Методическая статья

Генерация жировой стволовых клеток через дедифференцировка зрелые адипоциты в потолочных культур

11.6K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/52485

⸱

7 марта 2015 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1IUCPQ Research Center, 2CHU de Québec Research Center, 3Laval University

В этой статье

Краткое содержание

Зрелые адипоциты могут представлять собой обильный источник стволовых клеток за счет дедифференцировки, что приводит к однородной популяции фибробластоподобных клеток. Расщепление коллагеназы используется для выделения зрелых адипоцитов из жира человека. Целью нашего протокола является получение мультипотентных, дедифференцированных жировых клеток из зрелых адипоцитов человека.

Аннотация

Зрелые адипоциты показали способность превращать свой фенотип в фибробластоподобные клетки in vitro с помощью метода, называемого потолочной культурой. Зрелые адипоциты также могут быть выделены из свежей жировой ткани для депо-специфической характеристики их функции и метаболических свойств. В этой статье мы описываем хорошо зарекомендовавший себя протокол выделения зрелых адипоцитов из жировых тканей с помощью расщепления коллагеназы и последующие шаги по проведению потолочных культур. Вкратце, жировые ткани инкубируются в буфере Кребса-Рингера-Хенселеита, содержащем коллагеназу, для разрушения тканевого матрикса. Плавающие зрелые адипоциты собираются на верхней поверхности буфера. Зрелые клетки помещают в колбу Т25, полностью заполненную средой, и инкубируют вверх ногами в течение недели. Альтернативный подход к культивированию с помощью 6-луночных планшетов позволяет охарактеризовать адипоциты, подвергающиеся дедифференцировке. Морфология адипоцитов резко меняется со временем культивирования. Иммунофлюоресценцию можно легко проводить на предметных стеклах, культивируемых в 6-луночных планшетах, как показано на примере иммунофлуоресцентного окрашивания FABP4. Белок FABP4 присутствует в зрелых адипоцитах, но подавляется за счет дедифференцировки жировых клеток. Дедифференцировка зрелых адипоцитов может представлять собой новое направление для клеточной терапии и тканевой инженерии.

Введение

Дедифференцировка зрелых адипоцитов in vitro достигается с помощью метода, называемого культурой потолка1. Из-за своей естественной склонности плавать в водных растворах отдельные зрелые адипоциты прилипают к поверхности перевернутой колбы, полностью заполненной питательной средой. В течение нескольких дней клетки изменяют свою сферическую морфологию и становятся фибробластоподобными клетками. Полученные клетки, называемые дедифференцированными жировыми клетками (DFAT), являются мультипотентными2. Научные статьи по дедифференцировке адипоцитов, особенно на клетках человека, ограничены. Тем не менее, они уже предоставили интересную информацию о мультипотенции, клеточном фенотипе и репликативной способности клеток DFAT2. Зрелые адипоциты, происходящие из различных жировых компартментов, были успешно дедифференцированы, в том числе происходящие из висцеральных и подкожных жировых тканей человека2-4. В дополнение к этим депо, Кишимото и его коллеги взяли образцы жировой ткани из буккальных жировых пакетов и дедифференцированные адипоциты в клетки DFAT. Мацумото и его коллеги успешно получили подкожные клетки DFAT от пациентов в широком диапазоне возрастов, и большинство клеток имели высокую скорость пролиферации и менее 6% старения даже после 10 пассажей в культуре2.

Клетки

DFAT были успешно редифференцированы в несколько линий, включая адипогенные, остеогенные, хондрогенные и нейрогенные линии2,3,6. Эти клетки экспрессируют несколько маркеров эмбриональных стволовых клеток, таких как Nanog и четыре идентифицированных плюрипотентных фактора: Oct4, c-myc, Klf4 и Sox23. Они также экспрессируют маркеры, специфичные для каждого из трех слоев зародыша7. Кроме того, клетки DFAT похожи на мезенхимальные стволовые клетки, полученные из костного мозга (МСК), на основе их эпигенетической сигнатуры3. Используя возможности стволовых клеток DFAT, многие группы исследовали их потенциал для лечения или улучшения состояния различных заболеваний8,9. Улучшение патологических состояний, таких как повреждение сердечной ткани, повреждение спинного мозга и дисфункция сфинктера уретры, наблюдалось при инъекциях клеток DFAT на крысовых моделях заболевания10-12.

