Экспертиза Rapid допамина Dynamics с быстрого сканирования циклической вольтамперометрии Во интраоральных Tastant администрации в Пробудитесь крыс

Краткое содержание

Быстрые колебания внеклеточного дофамина (DA) опосредуют как обработку вознаграждения, так и мотивированное поведение у млекопитающих. В данной рукописи описывается совместное использование циклической вольтамперометрии быстрого сканирования (FSCV) и внутриперорального введения тастанта для определения того, как тастанты изменяют быстрое высвобождение дофамина у бодрствующих, свободно передвигающихся крыс.

Аннотация

Быстрое, фазовое высвобождение дофамина (DA) в мозге млекопитающих играет решающую роль в обработке вознаграждения, обучении с подкреплением и мотивационном контроле. Циклическая вольтамперометрия с быстрым сканированием (FSCV) — это электрохимический метод с высоким пространственным и временным (менее секунды) разрешением, который используется для изучения фазового высвобождения DA в нескольких типах препаратов. Эксперименты in vitro на отдельных клетках и срезах мозга, а также эксперименты in vivo на грызунах под наркозом были использованы для выявления механизмов, которые опосредуют высвобождение и поглощение дофамина в нормальных условиях и на моделях заболеваний. За последние 20 лет эксперименты in vivo с участием бодрствующих, свободно передвигающихся грызунов также позволили получить представление о дофаминергических механизмах обработки вознаграждения и его обучения. Одним из основных преимуществ бодрствующей, свободно движущейся подготовки является возможность исследовать быстрые флуктуации DA, которые привязаны по времени к конкретным поведенческим событиям или для поощрения или подачи сигнала. Тем не менее, одним из ограничений экспериментов по комбинированному поведению и вольтамперометрии является трудность диссоциации эффектов DA, специфичных для первичных вознаграждающих или аверсивных стимулов, от сопутствующих флуктуаций DA, которые опосредуют направленное на вознаграждение или другое моторное поведение. В данной статье мы описываем комбинированный метод с использованием FSCV in vivo и интраперальной инфузии у бодрствующей крысы для непосредственного исследования реакции DA на пероральные препараты. В этих экспериментах пероральные вкусовые препараты вводятся непосредственно в нёбо крысы в обход поведения, ориентированного на вознаграждение, и произвольного питьевого поведения, что позволяет напрямую исследовать реакцию DA на вкусовые стимулы.

Введение

Фазовое высвобождение DA играет важную роль в посредничестве в поведении, направленном на вознаграждение ^[1-3]. Тем не менее, выделение и изучение того, как первичное вознаграждение изменяет фазовое высвобождение DA, часто осложняется сопутствующими поведенческими или когнитивными процессами, которые также способны изменять фазовое высвобождение DA, такими как процессы принятия решений или моторное поведение, направленное на вознаграждение, для получения вознаграждения. В данной работе мы выделяем фазовые ответы DA на вкусовые препараты с помощью использования циклической вольтамперометрии in vivo с быстрым сканированием (FSCV) в сочетании с доставкой тастанта через внутриротовые канюли. Эта методика позволяет обойти выбор и действие и исследовать высвобождение внеклеточного DA при прямом введении препарата в небо крысы.

FSCV — это электрохимический метод с высоким временным и пространственным разрешением, позволяющий измерять высвобождение DA в дискретной локальной области (примерно 100 мкм) в масштабе менее секунды (разрешение 10 Гц). Комбинация интраоральной доставки и FSCV обеспечивает преимущество наблюдения за быстрыми реакциями DA на тест в режиме реального времени, которые не могут быть исследованы с помощью обычных методов микродиализа. Кроме того, фазовое высвобождение DA в ответ на вознаграждение или сигналы, связанные с вознаграждением, происходит в концентрациях в диапазоне 20-100 нМ, что выше порога обнаружения FSCV в 10-20 нМ ^[4]. Высокое пространственное разрешение FSCV также позволяет вести запись из субобластей небольших областей мозга, таких как ядро прилежащего ядра (NAc). Таким образом, FSCV в сочетании с внутрипероральными инфузиями вкусовых добавок является идеальной моделью для изучения того, как вкусовые вещества или другие стимулы изменяют фазовое высвобождение DA у бодрствующих, ведущих себя животных. Действительно, эти методы позволили провести эксперименты, изучающие, как вознаграждающие и аверсивные вкусовые добавки изменяют высвобождение внеклеточного DA ^[5].

