Белок Очистка Техника, что позволяет выявлять и SUMOylation Убиквитинирование бутонизации дрожжей кинетохор белков Ndc10 и Ndc80

Убиквитинирование и сумоилирования позволяют сопряжение убиквитином и Малый Убиквитин-как модификатора (SUMO; Smt3 в S.cerevisiae, ¹⁾ к белку-мишени, соответственно. PTMs из кинетохорных белков влияют на их клеточном уровнях и белок-белковых взаимодействий на различных этапах клеточного цикла, чтобы обеспечить точное сегрегации хромосом. Например, сотовые уровни Cse4 / CENP-A и внешний белка кинетохор Dsn1 регулируются убиквитин-опосредованной протеолиза для обеспечения стабильности генома ^2-5. Дестабилизация неправильных кинетохорных микротрубочек вложений требует B киназы Ipl1 / Aurora, который фосфорилирует Dam1 и Ndc80 комплексы, которые непосредственно взаимодействуют с микротрубочками ^6-8. Несмотря на выявление более семидесяти кинетохорных белков, существует очень мало исследований, которые исследуют изменения этих белков с PTMs, например, убиквитином и сумо. Основным ограничением является способность сохранять PTMс во время очистки и нехваткой таможенных антител для обнаружения PTMs, таких как SUMOylation, фосфорилирования, метилирования, и другие. Характеристика sumoylated кинетохорных белков Ndc10, Cep3, Bir1 и Ndc80 используется пользовательский антитела ^9. Кроме того, Ndc10 был вовлечен в качестве субстрата для убиквитинирования ^10. Человек Hec1 (Ndc80 в S.cerevisiae,) также субстратом для убиквитинирования, регулируется APC / C-hCdh1 E3 лигазы ^11. Таким образом, Ndc10 и Ndc80 являются хорошими кандидатами для оптимизации протокола для выявления как SUMOylation и убиквитинирование в S. Cerevisiae.

Для облегчения идентификации SUMOylation, мы построили штаммов, которые выражают HF-Smt3 и Мус-меченый Ndc10 или Ndc80. Использование эпитопные метки (HF: His6-Flag) сводит к минимуму фон из-за перекрестной реактивности, что часто наблюдается в поликлональной сывороткой, выработанном против белок-кандидат. Мы разработали протокол к близостиочистить ВЧ-Smt3 конъюгатов, а затем использовали коммерческий анти-Flag и анти-Myc антитела для обнаружения присутствия sumolyated Ndc10 и Ndc80 в очищенный препарат Smt3. Для убиквитинирования, мы разработали модифицированный протокол иммунопреципитации, который сохраняет убиквитинирование из Мус-меченых белков кинетохорных и осуществляется вестерн-блот анализ с коммерческой анти-Ub антитела для выявления убиквитинирование Ndc10 и Ndc80.

1. Рост клеток дрожжей

1. Посев клеток дрожжей в 30 мл YPD (таблица 1) в небольшую колбу. Выдержите на 30 ° С в течение ночи при встряхивании.
2. Развести клетки к оптической плотности 0,2 при 600 нм (OD ₆₀₀ = 0,2) в 50 мл YPD и инкубируют при 30 ° C при встряхивании.
3. Выращивают культуру до оптической плотности 1,0 при 600 нм (OD ₆₀₀ = 1,0).
4. Центрифуга клетки в течение 5 мин при 2000 мкг и отбросить супернатант.
5. Ресуспендируют осадок клеток в 40 мл стерильной воды и центрифуги в течение 5 мин при 2000 мкг мыть клетки. Жидкость над осадком сливают и хранят осадок клеток при -20 ° С.

