Методическая статья

Рыбок данио кератоцитов Экспланты по изучению коллективной миграции клеток и реэпителизации кожного заживления ран

DOI:

10.3791/52489

⸱

25 февраля 2015 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Biomedical Sciences Program, Midwestern University, 2Department of Microbiology & Immunology, Midwestern University

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Рыбок данио кератоциты мигрировать в клеточных листов из эксплантов и обеспечить модель в пробирке для изучения механизмов коллективного миграции клеток в контексте эпителия заживления ран. Эти протоколы деталь эффективный способ создать первичные культуры эксплантов для использования в коллективных анализов клеточной миграции.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Благодаря своим уникальным подвижных свойств, рыба кератоциты в отрыве от эксплантов культуры уже давно используются для изучения механизмов миграции одной клетки. Однако, когда экспланты установлено, эти клетки также перемещаются вместе, сохраняя многие черты, которые делают индивидуальный кератоциты привлекательную модель для изучения миграции: быстрые темпы моторики, обширные актин-богатых ламеллы с перпендикулярной актина кабеля, а также сравнительно постоянной скоростью и Направление миграции. В начале эксплантов, быстрое взаимное превращение клеток, мигрирующих в индивидуальном порядке с тех, кто мигрирует вместе позволяет изучение роли межклеточных спаек в определении режима миграции, и подчеркивает, молекулярные связи между этими двумя режимами миграции. Клетки в более поздних эксплантов теряют способность быстро и коллективно мигрировать в эпителиальных чтобы мезенхимального перехода происходит, и гены, связанные с заживлением ран и воспаления дифференциально экспрессируются, Таким образом, кератоцитов эксплантаты могут служить в качестве модели в пробирке для реэпителизации, что происходит во время заживления ран кожи и может представлять собой уникальную систему для изучения механизмов коллективного миграции клеток в контексте определенной программы изменения экспрессии генов. Разнообразие мутантных и трансгенных линий данио имеются, которая позволяет эксплантов, который будет создан из рыбы с различными генетическими фонов. Это позволяет роль различных белков в этих процессах, чтобы быть однозначно решить. Протоколы, описанные здесь, описывают простой и эффективный способ создания этих эксплантов культур для использования в различных анализах, связанных с коллективной миграции клеток.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Исследования клеточной подвижности традиционно сосредоточено на индивидуальном мигрирующих клеток. Кератоциты культивированный из рыбы и амфибии эксплантов оказались мощным модельной системой для изучения механизмов клеточной подвижности с помощью как экспериментальных, так и математическое моделирование подходов 1-6. Экспериментальная работа по отдельности, мигрирующих клеток автоматизированного быстрым, плавным движением скользящей клеток, сохраняя одинаковую форму, скорость и направление. Тем не менее, в живом организме, клетки часто двигаться вместе при поддержании межклеточных соединений, в частности, в процессе эмбриогенеза, заживления ран, и метастазирования. Таким образом, коллектив миграция клеток является растущей и все более важной областью исследований в рамках области миграции клеток. Коллектив миграция этих клеток недавно были описаны 7 и она имеет много уникальных особенностей, которые делают его мощная система для изучения коллективного миграцию клеток в модели заживления раны.

ove_content "> Когда весы сорвал с наркозом взрослых данио, некоторые эпителиальной ткани остается привязанным к нижней части шкалы. Когда среда для культивирования клеток добавляется, эти эпителиальные клетки, или кератиноциты, быстро мигрируют в качестве коллективного устройства от масштаба. Эксплант можно рассматривать как эпителиального заживления ран модели, в которой клетки мигрируют от эксплантов, как они будут по предварительной матрицы раневое ложе, чтобы восстановить интактный эпителий. Последние данные показывают, что этот экс виво культуры имитирует многие особенности в естественных условиях заживление ран у взрослых рыбок данио. Рана скоростью сближения 8 перевести на скорость миграции аналогичной той, что наблюдается в Экс Vivo системы 7. Кроме того, в раны в естественных условиях модели заживления, лечение варфарином позволяет предположить, что гемостаз не влияет на скорость исцеления, в то время как обработка гидрокортизоном для уменьшения иммунный ответ не задерживает реэпителизацию 8 . Как данио не кровоточат, когда шкала удаляется из животного, гемостаз не является основным игроком. Хотя мы нашли иммунные клетки в эксплантов, мы не изучали влияние они могут оказать на коллективной миграции клеток.