За последнее десятилетие анализы FSCV были успешно объединены с парадигмами внутривенной доставки наркотиков ^[6] и самовведения крыс ^{[7, 8]} для определения роли механизмов фазового DA в моделях наркомании. Кроме того, комбинированная интраоральная доставка с FSCV была использована для изучения того, как сигналы тревоги в сочетании с доступностью кокаина модулируют фазовое высвобождение DA и поведенческие реакции, отражающие эмоциональный аффект ^[3]. Эта комбинированная интраоральная методология и методология FSCV также может быть эффективно использована для изучения фазических реакций DA на ароматизаторы, такие как ментол и пероральные подсластители, которые добавляются в сигареты и растворимые табачные изделия ^[9-11]. Хотя многие ароматизаторы, добавляемые в табачные изделия, являются аппетитными ^[9-11], неизвестно, увеличивают ли эти ароматизаторы фазовое высвобождение DA таким образом, чтобы это соответствовало благотворной гедонической валентности. Действительно, ароматизаторы, добавляемые в сигареты и растворимые табачные изделия, могут оказывать прямое воздействие на систему вознаграждения DA и могут действовать через дофаминергические механизмы, влияя на валентность вознаграждения сигарет и других табачных изделий. Таким образом, интраоральная доставка в сочетании с FSCV может дать новое понимание того, как ароматанты модулируют быстрое высвобождение DA. Использование комбинированной методики интраорального приема и FSCV in vivo, а также данные, полученные в результате таких исследований, также могут способствовать будущим исследованиям для определения того, как ароматизаторы и никотин взаимодействуют друг с другом, изменяя передачу сигналов DA и потенциально модулируя никотиновое усиление. Кроме того, данные, полученные в результате таких исследований, могут быть использованы для принятия нормативных решений в отношении ароматизаторов табачных изделий.

Протокол

Все эксперименты были проведены в соответствии с Национальными Институтами (NIH) Руководство здравоохранения для ухода и использования лабораторных животных и были одобрены Институциональные уходу и использованию животных комитета Йельского университета (IACUC) по.