2. Добыча белков

1. Ресуспендируют клеток в 0,5 мл охлажденного льдом буфера гуанидина (таблица 1) для выпадающего анализе с использованием Ni-NTA Superflow шарики или буфер А (таблица 1) для иммунопреципитации. Держите труб на льду во все времена.
2. Трансфер до 2 мл винтовой крышкой трубки.
3. Добавить такой же объем стеклянных шариков (Таблица материалов).
4. Бисера-бить клеток в мини борта колотушки (табл материалов) в течение 2 мин при комнатной температуре, затем поместить на льду в течение 2-3 мин. Повторите это три раза.
5. Вихревой на высокой скорости при 4 ° С в течение 30-60 мин. Проверка клетки от визуализации под микроскопом, чтобы гарантировать, что клетки лизируют.
   Примечание: лизированных клеток будет выглядеть как темные призраки и отсутствие границу или определенную форму. Оптимально, по меньшей мере 80% клеток должны быть лизированы.
6. Прокол отверстие в нижней части трубы с помощью канцелярской кнопки и место в коллекции 15 мл коническую трубку (винтовая крышка должна быть свободной).
7. Центрифуга при 1000 х г в течение 1 мин, чтобы собрать лизата.
8. Передача лизата в микро трубки центрифуги.
9. Центрифуга при 15000 х г в течение 30 мин при 4 ° С для сбора извлеченные белки.
10. Измерить концентрацию извлеченных белков с использованием белка ASSAу комплект (Таблица материалов) и нормализуют все экстракты содержат одинаковое количество белка. Довести общий объем до 1 мл соответствующего буфера.
    Примечание: Около 5 мг общего белка получают из 50 OD ₆₀₀ клеток.
11. Сохранить 50 мкл (250 мкг белка, если общий белок экстрагируют из шаг 2.10 составляет 5 мг) в виде экстракта цельных клеток (WCE). Добавить 50 мкл 2x буфера Лэммли образца (Таблица 1) и инкубируют при 100 ° С в нагревательный блок в течение 3-5 мин. Нагрузка 10 мкл каждого образца в геле SDS-PAGE для вестерн-блот анализа (Раздел 5: Вестерн-блот-анализа).

3. Очистка ВЧ-Smt3 конъюгатов

1. Получите Superflow бусы Ni-NTA (табл материалов), необходимых для экспериментов (100 мкл из бисера на пробу) по низкоскоростным центрифугированием (800-1500 мкг в) в течение 1 мин. Удалить супернатант.
2. Бисер Вымойте 5x 1 мл PBS (табл материалов): Обратить топ-over-Нижняя, пока шарики не ресуспендировали, собирать шарики от низкой скорости центрифугирования и удаления супернатанта.
3. Приостановка бусины в 1 мл буфера гуанидина (Таблица 1) и аликвоту их в количестве труб, соответствующих образцов, подлежащих обработке. Соберите бусы низкоскоростным центрифугированием, и удалить супернатант. Смешайте бисер также путем обращения топ-над нижней.
   Примечание: Смешайте бисер также путем обращения топ-над дном.
4. Для каждого образца, добавить 950 мкл оставшейся WCE (с шага 2.11: экстракция белков) в 100 мкл Ni-NTA Superflow бисера.
5. Инкубировать на платформе-качалке при 4 ° С в течение по меньшей мере 4 ч или в течение ночи.
6. Центрифуга при 800-1500 мкг в течение 1 мин при 4 ° С.
7. Сохранить 50 мкл супернатанта в качестве (SUP). Добавить 50 мкл 2x буфера Лэммли образца и инкубируют при 100 ° С в нагревательный блок в течение 3-5 мин. Нагрузка 10 мкл каждого образца в геле SDS-PAGE для вестерн-блот анализа (раздел 5: Вестерн-блот анальныйлиз).
8. Бусины Промывают один раз 1 мл буфера гуанидина в течение 5-10 мин на качающейся платформе.
9. Бусины Wash 5x 1 мл буфера нарушение (таблица 1) в течение 5-10 мин на качающейся платформе.
10. Ресуспендируют бусины в 90 мкл 2x буфера Лэммли образца.
11. Добавьте 10 мкл 1 М имидазола.
    Примечание: Имидазол помогает отделить Его-меченый белок из бисера Ni-NTA-за конкурирующего взаимодействия между имидазола и бисером.
12. Инкубируют при 100 ° С в нагревательный блок в течение 3-5 мин.
13. Вихрь, затем центрифуги при 13000 мкг в течение 30 сек. Передача супернатант в новую пробирку.
14. Нагрузка 10-20 мкл каждого образца в геле SDS-PAGE для вестерн-блот анализа (Раздел 5: Вестерн-блот-анализа).
    Примечание: 10-20 мкл соответствует 0,5-1,0 мг ввода, если 5 мг ЗЦЕ используется.