В дополнение к свойствам стволовых клеток DFAT, они могут представлять собой новую клеточную модель для исследований физиологии адипоцитов. Для этой цели часто используется клеточная линия 3T3-L1, поскольку эти клетки дифференцируются в адгезивные, сохраняющие липиды адипоциты под действием адипогенной стимуляции. Однако эти клетки происходят из ткани эмбриона мыши13. Кроме того, специфичность депо не может быть исследована с помощью этой модели, и она может не полностью отражать физиологию адипоцитов человека14. Другие лаборатории работают с выделенными жировыми клетками из мышиных жировых депо, но распределение жира у мышей не является диморфным, а анатомическая конфигурация брюшной полости грызуна не позволяет экстраполировать их непосредственно на человека. Для изучения адипоцитов в контексте физиопатологии ожирения человека учет распределения жира в организме и различий, специфичных для жировых депо, стал необходимым16. Некоторые ограничения первичных преадипоцитарных культур, включая количество клеток, полученных из образцов биопсии жировой ткани, и их старение после нескольких пассажей в культуре, создали потребность в альтернативных моделях. Перрини и его коллеги исследовали специфичность гена в экспрессии клеток DFAT, происходящих из висцерального и подкожного жира, и сравнили их со стволовыми клетками жировой ткани (ASC) из того же жирового депо. Они продемонстрировали, что различия в экспрессии и функции генов в основном обнаруживаются между депо, чем между типами клеток, что позволяет предположить, что клетки DFAT физиологически близки к ASC из одного и того же депо. Клетки DFAT могут представлять собой интересную альтернативу существующим моделям для исследований распределения жира в патофизиологии ожирения человека. Кроме того, потолочная культура является перспективным методом получения взрослых стволовых клеток для целей тканевой инженерии.

Здесь мы описываем расщепление коллагеназы, широко используемый метод выделения зрелых адипоцитов из образцов подкожного и/или висцерального жира17, и последующие шаги по выполнению потолочного культивирования и дедифференцировке этих клеток в мультипотентные, фибробластоподобные клетки.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Заявление по этике: проект был одобрен Комитетом по этике научно-исследовательского IUCPQ заключения до набора пациентов. Для целей настоящей статьи / видео, мы получили ткани от 2 пациентов: 1) 62-летний пациент с ИМТ 50,7 кг / м 2 и 2) 35-летняя женщина пациента с ИМТ 57 кг / м 2. Эксперименты может быть сделано с обеих жира отсеков, но были ограничены одной жира отсека для целей этого видео. Технические аспекты видео были выполнены с пациентом 1 и FABP4 иммунофлюоресценции была выполнена с дедифференцированных клеток от пациента 2.

1. Пример обработки

  1. Задать хирургов, чтобы собрать жировой ткани из сальника и подкожной клетчатки отсеков во время лапароскопической хирургии ожирения.
  2. Быстро довести образцы жировой в лабораторию при комнатной температуре и обрабатывают немедленно.
  3. Выполните пищеварение в лаборатории, в нестерильной обстановке.Клетки, в конечном счете быть переведен в культуральной комнате и культивировали в стерильных условиях. Чтобы избежать загрязнения, подготовить KRH буфер дистиллированной и отфильтрованной воды, а затем в фильтрации (0,22 мкм фильтр) до пищеварения. Тщательно чистые пробирки с этанолом предварительного передачи в капот культуре клеток на колбу и подготовки пластины.
  4. Поместите жировой ткани на предварительно взвешенный блюдо и записи веса. Fix небольшой кусочек каждого образца ткани (менее 1 см 2) в 10% буфера формалина при комнатной температуре в течение по крайней мере 24 часа до парафин. Используйте этот встроенный образец для иммуногистохимии экспериментов (техника не показано).
  5. Поместите другую часть в 50-мл пробирку и флэш-замораживание в жидком азоте перед хранением при -80 ° С для дальнейших исследований на всю жировой ткани (например, экспрессии генов - метод не показан).