1) Предварительно хирургические Препараты

1. Оральный приготовления раствора
   1. Создание решения 10% сахарозы и 0,005% L-ментола в деионизированной воде (рН 7,4). Храните эти решения в закрытых контейнерах, при комнатной температуре, и переделать каждые 2 недели, чтобы предотвратить деградацию.
2. Калибровки электрода решения
   1. Сделать Трис буфера (рН 7,4) в любой момент до калибровки. Решение состоит из 12,0 мМ Трис-HCl, 140 мМ NaCl, 3,25 мМ KCl, 1,20 мМ CaCl2, 1,25 мМ NaH2PO4, 1,20 мМ MgCl _2, и 2,00 мМ Na ₂ SO _4.
   2. Создание исходного раствора 10 мМ дофамина (DA гидрохлорида допамина) в 0,1 М раствора хлорной кислоты. Хлорная кислота помогает предотвратить окисление допаминае. Храните этот маточный раствор при -20 ° C и использовать в течение 6 месяцев. Сделайте несколько аликвот DA раствора для хранения для использования каждый аликвоту только один раз.
   3. Из складе 10 мМ Д.А., разбавленные растворы в трис-буфере до концентрации 1 мкМ, 500 нМ, 250 нМ, 125 нМ, 62,5 нМ, и 31,25 нМ.
   4. Для калибровки рН, готовят растворы Tris буфер с рН 7,2, 7,3, 7,5, и 7,6. Это обеспечит решения, которые имитируют рН сдвиги, которые могут возникнуть в ходе эксперимента в естественных условиях.
3. Изготовление электродов
   1. По вакуумного вакуумом, аспирации Т-650 углеродного волокна (7 мкм в диаметре) в боросиликатного стеклянного капилляра (длина 10 мм, внешний диаметр 0,6 мм, внутренний диаметр 0,4 мм).
   2. Поместите стеклянный капилляр, заполненный углеродного волокна в вертикальной электрода съемник. Для начальных параметров, установите обогреватель до 55.0 и выключите магнит. Тем не менее, дальнейшая оптимизация может быть необходимо и как нагреватель и магнитные параметры различаются птом лаборатории в лабораторию.
      Примечание: Электрод должен быть не менее 5,5 см (в том числе конусности), так что он может легко устанавливаться в микроманипулятором и быть вставлен по меньшей мере, 6,9 мм ниже твердой мозговой оболочки в головном мозге крыс. Если электрод является слишком коротким, записи из брюшной части прилежащего ядра не будет достижима. С другой стороны, общая длина электрода не должна превышать 6,5 см, иначе будет слишком долго, чтобы вписаться в микроманипулятора.
   3. С помощью светового микроскопа, сократить подвергается углеродного волокна так, что она простирается 75-100 мкм за пределами конца стекла. Убедитесь, что электрод имеет очень плотно, едва различимый, уплотнение между стеклянного электрода и углеродного волокна, которое будет производить минимальное шум во время последующей записи. Откажитесь от электрода, если есть какие-либо заметные трещины в стекле или если печать ослаблен, что свидетельствует о плохой печатью. Для получения более подробных инструкций см [12] и [13].
4. Сборка электрод в микрофонromanipulator
   1. Получить 3 в, 30G провод, который изолирован вдоль половины длины провода и использовать маленькую кисть, чтобы применить тонкий слой серебра рисовать непосредственно к проводу. Сразу после нанесения краски серебра, вставьте провод в отверстие на верхней части электрода, чтобы обеспечить физическую и электрическое соединение с углеродным волокном. Под микроскопом, убедитесь, что провод серебра вступает в контакт с углеродным волокном.
   2. Закрепите серебряной проволоки и электродов в микроманипулятора использованием термоусадочной.
   3. Поместите подготовленную углеродного волокна электрода в очищенной изопропилового спирта (IPA) в течение, по меньшей мере 10 мин, чтобы очистить поверхность электрода и последующее увеличение чувствительности к допамина. После вымачивания в ПНД, промыть углеродного волокна с водопроводной водой, чтобы удалить IPA.
5. Электрод изготовление
   1. Возьмите 13 мм серебряную проволоку, содержащую приблизительно 6 мм Ag / Ag Cl сетки (7 мм серебряную проволоку в одиночку, 6 мм сетка, диаметр 0,4 мм),сократить серебряную часть примерно до половины своей первоначальной длины и припаять серебряную часть провода к золотой булавкой.
   2. Применить эпоксидную смолу на припой на булавки.
   3. Падение Ag / Ag Cl сетки конец в сополимер 5% политетрафторэтилен и перфтор-3,6-диокса-4-метил-7octene-сульфоновой кислоты в 5 раз, с периодами 30 мин сушки воздухом между каждым погружением.
   4. Разрешить покрытием Ag / Ag Cl сетки, чтобы воздух сухой O / N.
   5. Лечение в духовке при 120 ° С в течение 1 ч.

2) Комбинированный Интраоральная хирургии и хирургии внутричерепного катетеризации (примерно 75 мин)