Протокол, представленные здесь описывает, как установить данио культуры кератоцитов эксплантов, обеспечивающие согласованность и воспроизводимость для использования во многих биологических анализов. Эти эксплантов культуры являются особенно очевидной в пробирке модель для коллективного миграции клеток по нескольким причинам. Во-первых, данио кератоциты являются первичные клетки, используемые в течение нескольких часов создания эксплантов культур. Таким образом, эти клетки не претерпели морфологические и генетические изменения выражение, связанное с прохождением первичных клеток 9-13. Во-вторых, эта система представляет собой модель для изучения реэпителизации в ответ на ранение 14, а в рамках ответа на ранения, эпителиальной к мезенхимальных TRansition (EMT) процесс инициируется о чем свидетельствуют изменения в экспрессии генов и цитоскелета перестроек 14,15. Таким образом, фоновые изменения в экспрессии генов и подвижности, которые происходят в необработанных клеток были охарактеризованы и обеспечивают контекст для интерпретации изменения с лечения. Кроме того, рыба кератоцитов и кератиноцитов человека функционально эквивалентны; оба первичные эпителиальные клетки соответствующих видов и играют ключевую роль в заживлении ран эпителия. В-третьих, взрослых данио приобретают все большее признание в качестве модельной системы для различных заболеваний человека 16-18 в том числе меланомы и других раковых заболеваний 19-21, кожные заживления ран 8,14 и регенерации тканей 22-24.

Технические преимущества этой модельной системы одинаково убедительными. Все большее число мутантных и трансгенных линий доступны из некоммерческих, централизованных. В частности, мутации проекта данио рерио (ZMP) В Wellcome Trust Sanger Institute направлена ​​на создание нокаутом аллель в каждом кодирующей белок гена в данио генома. В настоящее время они мутировали 11892 генов, примерно 45% генома, с 24088 аллелей отличающийся. Кроме того, ZMP принимает предложения и будет генерировать нокауты бесплатно. Последние методы генной нокдаун в личиночной и взрослых данио 25-28 обеспечивают гибкость для изучения функции с развитием важных генов, для которых трансгенные подходы проблематично или нецелесообразно.

Из-за их чрезвычайно быстрыми темпами моторики ~ 145 мкм / ч вскоре после создания культур 29, анализы могут быть быстро завершена (как правило, в 24 ч или менее). Как эксперименты могут быть быстро завершена, и культуры хорошо растут при комнатной температуре, несколько технических препятствий, связанных с миграцией клеток млекопитающих, включающие анализы видеомикроскопия избежать. Кроме того, в эпоху ужесточения исследовательские бюджеты, zebrafМОГ легко и недорого поддерживать.

Структура и поведение эксплантов является сложным. Как рыба не кровоточат, когда шкала удаляется, то маловероятно, что намного больше, чем поверхностные слои эпидермиса удаляются с масштабом. Кератиноциты, по всей видимости, является преобладающим типом клеток в эксплантов, когда весы, первоначально удалены из рыбы, подавляющее большинство клеток, по всей видимости пятно с анти-Е-кадгерина антителом 14. Кроме того, нет никаких доказательств того, фибробластов в первичной культуры можно судить по отсутствию окраски виментина с помощью иммунофлуоресценции 14. Тем не менее, с удалением повторном масштаба, как представляется, быть многочисленные нейтрофилы в эксплантата (смотрите видео 1). Мы определили, как эти клетки нейтрофилов на основе морфологических наблюдений от их размера, быстро подвижности, а также их миграции из клетки листа при воздействии на LPS (данные не показаны). Кроме того, эти клетки окрашиваются ярко остроумиеч антитело к нейтрофилов цитозольного фактора, а также с различными вторичными антителами IgG, что указывает, что они имеют обильные FcRs на своей поверхности (данные не показаны). Несколько слоев клеток присутствуют в эксплантов. Конфокальной микроскопии обнаруживается присутствие одного слоя вблизи переднего края до более чем двух слоев кератоцитов возле шкалы с нейтрофилов видимых сверху, снизу, и между клеткой кератоцитов листов.

