Функциональная характеристика Na + / H + Теплообменники внутриклеточных отсеках с помощью Протон-убивает Выбор выразить их в плазматической мембране

Краткое содержание

В первой части этой статьи показано, как выбрать мутантные клеточные линии, экспрессирующие везикулярные обменники Na⁺/H⁺ на их плазматической мембране. Вторая часть содержит протоколы, основанные на внутриклеточных измерениях pH и быстром поглощении ионов, которые используются для определения ионной селективности и кинетических параметров этих обменников.

Аннотация

Эндосом подкисление имеет решающее значение для широкого диапазона процессов, таких как переработка белка и деградации, рецептора десенсибилизации и нейромедиаторов нагрузке в синаптических пузырьках. Это подкисление описано быть опосредовано протонных АТФаз, в сочетании с CLC транспортеры хлорида. Высоко-сохраняется электронейтральных протоны перевозчиков, Na ⁺ / H ⁺ теплообменник (NHE) 6, 7 и 9 также выражены в этих отсеках. Мутации в генах были связаны с человеческими когнитивных и нейродегенеративных заболеваний. Как это ни парадоксально, их роли остаются неизвестными, так как их внутриклеточная локализация помешала подробного функционального характеристику. Эта рукопись показывает способ, чтобы решить эту проблему. Он состоит из отбора мутантных клеточных линий, способных выдерживать острую цитозольного подкисление с сохранением внутриклеточного NHEs на плазматической мембране. Затем изображает две дополнительные протоколы для измерения ионов селективность и активностьэтих теплообменников: (I), основанный на измерениях внутриклеточных рН с помощью флуоресцентной видеомикроскопия, и (II), выполненный на базе быстрой кинетики поглощения лития. Такие протоколы могут быть экстраполированы на другие измерения, не электрогенных транспортеры. Кроме того, процедура отбора, представленные здесь формирует клетки с фенотипом дефектного внутриклеточного хранения. Таким образом, эти клетки также выразить другие везикулярного мембранные белки в плазматической мембране. Поэтому стратегия эксперимента изображены здесь может представлять собой потенциально мощный инструмент для изучения других внутриклеточных белков, которые затем будут высказанные на плазматической мембране вместе с везикулярного Na ⁺ / H ⁺ теплообменники, используемые для отбора.

Введение

Большинство внутриклеточных отсеков отображения кислую просвета рН, что является ключевым параметром для созревания, торговли, переработки белков и гормонов и нейротрансмиттеров Загрузка. Было показано, что рН градиент между цитозоле и везикулярной содержания генерируется вакуоли H ⁺ АТФазы ^1, соединенный с везикулярных CLC хлорида транспортеров ^2. И в нокаут (KO) мышей и больных людей, важность этих перевозчиков было выделено тяжелых фенотипов, вызванных мутациями в генах ^3-6.

Члены натрий-водородного обменных SLC9A семьи, также называемый NHEs для Na ⁺ / H ⁺ теплообменников, как было показано, являются ключевыми эффекторами в внутриклеточного рН и регулирования объема клеток, а также в транспортной векторное кислотно-основных эквивалентов по эпителии , Кроме того, в плазматической мембране NHEs, три очень сохраняется Na ⁺ / H ⁺ теплообменники, NHE 6, 7и 9 выражены в транс-Гольджи сеть и в ранних эндосом ^7. Мутации в генах были связаны с Angelman-как или Christianson Синдромы ^8-9 семьи на основе аутизма ¹⁰ и дефицита внимания с гиперактивностью ^11-12. Эти теплообменники также принимали участие в нейродегенеративных проблем, таких как болезнь Альцгеймера восприимчивости ¹³ и Х-хромосомой умственной отсталостью смежных генов синдромов ^14. Взятые вместе, эти исследования подчеркивают важность этих внутриклеточных NHEs в развитии и / или функции головного мозга.

Внутриклеточная локализация этих теплообменников позволяет точные измерения их ионов селективности, направление транспортировки, кинетические параметры и регулирования. Как и в случае для всех перевозчиков, выраженных в внутриклеточных отсеков, крайне трудно оценить их биохимические деятельности и, следовательно, в полной мере понять свои физиологические функции и Mechanизмы лежащие в основе их патологические последствия. Основываясь на высокой цитозольным концентрации K ^+, наиболее общепринятым гипотеза, что они работают как K ⁺ в сочетании протонов отток перевозчиков. Существование такой утечки протонов были предположили, что это может уравновесить протонного накачки по V-АТФазы, с тем, чтобы поддерживать в стационарном состоянии везикулярного рН. Целью этой статьи является визуальной (I), чтобы продемонстрировать способ, который позволяет генетический выбор клеточных линий, которые экспрессируют такие везикулярных транспортеров на их плазматической мембране, и (II), чтобы показать два независимых подхода для измерения функции этих транспортеров.