1. Оральный изготовление катетера
   1. Сделать устный катетер, и стерилизовать стерилизации оксидом этилена, по крайней мере, за 10 дней до операции.
   2. Вырезать PE 100 трубки в 6 см длиной сегментов.
   3. Использование паяльник, расплавить один конец трубки PE и сразу нажмите на твердой поверхности, чтобы охладить трубы PE. Результат должен создатьнебольшой, плоский диск на одном конце трубки PE и не должны фланцевое. Используйте иглу (18 G) или нажать штифт, чтобы создать дыру в центре этого диска.
   4. С другой конец трубки PE, плотно вставить тупой конец иглы 18 G в трубу.
   5. Используя стандартный перфоратор бумаги отверстие, удар несколько круговых куски политетрафторэтилен листа (толщиной 3,18 мм, 6 мм в диаметре), чтобы создать политетрафторэтилен шайбы.
   6. Создать отверстие в центре шайбы. Возьмите иглу, присоединенную к трубке PE и задвиньте его через шайбу. Как только игла через, слайд шайбу в нижней части трубки PE, так чтобы она была вровень с шайбой.
2. Хирургическая стоматология
   1. После стерилизации хирургических инструментов, канюлю (обрезается до 2,5 мм ниже пьедестал перед стерилизацией), и электрод сравнения, анестезию крыс путем внутрибрюшинной инъекции кетамина (100 мг / кг) и ксилазина (10 мг / кг).
      1. Мтер 5 мин, применять вредные тест стимула (ноги или хвост щепотку), чтобы оценить уровень анестезии. Если предметом показывает любую физическую реакцию на испытания вредных стимулов (дрогнул ответ, увеличение дыхательной или сердечно-курсу), администрирование кетамин повышение на 10% до 15% от первоначальной дозы и повторить протокол вредных стимулов выше.
   2. После крыса полностью под наркозом и не показывает никакой реакции на тест вредных стимулов, использовать машинки для стрижки волос животных для бритья мех крысы из глаз около 2 мм позади ушей. Затем поместите крысу на тонкой воды рециркуляции грелку для поддержания температуры тела во время операции. Применить глаз смазку. Администрирование нестероидные противовоспалительные (НПВП) препарат, Carprofen (5 мг / кг), по внутрибрюшинно перед выполнением каких-либо разрезов и до введения канюли внутриротовые. Используйте асептики во все времена.
   3. Применение бетадин с последующим 70% -ным этанолом, чтобы очистить кожу. Повторите 3 раза.
   4. Пласе крысу на спину, и открыть рот с помощью стерильного ватного тампона. Найти первый верхний коренной зуб.
   5. Вставьте иглу в ткань между щекой и первой верхней мол, пока игла не выходит позади и медиальнее ушах.
   6. Пирс иглу через кожу, пока трубки PE выходит из кожи и доступен.
   7. Поднимите канюли (захвата самим канюли и не иглы) и закрепите политетрафторэтилен шайбу в моляров, так что катетер остается на месте.
      Примечание: Резка шайбу в форме трапеции и обеспечения его против коренных с плоской стороной, обращенной к щеке делает этот шаг легче.
   8. Возьмем другой политетрафторэтилен шайбу и вставьте его на открытой иглы, вниз пластиковой трубки, и упираться в разрез.
   9. Для обеспечения политетрафторэтилен шайбу, используйте стерилизовать ленты, чтобы создать треугольную "флаг", так что машина не скользит вверх. Безопасный мытьэ к коже крыс и стерилизованного ленты.
   10. Вырезать подвергается катетер, чтобы 2-4 см из трубки подвергаться над головой крысы.
   11. Повторите этапы 2.2.1 через 2.2.10 для другой стороне рта.
3. Внутричерепное хирургия вольтамперометрии
   1. Поместите крысу в стереотаксической рамы и очистить кожу головы животного, используя два этапа скраб (с бетадин скраб с последующим 70% этанола скраба, выполните с повторением 3 цикла).
   2. Используйте стерилизованные иглы нос пинцет и хирургические ножницы, чтобы вырезать 15 х 15 мм сечение кожи головы с.
   3. Аккуратно очистите поверхность черепа, используя стерилизованные хлопок наконечник аппликаторы. Кроме того очистить череп с применением 2 до 3 капель 3% перекиси водорода.
   4. Используйте стереотаксической дрель, чтобы сделать 3 маленьких (диаметром 1 мм) отверстия в черепе для последующей вставки винтов, 1 отверстие для направляющей канюли, 1 отверстие для стимулирующего электрода и 1 отверстие для опорного избранныхехал.
   5. Для записи в ядре NAc, положение направляющей канюли 1,2 мм передней и 1,4 мм латеральнее брегмы. Опустите канюли аппарат до тех пор, пластиковая основа не находится на одном уровне с черепом.
   6. Поместите стерилизовать электрод в полушарии контралатеральный направляющей канюли. Опустите ссылка примерно 2 мм ниже твердой мозговой оболочки.
   7. Расположите стимулирующий электрод 5,2 мм кзади и 1,0 мм сбоку брегмы и опустил 8.0 мм ниже твердой мозговой оболочки целевой вентральной области покрышки (VTA).
   8. Используйте стерилизованные небольшой хирургической отвертки Винты с черепом. Затем вставьте электрод, стимулирующий электрод, и направлять канюли. Наконец, закрепите все компоненты, используя cranioplastic цемента.
   9. За первые 48 часов послеоперационного ухода, управлять нестероидные противовоспалительные препараты (НПВП) Carprofen подкожной инъекции (5 мг / кг). Позвольте по крайней мере 1 неделю для полного хирургического восстановления до выполнения voltamЗапись метрия.
      1. Во время послеоперационного ухода, скрытой полости рта катетеры ежедневно с водой. Обеспечить питание насыщенный в воде в течение 2 дней, чтобы помочь животному в жевании и еды. Обеспечить ежедневный мониторинг потенциальных признаки стресса боли (из-за слабой инфекции или обезвоживания) и обеспечивают надлежащих мер по мере необходимости (в том числе введения жидкостей, местного введения антисептиков и введением НСПВС или Carprofen в дозе 5 мг / кг).