В начале временных точках, клетки на краю многослойной эксплантов поляризации, инициирующего коллективного миграции кератоцитов из эксплантов на начальных скоростей ~ 145 мкм / ч. Площадь, покрытая эксплантата быстро возрастает, что приводит к ячейке распространения, напряжение в пределах листа, а пониженная скорость продвижения передней кромки. Быстрые взаимные между лидером и последователем клеток наблюдаются на переднем крае в процессе формирования и закрытия спонтанно образующихся отверстий в листе 7. КакEMT процесс, начатый с эксплантата продолжает лист фрагменты и кератиноциты теряют специализированные, быстрый моторику. Экспрессия генов и морфологические изменения, согласующиеся с EMT, заживление ран и воспалительные реакции происходят в течение 7 дней культуры с экспланты рассматривается жизнеспособность в течение примерно 10 дней 14.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол соответствует AVMA защиты животных принципов по уходу и использованию лабораторных животных и был одобрен уходу и использованию комитета за животными (IACUC) на Среднем Западе университета им.

1. Подготовка анестезии, оборудования, и средств массовой информации

  1. Дехлорирование примерно 1,5 л водопроводной воды с использованием либо коммерческий дехлорирующей агента (продается в зоомагазинах) или давая воды позицию в течение 24 часов. Получить три 1 L стаканы и наполнить каждый с 500 мл дехлорированию воды. Пометьте одну для проведения рыбу перед любой процедурой и один для восстановления. К третьему химический стакан, добавить 100 мкг / мл Tricaine метансульфонат; это становится стакан, в котором будет анестезировали рыбы.
  2. Заполните мелкий лоток со льдом, нагревают культуральную среду (RPMI 1640, 10% FBS (эмбриональной бычьей сыворотки), 50 мкг / мл гентамицина, 100 мкг / мл канамицина, 25 мМ HEPES) до комнатной температуры, и собирают пинцетом чистой ювелира. Чистые пинцет по Имерупеть советы в 70% -ном этаноле и пройти через горелки Бунзена, позволяя этанол, чтобы сжечь.
  3. Решите, если процедура будет выполнена без увеличения с коммерческой, настольного зажгли увеличительное стекло с 2 - 10-кратным увеличением, или рассекает микроскопом (целиком зависит от личных предпочтений).

2. Установите эксплантов культур

  1. Поймать необходимое количество рыбы и места в режиме ожидания стакан. Передача одной рыбы к анестезии стакане; лучше обезболить рыбу индивидуально.
  2. Мониторинга воздействия анестезии, наблюдая бассейн и жаберные движения рыб. По ходу наркоза, движение жаберных замедляется и рыба будет плавать хаотично и часто с ног на голову; рассмотреть рыбу наркозом, как только движение жаберных прекращается. Не оставляйте рыбу в течение длительных периодов в анестезии ванной, так как это может привести к смерти рыбы.
  3. Удалить рыбу из анестезии стакане и передачилед, помещая рыбу горизонтально с хвостом, обращенной к рука пинцет. Если опыт работы с техникой и, если несколько рыб, которые будут использоваться, чтобы сделать эксплантов, рассмотреть вопрос о размещении очередную рыбу в анестезии стакане в это время.
  4. Для удаления чешуек, положение пинцет параллельно с рыбой, с кончиком, у края шкалы. Нажмите плоскую сторону пинцетом слегка в стороне рыбы, чтобы вызвать масштаб, чтобы поднять из тела рыбы. Возьмитесь масштаб с помощью пинцета, смелости и место (без инверсии) в культуре ткани блюдо. Повторите процедуру, удаляя максимум 12 шкал от большого взрослого (6 с каждой стороны), избегая жаберные область, боковой линии, и плавники.
  5. Поместите рыбу в аварийный стакан и контролировать, чтобы гарантировать ее оправится от последствий анестезии. В это время, рыба может быть передано обратно в отдельного резервуара. Разрешить рыбы восстановиться в течение по крайней мере 21 дней, чтобы для полной регенерации шкалы.
  6. В зависимости отопытно-конструкторских, разместить до 20 шкал в пластиковой 35 мм культуры тканей, обработанных блюдо или 4 - 6 шкал на дно стакана блюдо. Разрешить весы придерживаться блюдо, прежде чем осторожно добавляя СМИ, чтобы не отделить шелуху с тарелки.
    Примечание: С опытом, несколько рыб могут быть обработаны до носитель добавляют к первой тарелки.
  7. Добавить 1,2 мл полной среды (см 1,2 выше) в каждом 35 мм блюдо.
  8. Предпочтительно инкубировать эксплантов культур при 28 ° С в 5% СО 2 в течение требуемого периода времени с или без дополнительной обработки. Кроме того, инкубировать культур на нагретом столике микроскопа или в живой культуры клеток камеру для видео микроскопии.