Три десятилетия назад, Pouysségur и Франки были пионерами генетический подход, который позволил в молекулярное клонирование и характеристика членов семьи NHE ^15. Это было основано на токсичность внутриклеточных протонов в качестве скринингового метода. Первым шагом было получение клеточных линий с дефицитомв любом Na ⁺ / H ⁺ обмена выражены в плазматической мембране, используя обратимость этого транспортера. Фибробласты линии (CCL39 клеток) были с предустановленной Na ⁺ или Li ^+, а затем помещают в кислой внеклеточной среде (рН 6,5) в течение 2 ч. Это привело к смерти клеток, экспрессирующих функциональный Na ⁺ / H ⁺ обмена и к выбору антипортера-дефицитных клеток (линия PS120 клетки) ^16. При культивировании в бикарбоната свободной среде, эти клетки очень чувствительны к острой внутриклеточного подкисления. Следовательно, выражение любого функционального механизма протон оттока в мембране будет положительно выбран (см ^17), если такие клетки представляются острых внутриклеточных acidifications. Такие методы подкисления можно использовать для выделения клеточных линий с торговлей дефекты, позволяющие принудительного экспрессии дикого типа внутриклеточных NHEs на плазматической мембране.

Как эукариотической Na ⁺ / H⁺ Теплообменники электронейтральна, они не поддаются оценке с помощью электрофизиологических методов, которые были использованы с большим успехом для измерения каналов. Эта рукопись поэтому демонстрирует, как для измерения активности этого теплообменника внутриклеточными измерений рН и быстрых кинетики поглощения лития. Как основные понятия же, интересно отметить, что многие процессы, разработанные для раздела выбора также используются непосредственно для функциональных измерений.

Интересно, что мы обнаружили, что дефект оборот присутствует в клеточных линий, выбранных с помощью подхода, описанного в этой рукописи приводит к большей экспрессии других везикулярных белков на плазматической мембране, например, везикулярного калиевого канала TWIK1 ^18. Это указывает на то, к выбору генерального механизма дефектов хранения для везикулярного трансмембранных белков. Следовательно, это процедура отбора, и клетки, которые он генерирует маяпредставляют собой перспективный инструмент для научного сообщества, действующего на мембранных белков внутриклеточных отсеков. Как и методы измерения, представленные здесь, могут быть применимы для изучения других не электрогенных перевозчиков.