3) вольтамперные Записи в Пробудитесь, свободно движущихся крыс

1. Снижение электрод и приобретения обучающий набор DA.
   1. В день эксперимента, проверить проходимость полости канюли, вливая 200 мкл воды и наблюдая Орофациальные ответов (чтобы убедиться, что крыса дегустации воды).
   2. Прикрепите FSCV headstage к крысе, вставив стимулирующий электрод (на headstage) в биполярной стимулирующего электрода cannuла (на крысах). Таким образом, headstage (миниатюрный преобразователь ток-напряжение) подключается непосредственно к биполярной стимуляции электрода.
   3. Удалить заглушку канюли с канюлей аппарата и применить две капли 50% -ного раствора гепарина в канюлю. Затем аккуратно вставьте фиктивный канюли (чуть больше, что манекен канюли, который ранее был удален), чтобы очистить сгустков крови или глиальных рубцов, которые могли возникнуть, которые будут нарушать углеродного волокна электроды, которые впоследствии будут вставлены в ходе эксперимента. Продлить канюли используется для очистки сгустки 3-4 мм ниже черепа (по крайней мере 2 мм выше места записи).
   4. Вставьте микроманипулятор, с электродом в направляющей канюли и место омега кольцо в положение "закрыто".
   5. Подключите электродный провод от headstage к соответствующему штифта. Затем подключите электродной проволоки работает с микроманипулятора к соответствующему проводу на headstage.
   6. Опустите Elecрастоптал примерно 4-4,5 мм ниже черепа.
   7. Используйте потенциостата применять треугольной формы (400 В / с, -0.4 до +1.3 V). Нанесите сигнала к электроду при 60 Гц в течение по крайней мере 10 мин, затем измените частоту сигнала приложений до 10 Гц в течение последующих экспериментальных записей.
      Примечание: шаг применение сигнала 60 Гц производит устойчивую поверхность углеродного волокна и поможет предотвратить электрический дрейф
   8. Применение электрической стимуляции в ВТА с использованием различных частот (от 10 до 60 Гц) импульсы (от 10 до 30 импульсов) и токи (от 50 до 150 мкА) все с длительностью импульса 2 мс / фазы, чтобы вызвать различные концентрации DA выпуска и рН сдвиги. Приобретать по крайней мере 5 различных концентраций DA-релизе и 5 различных сдвигов рН. Подождите (2 - 3 мин минимум) между раздражениями, чтобы позволить везикулярного перегрузки [14].
      Примечание: Важно, чтобы получить стимуляции, которые производят концентрации DA во всем диапазоне, которые будут собраны в ходе последующегоЭксперимент, так как они будут использованы в качестве обучающего множества для анализ главных компонентов (раздел 5.1).
   9. Опустите электрод в ядре NAC (6.3 мм брюшной к твердой мозговой). Впоследствии снизить электрод с шагом 100 мкм в пределах активной зоны NAc до переходных процессов высвобождения DA не наблюдаются на частотах по крайней мере 1 в мин.
   10. Подключение трубки (внутренний диаметр 1/32 ", наружный диаметр 3/32") на 20 мл шприц, прикрепленной к шприцевой насос. На другом конце трубки, использовать скошенную 23 G иглу для подключения трубки с канюлей крысы. Убедитесь, что трубки полностью заполнен требуемой tastant и убедитесь, что не существует никаких пузырей в трубке.
       Примечание: Как правило, вводить небольшое количество tastant в рот крысы перед записью, чтобы гарантировать, что первое вливание для записи обеспечивает полный объем инфузии и не остаточной воды или воздуха в трубке. Кроме того, это позволяет животному иметь некоторый опыт остроумиеч tastant с новым Tastants, даже с аппетитом те, может быть отвращение изначально из-за своей новизны.
   11. Для сбора данных, влить 200 мкл tastant (6,5 сек с использованием насоса и насосно-компрессорных описано выше). Настаивать tastant каждые 1-3 мин. Настаивать в общей сложности 25 раз в tastant. Каждый инфузии обеспечивает 200 мкл раствора.
   12. Если несколько Tastants доставляются в одном эксперименте, промойте ротовую катетер с водой после сбора данных для одного tastant и подождите не менее 20 мин до вливая новую tastant.
   13. После записи сессии Д.А., подготовить для гистологического подтверждения путем создания небольшой очаг на месте записи. Чтобы сохранить углеродного волокна электрода для последующей калибровки, сначала убрать электрод и снимите микроманипулятор. Затем с помощью нового микроманипулятор со стеклянной микроэлектрода и вольфрамовой проволоки (100 мкм, проходящей за кончик стекла) в той же самой глубине (ниже твердой мозговой оболочки) в качестве исходного углерода FИбер микроэлектрод.
   14. Для гистологического подтверждения, создать небольшой очаг, применяя 3 V на вольфрамовой проволоки и увеличением напряжения с шагом 1 В, каждые 10 сек, пока установка 10 V не достигается.
   15. Если стандартная кривая концентрация уже была создана с помощью нескольких электродов из углеродного волокна, выполнять этап поражения выше (3.1.14), применяя потенциал непосредственно на электрод из углеродного волокна.
       Примечание: Этот метод поражение может привести к повреждению углеродного волокна и предотвратить последующее калибровку с этой конкретной электрода.
   16. Эвтаназии животное, используя смертельную инъекцию пентобарбитала (150 мг / кг, IP).
   17. Выбить headcap с использованием канюли плоскогубцы, потянув прямо вверх по headcap. Не крутите headcap, так как это вызовет ненужные повреждения мозга и сделать его сложным, чтобы определить расположение электрода во время гистологии.
       1. Удалить мозга и место в 4% формалине в течение 3 дней, затем на 30% суCrose в течение 1 недели. Создайте 30 мкм ломтиками, используя криостат, крепление на покровные стекла и изучить ломтики под световым микроскопом, чтобы определить расположение углеродного волокна или вольфрама поражения.
          Примечание: перфузии является обязательным для 3.1.17.