3. Светлое и видео микроскопия

  1. Позиция блюда, содержащие клеточные листы на столике микроскопа и первоначально фокус с помощью объектива 4X.
    ПРИМЕЧАНИЕ: увеличениями могут быть использованы, в зависимости от эксперимента. Маркировка расположениекаждый лист и / или ориентации тарелки на стадии клеток будет способствовать принимать изображения с течением времени с листами примерно в той же ориентации.
  2. Удалить блюда из инкубатора и фотографии в различные моменты времени, в зависимости от каждого экспериментального протокола и поместить обратно в инкубатор, если только для неподвижных изображений необходимы более экспериментальной времени.
  3. При выполнении видеомикроскопия, обратите внимание на следующее:
    1. Поместите масштаб / возникающих клеток листа в пределах поля зрения так, что мигрирующие клетки листа остается в поле зрения в течение всего срока видео.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это может занять некоторый опыт в наблюдении, как клетки мигрируют из-под масштабе. Для коротких видео, это меньше беспокойства, чем для более видео.
    2. Для более коротких временных рамок, инкубировать при комнатной температуре. Для более длительных периодах времени (18+ час), использовать с подогревом этап или инкубационной камере для поддержания температуры, рН-баланс, и свести к минимуму испарение культуры мedium.

4. Фиксация для ИММУНОФЛУОРЕСЦЕНТНОГО микроскопии

  1. Подготовка и предварительно прогреть все решения до 28 ° C. Для того, чтобы просмотреть кератоциты под флуоресценции, расти эксплантов культур, как описано выше, с использованием прозрачным дном 35 мм культуры тканей блюда. Кроме того, использование стеклянной камеры слайды.
  2. Добавить 0,8 мл 4% параформальдегида в 1.1x PBS в каждую чашку. Не снимайте питательных сред в первую очередь. Выдержите при комнатной температуре в течение 5 минут, затем аспирации для удаления раствора.
  3. Добавить 0,8 мл 4% параформальдегида в 1.1x PBS в каждую чашку. Выдержите при комнатной температуре в течение 5 минут, затем аспирации для удаления раствора.
  4. Если не использовать внешние лиганды или внешних эпитопы, проницаемыми клеток путем добавления 0,5 мл 0,2% Тритон Х-100 в 1X PBS. Выдержите при комнатной температуре в течение 5 минут, затем аспирации для удаления раствора.
  5. Добавить 0,5 мл 1% BSA в 1x PBS и инкубировали в течение 1 часа (при комнатной температуре) или O / N (при 4 ° С).
    Примечание: В зависимости от условий эксперимента, PHAlloidin могут быть добавлены на этом этапе.
  6. После инкубации аспирации для удаления раствора и приступить к окрашиванию антителом. С другой стороны, хранить чашки для культивирования при добавлении по меньшей мере, один - 2 мл 1% BSA в PBS 1x в течение 3 - 4 недель при 4 ° С.