Протокол

1. H ⁺ Убийство Выбор

1. Клеточные линии
   1. Стабильно трансфекции NHE-дефицитных клеток (например, CCL39, полученных PS120 клеточную линию ¹⁶⁾ с использованием любой комбинации экспрессирующий вектор млекопитающих и способа трансфекции, который будет производить эффективные выходы и выбор трансфекции в клеточной линии фибробластов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: На протяжении многих лет фосфат кальция осадков ¹⁹ был использован с хорошими выходами трансфекции. Это был заменен более недавно коммерческими реагентами, такими как Lipofectamine2000, Трансфекции выполняется в соответствии с инструкциями изготовителя.
2. Решения
   1. Подготовить три стерильные растворы, описанные ниже. Эти решения стерилизацию фильтрованием (0,22 мкм).
      1. Подготовка NH ⁺ ₄ Загрузка раствора (рН 7,4), содержащего 50 мМ NH ₄ Cl, 70 мМ хлорида холина, 5 мМ KCl, 1 мМ MgCl _2, 2 мМ CaCl _2, 5 мМ GLucose и 15 мм MOPS при рН 7,4.
      2. Приготовьте промывочный раствор (рН 7,0), содержащего 120 мМ хлорида холина, 5 мМ KCl, 1 мМ MgCl _2, 2 мМ CaCl _2, 5 мМ глюкозы и 15 мМ HEPES при рН 7,0.
      3. Готовят раствор для восстановления (рН 7,4), содержащего 120 мМ NaCl, 5 мМ KCl, 1 мМ MgCl _2, 2 мМ CaCl _2, 5 мМ глюкозы и 15 мМ HEPES при рН 7,4.
3. Перед началом выбора, получения клеточной культуры инкубатор, который можно использовать при 37 ° С без дополнительного CO ₂ из внешнего резервуара (называется СО ₂ - "свободный" инкубатор), а 5% СО ₂ приведет к буферизации, что может привести к нарушению подкисление. Amplify клеточной линии, экспрессирующей NHE процентного до примерно 2 х 10 ⁸ клеток (как правило, около 20 сливные 100 мм чашках).
4. H ⁺ убивая процедуру:
   1. Инкубируйте клетки, экспрессирующие внутриклеточный NHE интереса в течение 1 часа в растворе загрузка, по 37 ° C в CO ₂ -свободных инкубатора.
   2. Аспирируйте загрузки раствора, а затем промыть их дважды в описанных выше-промывочный раствор. Выполните этот шаг эффективно устранить остаточную внеклеточный NH ₄ Cl которые наносили бы ущерб создание крутого NH ₄ ⁺ градиент, который будет генерировать подкисление.
   3. Устранить полоскания среды путем аспирации и инкубировать клетки в течение одного часа в растворе для восстановления снова при 37 ° С в свободном инкубаторе СО _2.
   4. Заменить восстановления среды с регулярной культуральной среде DMEM (обычно с 7,5% FCS) и клетки растут в стандартных условиях культивирования (37 ° C в увлажненной атмосфере с 5% CO ₂ и 95% воздуха).
5. Повторите этот цикл отбора два раза в неделю до тех пор, стабильные клоны появляются.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Соблюдайте особую осторожность в отношении культуры клеток и условий отбора. Месяцы работы может быть разрушен каких-либо загрязнений, которые более склонны к OCCur после длительного периода культуры и повторных клеток манипуляций.
   1. Здесь укажите, нужно ли усиливать клонов и характеризуют их по отдельности, как будет описано в разделах 2-3, или объединить их вместе, чтобы создать клеточной популяции до характеристик.
6. Применить Повод (примерно раз в две недели), чтобы сохранить подкисления-устойчивых клеток счетчиком-выбирая те, которые, возможно, вернулся к кислотно-чувствительных фенотип родителей (рис 1б).

2. Внутриклеточные рН Измерения

2.1) флуоресценции рН изображений

1. Используйте Логометрический рН-чувствительных люминесцентные BCECF краситель / AM, который является рН-чувствительного при возбуждении 490 нм и имеет 445 нм изосбестической, следующие протоколы производителя.
   1. Кроме того, использование других рН-чувствительных зондов, следующих протоколов изготовителя.
2. Используйте изображения установлен консостоящей из инвертированного микроскопа, соединенного с видеокамерой высокой чувствительностью. Одета этот набор 450 нм и 490 нм узких интерференционных полос фильтров в паре с подходящим кварцевых нейтральной плотности фильтров для возбуждения.
   1. Если возможно, используйте соответствующий набор фильтров и условий освещения на настройки сопоставимых значений флуоресценции для λ1 и λ2 так, чтобы отношение стремится к 1. Также избегайте базальные значения флуоресценции, установленные либо насыщения или слишком низко, как для λ1 и / или λ2. Это может дать важные артефакты, как и тогда отношение не может уже обнаружены, хотя внутриклеточный pH меняется.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эта система должна позволить быстрое перфузии, покадровой возбуждения на двух вышеупомянутых длинах волн и приобретение на соответствующей длины волны излучения (535 нм для BCECF). Если на персонаже систему с программным обеспечением, позволяющим автоматическое назначение и хранение данных.

2,2) Измерение NHE Вперед деятельности (экструзияПротоны из цитозоля)

1. Подкислите клетки от 1 ч инкубации в растворе NH ₄ ⁺ загрузка (см шаг 1,4) в отсутствие CO _2.
2. Добавить BCECF-AM (5 мкМ конечная концентрация) в растворе в течение последних пяти минут, а затем промойте его с NH ₄ ⁺ загрузки раствора для удаления внеклеточного зонд.
3. Установите клеток на микроскопе и принимать несколько изображений для записи стабильную базовую линию. Заливать промывочный раствор (см. Выше) Это приводит к снижению флуоресценции, соответствующей подкисления.
4. После стабилизации рН, заливать любой из приведенных ниже решений для измерения коэффициента извлечения рН, опосредованных Li ⁺ / H ^+, Na ⁺ / H ⁺ или K ⁺ / H ⁺ обмена. Каждое решение содержит потенциал связи катион быть проверены на H ⁺ обмена. Если один из них транспортируется, это приведет к увеличению флуоресценции при 495 нм, что будет-корреспондентвторых на рейз внутриклеточного рН:
   120 мМ LiCl, 5 мМ KCl, 1 мМ MgCl _2, 2 мМ CaCl _2, 5 мМ глюкозы и 15 мМ HEPES при рН 7,4
   120 мМ NaCl, 5 мМ KCl, 1 мМ MgCl _2, 2 мМ CaCl _2, 5 мМ глюкозы и 15 мМ HEPES при рН 7,4
   125 мМ КСl, 1 мМ MgCl _2, 2 мМ CaCl _2, 5 мМ глюкозы и 15 мМ HEPES при рН 7,4