4. Иммунопреципитация Мус-меченых белков кинетохор

1. Получить анти-с-Myc агарозном геле сродства апtibody (табл материалов), необходимых для экспериментов (25 мкл смолы на образце) по низкоскоростным центрифугированием (800-1500 XG). Удалить супернатант.
2. Мойка смолы 5x 1 мл буфера А: Инверсия верхнего над дном до смолу повторно суспендируют, собирают смолу низкоскоростным центрифугированием, и удалить супернатант.
3. Приостановка смолы в 1 мл буфера А и аликвоту их в количестве труб, соответствующих образцов, подлежащих обработке. Сбор смолы с низкой скоростью центрифугирования и удаления супернатанта.
   Примечание: Смешайте смолу и обращением топ-над-дно.
4. Добавить 950 мкл оставшейся WCE (с шага 2.11: экстракция белков) в 25 мкл смолы.
5. Инкубировать на платформе-качалке при 4 ° С в течение ночи.
6. Центрифуга при 800-1500 мкг в течение 1 мин при 4 ° С.
7. Сохранить 50 мкл супернатанта в качестве (SUP). Добавить 50 мкл 2x буфера Лэммли образца и инкубируют при 100 ° С в нагревательный блок в течение 3-5 мин. Вотобъявления по 10 мкл каждого образца в геле SDS-PAGE для вестерн-блот анализа (Раздел 5: Вестерн-блот-анализа).
8. Мойка смолы 5x 1 мл буфера А: Инверсия верхнего над дном до смолу повторно суспендируют, собирают смолу низкоскоростным центрифугированием, и удалить супернатант.
9. Ресуспендируют смолы в 100 мкл образца буфера SUMEB (Таблица 1).
   Примечание: образец SUMEB буфер содержит 8 M мочевину и 1% SDS (сильное условие денатурации).
10. Инкубируют при 100 ° С в нагревательный блок в течение 3-5 мин.
11. Вихрь, затем центрифуги при 13000 мкг в течение 30 сек. Передача супернатант в новую пробирку.
12. Нагрузка 10-20 мкл каждого образца в геле SDS-PAGE для вестерн-блот анализа (Раздел 5: Вестерн-блот-анализа).
    Примечание: 10-20 мкл соответствует 0,5-1,0 мг ввода, если 5 мг ЗЦЕ используется.

5. Вестерн-блот анализ

1. Загрузите белковых экстрактов на 4-12% Бис-Трис гели (табл материалов) и перфорацияORM электрофорез при 120 V в течение 90 мин (Запуск буфер: Таблица материалов).
2. Передача белков из геля на нитроцеллюлозную мембрану (табл материалов) с использованием аппарата переноса при 30 В в течение 90 мин (буфер передачи: Таблица материалов).
3. Блок мембраны в 5% молоке / TBST 1x (Table1) в течение 1 ч при комнатной температуре.
4. Инкубируйте мембрану с первичными антителами (таблица материалов) в 5% молоке / TBST 1x в течение ночи при 4 ° C. Для первичных антител, использовать разведение 1: 1000 (анти-Flag и анти-UB антитела) или 1: 5000 (анти-Мус антител).
5. Вымойте мембраны 3 раза в течение 10 мин каждого с 1x TBST.
6. Инкубируйте мембраны с вторичным антителом (таблица материалов) в 5% молока / 1x TBST в течение 1 часа при комнатной температуре. Используйте в разведении 1: 5000 вторичных антител.
7. Вымойте мембраны 3 раза в течение 10 мин каждого с 1x TBST.
8. Выдержите мембраны с ECL WorkiРаствор нг (табл материалов) в течение 5 мин.
9. Expose мембрану к синему чувствительной рентгеновской пленки (табл материалов) и развивать с помощью автоматического разработчика (табл материалов).

Для обнаружения SUMOylation из кинетохор белков Ndc80 и Ndc10, штаммы с ВЧ-Smt3 и Мус-меченых белков кинетохорных (Ndc80 или Ndc10) были построены (таблица 2), как описано ранее 9,12. ВЧ-Smt3 конъюгаты очищали с использованием аффинной бусы Ni-NTA. Вестерн-блот-анализ очищенного HF-Smt3 с анти-Flag антител позволило обнаружения sumoylated форм SUMO субстратов, которые отсутствовали в контрольном штамме без ВЧ-Smt3 (фиг.1А и 1В, левая панель). Как и ожидалось, несколько форм сумо субстратов были обнаружены в штамме ВЧ-Smt3. Затем мы определяли при Ndc80 и Ndc10 присутствуют в очищенной ВЧ-Smt3 конъюгата, делая Вестерн-блоттинга с использованием антитела анти-Myc. Несколько групп, которые были более высокой молекулярной массой, чем у Ndc80 или Ndc10 были четко обнаружить (фиг.1А и 1В, справа). Кроме того, несколько полос как Ndc80 и Ndc10были снижены в клетках, обработанных нокодазолом (рис 1с и 1d). Эти результаты показывают, что очистка белка и вестерн-блот анализ, описанный здесь позволяет обнаруживать SUMOylation из Ndc80 и Ndc10, как описано выше 9.