2. Коллагеназа Пищеварение

  1. Поместите оставшиеся жировой ткани кусок в 50 мл Тубыть для пищеварения.
  2. Добавить 4 мл KRH-WB с добавкой коллагеназы (350 ЕД / мл) на грамм образца в пробирку пищеварения.
  3. Фарш жировой ткани с помощью ножниц.
  4. Поместите фарш жировой ткани подвеску в шейкере, 37 ° C, 90 оборотов в минуту максимум, для 45-минутной инкубации (максимум 1 час).

3. Очистка адипоцитов и преадипоциты

  1. Вылейте полупрозрачный решение с несколько кусков жира через 400 мкм нейлоновой сеткой в ​​пластиковом стакане.
  2. С помощью пинцета, руб клеточный препарат на нейлоновую сетку и промыть 5 мл KRH-WB.
  3. Тонко передачи отфильтрованного клеточной суспензии в 50 мл пробирку с пластиковой трубки в ней, и 60 мл шприц прикрепленной на конце трубы.
  4. Пусть подвеска с зрелые адипоциты стоять в течение примерно 10 мин, позволяя клеткам, чтобы достичь вершины буфера путем размещения.
  5. Медленно аспирата буфер в нижней части трубки с помощью 60 мл СиринGE всасывания.
  6. Добавить 20 мл KRH-WB мыть. Повторите процедуру с шага 3.4 2 дополнительных промывок.
  7. Собирают буфер довести адипоцитов суспензии до конечного объема 5 или 10 мл, в зависимости от количества клеток. Проводить с шагом в разделе 5.
  8. Восстановление стромальных-сосудистой фракции из буфера собранных с 60 мл шприцом центрифугированием (3000 оборотов в минуту, РТ, 5 мин) для дальнейшего первичной культуры клеток при желании (метод не показан).

4. Зрелые Adipocyte сотовый Граф

  1. Добавить 10 мкл осторожно встряхивают адипоцитов, взвешенная в счетной камере (гемоцитометре). Выполните подсчет клеток в четырех.
  2. Рассчитать количество изолированных зрелых клеток.

5. Зрелые Adipocyte дедифференцировки в Т-25 колбу

  1. Заполните 25 см 2 культуре ткани колбу ¾ объема с DMEM / F12-20% телячьей сыворотки.
  2. По количеству клеток, залить 500 000 зрелых клеток в колбе.
  3. Заполните флягу полностью с помощью 50 мл трубку со средой и удалить как много пузырьков, как это возможно.
  4. Винт в закрытой крышки на колбу.
  5. Очистите колбу с этанолом до инкубации, чтобы избежать загрязнения.
  6. Выдержите колбу с ног на голову в течение недели, не касаясь его, чтобы избежать движения в культуре, которые могут нарушить клеточный приверженность.
  7. До вспять колбу 7 дней перевернутой культуры, мягко манипулировать колбу и удалить все среды в колбе путем аспирации, избегая резких движений.
  8. Добавить 12 мл DMEM,-F12-20% сыворотки теленка, и культивируют клетки с помощью стандартных методов. Фильтруют, вентилируемые колпачок может быть добавлен в колбу.