2,3) Измерение активности обратной NHE

ПРИМЕЧАНИЕ: принцип здесь, чтобы инвертировать трансмембранных ионных градиентов.

1. Перед измерением нагрузки клетки с внутриклеточным катионом интерес (см ниже).
2. Инкубируйте их в течение 5 мин с BCECF / AM (этап 2.2.2); промойте их, установить их на видео микроскопа.
3. Заливать загрузки решением и получить несколько изображений, чтобы записать стабильный базовый уровень.
4. После базового стабилизации, изображения вариации рН, когда клетки перфузии с внеклеточной кислой среде, содержащей 120 мМ хлорид холина, 5 мМ KCl, 1 мМ MgCl _2, 2 мМ CaCl _2, 5 мМ глюкозы и 15 мМ MES при рН 6,5.
5. Для загрузки LiCl, инкубировать клетки в течение 2 ч в растворе, содержащем 120 мМ LiCl, 5 мМ KCl, 1 мМ MgCl _2, 2 мМ CaCl _2, 5 мМ глюкозы и 15 мМ HEPES при рН 7,4. Внутриклеточные литий измеряется атомно-абсорбционной спектроскопии дает значение примерно 60 мм.
6. Для Na ⁺ загрузки, инкубировать клетки в течение двух часов в растворе, содержащем 120 мМ NaCl, 5 мМ KCl, 1 мМ MgCl _2, 2 мМ CaCl _2, 5 мМ глюкозы и 15 мМ HEPES при рН 7,4 в присутствии 1 мМ оуабаина блокировать Na / K АТФ-азы. В этих условиях, внутриклеточная концентрация Na ^+, находится в диапазоне от 40 мм.
   Примечание: К ⁺ загрузки нет необходимости в цитозольной концентрации К ⁺ в пределах от 140 мм и наружу направленной К + градиент, следовательно, легко достичь.

2,4) Лечение и калибровка данных:

Примечание: Этот шаг относится как к прямой и обратной измерений.

1. В конце каждого эксперимента, заливать клеток с раствором 140 мМ KCl, 20 мМ HEPES и 5 мкМ нигерицина доводили до рН между 6,5 и 7,4.
2. Сбор данных, как показали измерения флуоресценции от изображения (уровни серого, представляющие уровни интенсивности) и экспорта в соответствии текстовом формате и лечения, как описано ниже, используя программы электронных таблиц.
3. Рассчитать внутриклеточные значения рН для каждой отдельной клетки или области, представляющей интерес, используя следующее уравнение:
   рН = рКа + (Log (R-Rmin) / (R _макс -R)) X F _{мин (λ2)} / F _{MAX (λ2)}
4. С помощью F _{мин (λ2)} / F _{ма х (λ2)} Коэффициент если есть отбеливание зонда или утечки, что приводит к снижению в 450 нм флуоресценции всей экспериментов. Это, однако, очень редко наблюдается в условиях, используемых в DESсываются эксперименты.
5. Как видно из данных калибровки присутствуют в конце каждого измерения рН, проверить соответствующие расчетные значения отличаются от значений рН, используемых для калибровки. Если это так, то все регулировки экспериментально определенные значения рН до калибровки с помощью следующей процедуры:
   1. Рассчитать следующий фактор (Q, разность между измеренным значениям / разница между значениями калибровки). Умножьте весь набор данных через Q. Сделайте окончательную регулировку путем добавления или вычитания так, что расчетные значения будут равны соответствующие значения калибровки.