5. Иммунофлуоресценции протокол

  1. Готовят растворы первичных и вторичных антител в соответствии с рекомендациями завода-изготовителя.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если рекомендации производителя не доступен, хорошая отправная разбавления первичных антител (в 1% BSA в 1X PBS) составляет 1: 500 для поликлональных и 1: 1000 для моноклональных антител; Хорошей отправной разбавления вторичных антител 1: 1000. Настройте эти разведения исходного материала, полученного от производителя выше, если сигнал слабый, ниже, если сигнал сильный и фон проблема.
  2. Аспирируйте 1% BSA в 1X PBS растворе. Добавить 0,5 мл раствора первичного антитела и инкубировать в течение 1 часа (при комнатной температуре) или O / N (при 4 ° С).
  3. Удалить раствор первичного антитела, поместить в чистый и помечены 1,5 мл микроцентрифужных трубку, и заморозить при температуре -20 ° С.
    Примечание: Это позволяет для повторного использования первичного антитела, если это необходимо.
  4. Вымойте блюдо 3 - 5 раз 1х PBS, удаления и отбрасывая PBS после каждой промывки.
  5. Добавить 0,5 мл раствора вторичного антитела. При желании, добавить флуоресцентно-меченый фаллоидина (рекомендуются следующие любого производителя концентрации) на этом этапе. Инкубируют в течение 1 ч (при комнатной температуре) или O / N (при 4 ° C).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Использование флуоресцентно-меченых фаллоидином позволяет выводить нитей актина; мы обнаружили, что 488-меченные фаллоидином лучше всего работает в нашей данио кератоцитов, но и другие флуорофоров могут быть использованы.
  6. Снимите и выбросьте решение вторичное антитело.
  7. Вымойте блюдо 3 - 5 раз 1х PBS, удаления и отбрасывая PBS после каждой промывки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: блюдо можно хранить, покрыто от света месте при температуре 4 ° С, если не в состоянии соперничатьW немедленно; убедитесь, что 1x PBS добавляют в блюдо перед хранением, чтобы обеспечить клетки не высыхают, но нагреться до комнатной температуры (20 - 30 мин), затем снимите PBS непосредственно перед переходом к следующему шагу.
  8. Когда все будет готово, чтобы наблюдать, добавить 2 - 3 капли монтажной среды, с или без DAPI, в зависимости от экспериментальных потребностей, в блюдо и оставьте на 10 минут при комнатной температуре.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Мы используем имеющиеся в продаже, на основе глицерина гистологическая среда с DAPI, но и другие монтажные средства массовой информации могут быть использованы. Разрешение 10 мин для монтажа среды, чтобы сидеть в блюдо облегчает удаление покровного стекла в нижней части блюда.
  9. После инкубации слегка сжать по бокам тарелки, чтобы ослабить и удалить покровное. Добавить дополнительное падение монтажных СМИ на предметное стекло и поместите покровное, клетки вниз, на слайде.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Рассмотрим герметизации покровное к слайду с использованием четких лака для ногтей, если слайд должен быть дольше, чем 1 - 2 дней.
  10. Обратите внимание на слайд под флуоресцентным микроскопом.
    Примечание: Большинство наших изображений были приняты с использованием 40X или 63x объектив под масляной иммерсией, но конкретный объектив будет зависеть от экспериментального протокола.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Как показано на фиг.1, листы кератоцитов можно наблюдать миграцию из-под шкалы в течение нескольких часов установления Эксплант. Иногда индивидуально миграции кератоцитов который оторвался от коллективно миграции листа можно наблюдать. Кроме того, как было установлено эксплантов из рыбы, которую предварительно щипковый инструмент, обильные нейтрофилы, мигрирующие через лист. В более длительных периодов культуры, кератоцитов лист фрагменты как клетки подвергаются ЕМТ 14.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Наиболее важным шагом для успеха кератоцитов эксплантов культуры позволяет масштаб, чтобы присоединиться к культуральной чашке в течение приблизительно 2 - 3 мин перед добавлением в культуральную среду. Приблизительно 75% весов будет прилипать и расти листов (количество культур, установленных для каждого эксперимента должны быть соответствующим образом скорректированы). Кератоцитов листов не образуют вокруг каждого масштаба удаляется из рыбы и помещали в культуру по нескольким причинам. Во-первых, DAPI окрашивание экспл...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы не имеют ничего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана за счет средств Среднем Западе Университетского колледжа наук о здоровье Исследования по упрощению гранта, предоставленного для EEH и Среднем Западе университета Управления научных исследований и программ, финансируемых Внутренние гранта, предоставленного для KJL.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Чашки для культуры со стеклянным дном 35 мм (покрытые поли-D лизином)MatTekP35GC-1.5-14-Cтолщиной 1.5 мм лучше всего подходит для удаления покровного стекла. Диаметр 14 мм обеспечивает большую площадь культивирования.
Щипцы Swiss Jewelers Style, Integra, Miltex 17-303VWR21909-460Мы считаем, что узкие, тонкие щипцы лучше всего подходят для удаления чешуек.