6. Зрелые Adipocyte дедифференцировки в 6-луночного планшета

  1. Поместите покровное на дно каждой лунки 6-луночного планшета с
  2. Добавить ½ "пластмассовую втулку на верхней части каждой покровное.
  3. Заполните скважин с 8 мл 20% телячьей сыворотки DMEM-среде.
  4. Положите покровное на каждом пластмассовую втулку.
  5. Вставка пипетки наконечник между стеклом и трубки для введения клеток в слайде (50000 клеток на лунку).
  6. Планшеты инкубируют в стандартном инкубаторе для клеточных культур при 37 ° С с 5% СО 2 в течение недели.
  7. Обратный покровное с прикрепленными клеток в каждую лунку, содержащую 2 мл среды с добавкой 20% телячьей сыворотки и проводить культуры.
  8. Использование покровное с клетки подвергаются дедифференцировку для нескольких целей, включая иммунофлюоресценции (метод не показан).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Основные морфологические изменения происходят в зрелые адипоциты в течение дедифференцировки (рисунок 1). Как показано на фиг.2, клетки, проходящие дедифференцировку окрашивали анти-антитела FABP4 для флуоресцентного анализа. Клетки с круглым морфологии выразил белка FABP4 в то время как большинство фибробластоподобных клеток не сделал. После дедифференцировки, DFAT клетки могут быть выращены с помощью стандартных процедур нескольких местах. Мы смогли достичь более 15 проходов для челов...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Дедифференцировка зрелых адипоцитов с техникой потолок культуры является новый подход для получения жировой стволовых клеток из небольшого образца родной жировой ткани. Основываясь на нашем опыте и опыте других 2, один грамм ткани достаточно пластине 25-см 2 колбу и получить население DFAT ячеек, для которых однородность была подтверждена результатами Полони и сотрудников 3. Adipocyte дедифференцировка представляется возможным с клетками из любой донор, независимо от их возраста, пола и ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Благодарности

Это исследование было поддержано грантом Совета по естественным наукам и инженерным исследованиям Канады (371697-2011, AT). Авторы выражают признательность за помощь бариатрическим хирургам докторам С. Бирону, F-S. Хоулд, С. Лебель, О. Лесселлер,. Марсо, а также Кристин Расин и Каролин Ганьон из Банка тканей IUCPQ. Благодарим господина Жака Кадоретта из аудиовизуальной службы МССПК за видеосъемку и монтаж

.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Бычий сывороточный альбуминSigmaA7906
АденозинSigmaA4036
Аскорбиновая кислотаSigmaA0278
NaClМожно использовать любую
марку KClМожно использовать любую марку
CaCl2Можно использовать
любую маркуMgCl2Любая марка может быть использована
KH2PO4Любая марка может быть использована
HEPESЛюбая марка может быть использована
ГлюкозаЛюбая марка может быть
использована коллагеназа I типаWorthington Biochemical CorpLS-004196
DMEM/F-12, HEPES, без фенола красныйGibco-Life Technologies11039-021Добавить в среду: 20% сыворотки для телят, гентамицин (50 &; г/мл) и фунгизоном (2,5 & микро; г/мл)
Сыворотка для телят, с добавлением железа, от телят на искусственном вскармливанииSigmaC8056-500 мл
1/2 В пластиковой втулкеIberville2704-CPАртикул:1000120918 (Home Depot)
Жидкий азот
, нейтральный буферный, 10%SIGMAHT501128
Стерильный пинцет
Стерильные
60 мл шприцыBD Шприц
Пластиковая трубка
Krebs-Ringer-Henseleit стоковый буфер (KRH)Приготовьте стоковый буфер следующим образом: 25 мМ HEPES pH 7,6, 125 мМ NaCl, 3,73 мМ KCl, 5 мМ CaCl2.2H2O, 2,5 мМ MgCl2.6H2O, 1 мМ K2HPO4. Отрегулируйте pH до 7,4.
Krebs-Ringer-Henseleit-Working Buffer (KRH-WB)Добавьте в буфер KRH следующие компоненты: 4% бычьего сывороточного альбумина, 5 мМ глюкозы, 0,1 и микро; M аденозин, 560 &; M аскорбиновая кислота
KRH-WB с добавлением коллагеназыДобавьте 350 Ед/мл коллагеназы I типа
T25 невентилируемый колпачок для культуры тканейSarsted или другой марки
Защитное стекло микроскопа 22x22Fisherbrand12-542-B
Стерильные стаканы
Раствор формалина Lindeножницы I типа 6-луночный планшет для культуры тканей BD Falcon или другой марки