4) Электрод калибровки

1. Использование проточной ячейки, чтобы создать коэффициент преобразования тока концентрации.
   1. Для того чтобы определить чувствительность электрода, калибровки электродов после каждого эксперимента с использованием проточного аппарата "Т-клеток". Опустить электрод в "Т-клеток", а Трис-буфер, рН растворов или растворов DA промывают по поверхности электрода (со скоростью 2 мл / мин). Используйте шесть положение воздушного электромагнитный привод с, чтобы вернуться и вперед между буфером и рН раствора или DA.
   2. Для каждой калибровки, собирать данные вольтамперные течение 5 сек применения трис-буфере (исходный уровень), а затем 5 сек применения рН раствора или DA, затем 20 сек AРИМЕНЕНИЕ Трис буфера (всего файлов 30 сек). Повторите каждый прогон 3 раза для каждой стандартной калибровочной концентрации, уравновешивая между различными концентрациями каждого стандарта.
   3. Для каждого отбора проб, измерения пика DA или рН-вызывала ток. Нормальное пиковый ток через каждом испытании, чтобы получить концентрацию в сравнении пикового отношения тока. Для получения более подробных инструкций см [12] и [13].

5) Анализ данных

1. Использование обучающего множества в основной компонентного анализа (РСА)
   Примечание: Во время эксперимента вольтамперометрии, выход производится как ток, который является результатом окисления дофамина и снижение рН, сдвигов и электрохимического шума. РСА позволяет разделение этих факторов таким образом, чтобы можно выделить нужные компоненты (DA и рН) и удалить дополнительные компоненты, которые могли бы исказить полезные сигналы (для более подробного описания, см ^{15, 16).}
   1. Связать калибровочный коэффициент для йе выходной ток (приблизительно 5-10 нА / мкм) после СПС, чтобы величины концентрации аналитов, которые будут определены.
   2. Используйте набор обучения, полученную в ходе эксперимента по "поезд" модель СПС выделить DA, рН и другие факторы. СПС занимает обучение набор циклических вольтамперограммы (собранной в разделе 3.1.8) и определяет, какие основные характеристики вольтамперограмме могут быть использованы для идентификации каждого аналита, собранную во время в естественных условиях вольтамперограммах записей.
   3. Чтобы определить число главных компонентов, чтобы держать, использовать Малиновского F-тест. Как правило, оставить только 2 или 3 основные компоненты, которые обычно объясняют о 95-99% дисперсии в данных. Для дальнейшего обсуждения реализации F-тест Малиновского, ¹⁷ см.
      Примечание: После того, как количество компонентов определяется, анализ СПС эффективно будет проецировать измеренные вольтамперограммы из DA и обучение рН устанавливает на главные компоненты, которые были сохранены.Результат представляет собой набор данных, которые были отфильтрованы так, что только данные DA (или рН) остается и остаточные данные, что не похожи на DA или рН удаляется (См Представитель результаты ожидаемого результата). Для дальнейшего детального объяснения и шаг за шагом инструкции для использования СПС для вольтамперометрической анализа см Материалы лист и ^{16, 17.}