Для обнаружения убиквитинирование Ndc80 и Ndc10, Мус-меченый Ndc80 или Ndc10 иммунопреципитировали (IP) и Вестерн-блоттинга выполняли с анти-Myc и анти-UB антитела (рис 2). Анализ цельных клеточных экстрактов (WCE) и супернатант (ИСП) подтвердил экспрессию Ndc80-Myc и Ndc10-Myc (2А). Нижние молекулярные полосы вес на ЗЦЕ может представлять продукты распада. Образцы IP испытанные с анти-Myc показала множественные высокие полосы молекулярным весом, предполагая, что Ndc80 и Ndc10 содержать PTMs. Лэддеринг шаблон образцов исследуемых IP анти-Ub антитела показали, что Ndc80 и Ndc10 которые убиквитинируется (2А, α-UB), Лэддеринг модель Ndc80 и Ndc10 были расширены путем обработки ингибитором протеасом MG132 () (рис 2B, α-UB), далее, подтверждающие, что эти полосы представляют поли-ubiqutination. Представительные результаты показывают, что оба Ndc80 и Ndc10 являются субстратами для SUMOylation и убиквитинирования в S. CEREVISIAE и что описанные способы очистки белка можно использовать для обнаружения PTMs таких как SUMOylation и убиквитинирования. По нашей информации, это первый доклад, что Ndc80 в S. CEREVISIAE является субстратом для убиквитинирования, хотя убиквитин опосредованного протеолиза человеческого гомолога Hec1 была ранее опубликована 11.

Рисунок 1: Очистка sumolyated субстратов позволяет идентифицировать белки кинетохор Ndc80 и Ndc10 как SUMO субстратов Pr.oteins были извлечены и ВЧ-Smt3 были получены конъюгаты и анализировали с помощью вестерн-блоттинга после отделения SDS-PAGE. (А и Б) Ndc80 и Ndc10 которые sumoylated. Белки были извлечены из логарифмически растущие клетки в YPD. Левая панель: Всего SUMO субстраты были обнаружены с помощью антитела анти-Flag. Справа: Sumoylated Ndc80 или Ndc10 был обнаружен в конъюгатах ВЧ-Smt3 при зондировании антитела анти-Myc. (С и D), SUMOylation из Ndc80 и Ndc10 уменьшается нокодазол обработанных клеток. Логарифмически растущие клетки в YPD обрабатывали ДМСО (-) или ДМСО + 20 мкг / мл нокодазолом (+) в течение 2 ч при 30 ° С. ВЧ-Smt3 конъюгаты были проанализированы с помощью Вестерн-блот-анализа с использованием анти-Myc антитела. Изогенных штаммов дрожжей, используемых в (А и С) YPH1800 (Ndc80-Мус), YMB7862 (His-Flag-SMT3 Ndc80-Мус) и (Б и Г) YPH1734 (Ndc10-Мус), YMB7867 (His-FlAG-SMT3 Ndc10-Мус).

Рисунок 2:. Убиквитинирование из кинетохор белков Ndc80 и Ndc10 Добыча белка и иммунопреципитации проводили, как описано в протоколе. () Ndc80 и Ndc10 которые убиквитинируется. Белки были извлечены из логарифмически растущие клетки в YPD. Экстракт Цельноклеточные (WCE), супернатант (SUP), и иммунопреципитации (IP) фракции подвергали SDS-PAGE. Вестернблоты были использованы для выявления Myc-метками и убиквитинированного белки с анти-Myc и анти-Ub антител, соответственно. (Б) убиквитинирование Ndc80 и Ndc10 усиливается в клетках, обработанных ингибитором протеасомы MG132. Логарифмически растущие клетки в YPD обрабатывали ДМСО (-) или ДМСО + 50 мкМ MG132 (+) в присутствии 0,003% ДСН в течение 3 часов при 30 ° С, как описано ранее 13

Таблица 1: Решения.

Таблица 2: Штаммы дрожжей, используемые в данном исследовании.

Авторам нечего раскрывать.