3. Измерения начальных скоростей NHE7 быстрыми Li ⁺ Поглощение

1. Семенной клеток на нескольких луночные планшеты (от 6 до 24-а) и подкисляют, используя либо их технику загрузки ⁺ NH _4, описанное выше, или альтернативно нигерицин / бычий сывороточный альбумин (БСА) подкисление описано в ^20.
Промыть пластины в два раза быстрее, используя описанную выше решение промыть, а затем инкубировать клетки в поглощения растворов, содержащих 1-10 мм лития (чуть ниже значений км) и требуемой концентрации катионов и / или ингибиторы, представляющие интерес для желаемого количества времени.
2. Поддержание коротких и последовательных поглощения фотохимических окислителей длительности (как правило, в одну минуту или ниже), чтобы убедиться, что транспорт работает в начальных скоростей условиях. Также убедитесь, что все решения, используемые для поглощения являются изотонический.
3. В конце этого времени поглощения, тщательно предотвращения проникновения среды и промыть клетки четыре раза охлажденным на льду забуференным фосфатом физиологическим раствором (PBS). Выполните следующие моет как можно быстрее (менее 10 секунд для четырех из них идеален), чтобы предотвратить лития отток.
4. Лизиса клеток в 25% -ной азотной кислоты. Применение 250 мкл на лунку 25% -ной азотной кислоты и оставьте на, по меньшей мере 1 ч, затем в каждую лунку лома с концом наконечника пипетки и передавать весь суспензии также в новом миcrocentrifuge трубки.
5. Передача лизата в 1,5 мл микроцентрифужных пробирках отцентрифугированы в течение 5 минут при 15000 х г (комнатная температура), чтобы удалить остатки клеток.
6. Измерьте содержание лития в супернатантах методом атомно-абсорбционной спектроскопии ^21.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Различные компании предоставляют атомные абсорбционные спектрометры, которые должны быть оснащены литиевыми полым катодом лампы. Следуйте инструкциям производителя, как эти машины очень точны, но и весьма сложным.

Результаты

Выбор:

H ⁺ убивая выбор основан на диффузии аммония слабого основания, как показано на фиг.1А. Действие слабых оснований и кислот диффузии на внутриклеточный рН был впервые Вальтер бора и сотрудников ^22. Элегантный идея использовать это явление для создания смертельной подкисление для положительного генетического отбора Затем была разработана Жак Pouysségur ^17. При таком протоколе, внутриклеточный рН падает до примерно 5,5 после стадии промыв...

Обсуждение

Этот протокол описывает, как выбрать клетки, экспрессирующие внутриклеточного Na ⁺ / H ⁺ обменники на плазматической мембране без изменения их первичной последовательности путем сайт-направленного мутагенеза. Эти теплообменники теперь могут быть охарактеризованы.

Этот метод основан на клеточной токсичности внутриклеточных протонов, чтобы выбрать клеточные линии, которые экспрессируют будет везикулярного Na ⁺ / H ⁺ обменники на плазматической мембра...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Стандартное оборудование для уничтожения			клеточных культур Используется для отбора H+, состоящее из множества устройств с различными каталожными номерами
Инкубатор с CO2	Sanyo	MCO15A
Инкубатор без CO2	Heraeus instrument	BB6220
Ламинарный колпак PSM1200NF	Fisher
DMEM medium	sigma	D5796
FBS gold	GE Healthcare	A15-151
Пеницилин/стрептомицин	PAA	P11-010
Трипсин 10x	PAA	L11-003
Атомно-абсорбционный спектрометр с системой печи Zeeman	Thermo Scientific	ICE 3500 GFZ
LiCl	sigma	L4408
Азотная кислота	сигма	438073
Флуоресцентная видеомикроскопия Набор	Leica		Состоит из множества приборов с разными каталожными номерами
Инвертированный автоматизированный микроскоп	Leica	DMI6000B
подставка для микроскопа	Leica	11888906 11888911
		11888377
падающей флуоресценции	Leica	11888901
		11504166
кронштейн мотора	Leica	11888379
		11505234
		11521505
		11522106
Светодиодный передающий свет	Leica	8097321
		8102034
		11521580
моторизованной пластинчатой	Leica	11522068
		11531172
		11521734
		11521719
		11888423
выход камеры	Leica	11888373
		11888393
		11888259
		11888258
		11541510
программное обеспечение для сбора/анализа изображений	Leica	11888375
оптика	leica	11506507
		11506243 11506203
флуоресцентная ксеноновая лампа	leica	DMI6000
камера	hamamatsu	8100601
программное обеспечение		11640905
pH-чувствительный зонд, BCECF-AM	Технологии жизни	B1170
Нигерицин	Sigma	N7143