Результаты

FSCV в сочетании с внутриротовой катетера имплантации был использован для изучения, как сахароза, в аппетитивную tastant, модулирует фазовое DA-релиз в ядре НАК. До tastant инфузии, электрической стимуляции (150 мкА, 60 Гц, 24 импульсов, с указанием красной полосой) в VTA производит надежные увеличение фазовый Д. выпуска в NAC (рис 1) Рис 1 показывает цветную участок с потенциалом на. Ось ординат, время на оси абсцисс, а ток (представлены в условных цветах) на оси. Ниже цвета участка концентрации Д.А. о...

Обсуждение

Интраоральная доставка tastant в сочетании с FSCV позволяет анализ "реального времени" ответов на устные DA ароматизаторами. Есть три важных шагов в протоколе, которые необходимы для успешных измерений DA. Во-первых, собственно имплантация полости катетера имеет решающее значение для доставки ароматизаторов. Обеспечение того, чтобы катетер позади первого моляра и зажатый в место предотвращает катетер от потери проходимости и предотвращает случайное удаление животным. Промывка катетера в течение первых нескольк...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Стимулирующий электрод	ПластикOneOne	MS303/2-A/SPC	при заказе запросите разрез 22 мм ниже постамента
Канюля для электрода	Биоаналитические системы	MD-2251
Стеклянные капиллярные	системы А-М системы	624503
углеродного волокна	Thornel	T650
Съемник электродов	Narishige International	PE-22
Neurolog stimulus isolator	Digitimer Ltd.	DS4
Термоусадка	3M	FP-301
Изолированные провода для электродов	Squires electronics	Custom	L 3.000 x 1.000s x 1.000s UL1423 30/1 BLU
Micromanipulator	Университет Иллинойса в Чикаго, Инженерный механический цех
Эпоксидная	смола ITW Devcon	14250	"5 минут эпоксидная "
Сополимер перфтор-3,6-диокса-4-метил-7октен-сульфоновой кислоты и тетрафторэтилена	Ion Power	LQ-1105	т.е., Nafion
Silver paint	GC Electronics	22-023
Блок питания	BK Precision	9110
Трубки для внутриротовые катетеры	Intramedic	427426	PE 100, I.D. = 0,86 мм; O.D. = 1,52 мм
Трубка для внутриротовой инфузии	Fischer Scientific	02-587-1A	I.D. 1/32"; O.D. 3/32"
Шприцевой насос для проточной ячейки	Pump Systems Inc.	NE 1000
Хирургический цемент	Dentsply Caulk	675571 и 675572
Пневматический привод	VICI	A60	6-позиционный цифровой интерфейс клапана
Цифровой интерфейс	клапана VICI	DVI	230 VAC
Quad Headstage	Университет Северной Каролины, Электроника Центр
электроника UEI Источник питания	Университет Северной Каролины, Электроника Объект
UEI коммутационная коробка	Университет Северной Каролины, Электроника Объект
Источник питания для шприцевого насоса Tastant	Med Associates	SG-504
Tastant Шприцевой насос	Med Associates	PHM-107
Вольфрамовый микроэлектрод	MicroProbes	WE30030.5A3
Серебряная проволока эталонный с AgCl	InVivo Метрическая	E255A
Сахароза	Sigma	80497
Хлорид магния	Sigma	M8266
Хлоид натрия	Sigma	S7653
Хлорная кислота	Sigma	244252
Соляная кислота (4 M)	Sigma	54435
Гидроксид сои	Sigma	306576
Перекись водорода	Sigma	H1009
Дофамина гидрохлорид	Sigma	H8502
TarHeel HDCV Software	Университет Северной Каролины-Чапел Хилл		Необходимо запросить программное обеспечение: нажмите здесь, чтобы перейти на страницу запроса программного обеспечения