Ссылки

  1. Zhang, H. H., Kumar, S., Barnett, A. H., Eggo, M. C. Ceiling culture of mature human adipocytes: use in studies of adipocyte functions. J Endocrinol. 164 (2), 119-128 (2000).
  2. Matsumoto, T., et al. Mature adipocyte-derived dedifferentiated fat cells exhibit multilineage potential. J Cell Physiol. 215 (1), 210-222 (2008).
  3. Poloni, A., et al. Human dedifferentiated adipocytes show similar properties to bone marrow-derived mesenchymal stem cells. Stem Cells. 30 (5), 965-974 (2012).
  4. Perrini, S., et al. Differences in gene expression and cytokine release profiles highlight the heterogeneity of distinct subsets of adipose tissue-derived stem cells in the subcutaneous and visceral adipose tissue in humans. PLoS One. 8 (3), e57892(2013).
  5. Kishimoto, N., et al. The osteoblastic differentiation ability of human dedifferentiated fat cells is higher than that of adipose stem cells from the buccal fat pad. Clin Oral Investig. , (2013).
  6. Kou, L., et al. The phenotype and tissue-specific nature of multipotent cells derived from human mature adipocytes. Biochem Biophys Res Commun. 444 (4), 543-548 (2014).
  7. Jumabay, M., et al. Pluripotent stem cells derived from mouse and human white mature adipocytes. Stem Cells Transl Med. 3 (2), 161-171 (2014).
  8. Sugawara, A., Sato, S. Application of dedifferentiated fat cells for periodontal tissue regeneration. Hum Cell. 27 (1), 12-21 (2014).
  9. Kikuta, S., et al. Osteogenic effects of dedifferentiated fat cell transplantation in rabbit models of bone defect and ovariectomy-induced osteoporosis. Tissue Eng Part A. 19 (15-16), 1792-1802 (2013).
  10. Obinata, D., et al. Transplantation of mature adipocyte-derived dedifferentiated fat (DFAT) cells improves urethral sphincter contractility in a rat model. Int J Urol. 18 (12), 827-834 (2011).
  11. Jumabay, M., et al. Dedifferentiated fat cells convert to cardiomyocyte phenotype and repair infarcted cardiac tissue in rats. J Mol Cell Cardiol. 47 (5), 565-575 (2009).
  12. Ohta, Y., et al. Mature adipocyte-derived cells, dedifferentiated fat cells (DFAT), promoted functional recovery from spinal cord injury-induced motor dysfunction in rats. Cell Transplant. 17 (8), 877-886 (2008).
  13. Moreno-Navarrete, J. M. F. -r Ch. 2. Adipose Tissue Biology. Symonds, M. E. , Springer. 17-38 (2012).
  14. Poulos, S. P., Dodson, M. V., Hausman, G. J. Cell line models for differentiation: preadipocytes and adipocytes. Exp Biol Med (Maywood. 235 (10), 1185-1193 (2010).
  15. Casteilla, L., Penicaud, L., Cousin, B., Calise, D. Choosing an adipose tissue depot for sampling: factors in selection and depot specificity). Methods Mol Biol. 456, 23-38 (2008).
  16. Tchernof, A., Despres, J. P. Pathophysiology of human visceral obesity: an update. Physiol Rev. 93 (1), 359-404 (2013).
  17. Rodbell, M. Metabolism of Isolated Fat Cells. I. Effects of Hormones on Glucose Metabolism and Lipolysis. J Biol Chem. 239, 375-380 (1964).
  18. Watson, J. E., et al. Comparison of Markers and Functional Attributes of Human Adipose-Derived Stem Cells and Dedifferentiated Adipocyte Cells from Subcutaneous Fat of an Obese Diabetic Donor. Adv Wound Care. 3 (3), 219-228 (2014).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

FABP4

Похожие статьи