protoc Cytomt. 9 (Unit 9 24), (2007).
  41. Schulz, K. R., Danna, E. A., Krutzik, P. O., Nolan, G. P. Single-cell phospho-protein analysis by flow cytometry. Curr Protoc Immunol. 8 (Unit 8 17), (2007).
  42. Lu, R., Neff, N. F., Quake, S. R., Weissman, I. L. Tracking single hematopoietic stem cells in vivo using high-throughput sequencing in conjunction with viral genetic barcoding. Nat Biotechnol. 29 (10), 928-933 (2011).
  43. Grant, G. D., et al. Live-cell monitoring of periodic gene expression in synchronous human cells identifies Forkhead genes involved in cell cycle control. Mol Biol Cell. 23 (16), 3079-3093 (2012).
  44. Fiering, S. N., et al. Improved FACS-Gal: flow cytometric analysis and sorting of viable eukaryotic cells expressing reporter gene constructs. Cytometry. 12 (4), 291-301 (1991).
  45. Fay, S. P., Posner, R. G., Swann, W. N., Sklar, L. A. Real-time analysis of the assembly of ligand, receptor, and G protein by quantitative fluorescence flow cytometry. Biochemistry. 30 (20), 5066-5075 (1991).
  46. Edwards, B. S., Oprea, T., Prossnitz, E. R., Sklar, L. A. Flow cytometry for high-throughput, high-content screening. Curr Opin Chem Biol. 8 (4), 392-398 (2004).
  47. Durick, K., Negulescu, P. Cellular biosensors for drug discovery. Biosens Bioelectron. 16 (7-8), 587-592 (2001).
  48. Edwards, B. S., et al. High-throughput flow cytometry for drug discovery. Expert Opin Drug Discov. 2 (5), 685-696 (2007).
  49. Sklar, L. A., Carter, M. B., Edwards, B. S. Flow cytometry for drug discovery, receptor pharmacology and high-throughput screening. Curr Opin Pharmacol. 7 (5), 527-534 (2007).
  50. Curpan, R. F., et al. High-throughput screen for the chemical inhibitors of antiapoptotic bcl-2 family proteins by multiplex flow cytometry. Assay Drug Dev Technol. 9 (5), 465-474 (2011).
  51. Bradford, J. A., Buller, G., Suter, M., Ignatius, M., Beechem, J. M. Fluorescence-intensity multiplexing: simultaneous seven-marker, two-color immunophenotyping using flow cytometry. Cytometry A. 61 (2), 142-152 (2004).
  52. Krutzik, P. O., Clutter, M. R., Trejo, A., Nolan, G. P. Fluorescent cell barcoding for multiplex flow cytometry. Curr Protoc Cytom. 6 (Unit 6 31), (2011).
  53. Surviladze, Z., Young, S. M., Sklar, L. A. High-throughput flow cytometry bead-based multiplex assay for identification of Rho GTPase inhibitors. Methods Mol Biol. 827, 253-270 (2012).
  54. Sukhdeo, K., et al. Multiplex flow cytometry barcoding and antibody arrays identify surface antigen profiles of primary and metastatic colon cancer cell lines. PLoS One. 8 (1), e53015(2013).
  55. Vignali, D. A. Multiplexed particle-based flow cytometric assays. J Immunol Methods. 342 (1-2), 243-255 (2000).
  56. Hilton, B. J., Wolkowicz, R. An assay to monitor HIV-1 protease activity for the identification of novel inhibitors in T-cells. PLoS One. 5 (6), e10940(2010).
  57. Rajakuberan, C., Hilton, B. J., Wolkowicz, R. Protocol for a mammalian cell-based assay for monitoring the HIV-1 protease activity. Methods Mol Biol. 903, 393-405 (2012).
  58. Smurthwaite, C. A., et al. Fluorescent genetic barcoding in mammalian cells for enhanced multiplexing capabilities in flow cytometry. Cytometry A. 85 (1), 105-113 (2014).
  59. Stolp, Z. D., et al. A Novel Two-Tag System for Monitoring Transport and Cleavage through the Classical Secretory Pathway - Adaptation to HIV Envelope Processing. PLoS One. 8 (6), e68835(2013).
  60. Schwartz, A., et al. Standardizing flow cytometry: a classification system of fluorescence standards used for flow cytometry. Cytometry. 33 (2), 106-114 (1998).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Fluorescent ProteinsRetroviral TechnologyFlow CytometryFluorescent Activated Cell SortingGenetic BarcodingMultiplexed ApplicationsCell Based AssaysFluorescent MarkersClonal PopulationsViral Transduction

Related Articles