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Burton, K., Park, J. H., Taylor, D. L. Keratocytes generate traction forces in two phases. Molecular Biology of the Cell. 10, 3745-3769 (1999).
  2. Keren, K., et al. Mechanism of shape determination in motile cells. Nature. 453, 475-480 (2008).
  3. Lacayo, C. I., et al. Emergence of large-scale cell morphology and movement from local actin filament growth dynamics. PLOS Biology. 5, 233(2007).
  4. Lee, J., Ishihara, A., Theriot, J. A., Jacobson, K. Principles of locomotion for simple-shaped cells. Nature. 362, 167-171 (1993).
  5. Kolega, J. The Movement of Cell Clusters. J. Cell Sci. 49, 15-32 (1981).
  6. Kolega, J. Effects of mechanical tension on protrusive activity and microfilament and intermediate filament organization in an epidermal epithelium moving in culture. The Journal of Cell Biology. 102, 1400-1411 (1986).
  7. Rapanan, J. L., Cooper, K. E., Leyva, K. J., Hull, E. E. Collective cell migration of primary zebrafish keratocytes. Experimental Cell Research. 326, 155-165 (2014).
  8. Richardson, R., et al. Adult Zebrafish as a Model System for Cutaneous Wound-Healing Research. Journal of Investigative Dermatology. 133, 1655-1665 (2013).
  9. Cheon, H., et al. Increased expression of pro-inflammatory cytokines and metalloproteinase-1 by TGF-b1 in synovial fibroblasts from rheumatoid arthritis and normal individuals. Clinica., & Experimental Immunology. 127, 547-552 (2002).
  10. Sandeman, S. R., Faragher, R. G. A., Allen, M. C. A., Liu, C., Lloyd, A. W. Does MMP-2 expression and secretion change with increasing serial passage of keratocytes in culture. Mechanisms of Ageing and Development. 122, 157-167 (2001).
  11. Schnaper, H. W., et al. Increased expression of extracellular matrix proteins and decreased expression of matrix proteases after serial passage of glomerular mesangial cells. Journal of Cell Science. 109, 2521-2528 (1996).
  12. Tondreau, T., et al. In vitro study of matrix metalloproteinase/tissue inhibitor of metalloproteinase production by mesenchymal stromal cells in response to inflammatory cytokines: the role of their migration in injured tissues. Cytotherapy. 11, 559-569 (2009).
  13. Zimmermann, T., et al. Isolation and characterization of rheumatoid arthritis synovial fibroblasts from primary culture - primary culture cells markedly differ from fourth-passage cells. Arthritis Research. 3, 72-76 (2001).
  14. McDonald, T. M., et al. Zebrafish keratocyte explant cultures as a wound healing model system: differential gene expressio., & morphological changes support epithelial–mesenchymal transition. Experimental Cell Research. 319, 1815-1827 (2013).
  15. Tan, B., Pascual, A., de Beus, A., Cooper, K., Hull, E. TGFb (transforming growth factor b) and keratocyte motility in 24-hour zebrafish explant cultures. Cell Biology International. 35, 1131-1139 (2011).
  16. Barut, B. A., Zon, L. I. Realizing the potential of zebrafish as a model for human disease. Physiological Genomics. 2, 49-51 (2000).
  17. Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nature Reviews Genetics. 8, 353-367 (2007).
  18. Santoriello, C., Zon, L. I. Hooked! Modeling human disease in zebrafish. The Journal of Clinical Investigation. 122, 2337-2343 (2012).
  19. Etchin, J., Kanki, J. P., Look, A. T. Methods in Cell Biology. Westerfield, M., Detric, H. W., Zon, L. I. 105, Academic Press. 309-337 (2011).
  20. Li, P., White, R. M., Zon, L. I. Methods in Cell Biology. Westerfield, M., White, H. W., Zon, L. I. 105, Academic Press. 403-417 (2011).
  21. Yen, J., et al. The genetic heterogeneity and mutational burden of engineered melanomas in zebrafish models. Genome Biology. 14, R113(2013).
  22. Bouzaffour, M., Dufourcq, P., Lecaudey, V., Haas, P., Vriz, S. Fgf and Sdf-1 Pathways Interact during Zebrafish Fin Regeneration. PLoS One. 4, e5824(2009).
  23. Dufourcq, P., Vriz, S. The chemokine SDF-1 regulates blastema formation during zebrafish fin regeneration. Development Genes and Evolution. 216, 635-639 (2006).
  24. Lee, Y., Grill, S., Sanchez, A., Murphy-Ryan, M., Poss, K. D. Fgf signaling instructs position-dependent growth rate during zebrafish fin regeneration. Development. 132, 5173-5183 (2005).
  25. Hyde, D. R., Godwin, A. R., Thummel, R. In vivo Electroporation of Morpholinos into the Regenerating Adult Zebrafish Tail Fin. Journal of Visualized Experiments. 61, e3632(2012).
  26. Kizil, C., Iltzsche, A., Kaslin, J., Brand, M. Micromanipulation of Gene Expression in the Adult Zebrafish Brain Using Cerebroventricular Microinjection of Morpholino Oligonucleotides. Journal of Visualized Experiments. 75, e50415(2013).
  27. Konantz, J., Antos, C. L. Reverse Genetic Morpholino Approach Using Cardiac Ventricular Injection to Transfect Multiple Difficult-to-target Tissues in the Zebrafish Larva. Journal of Visualized Experiments. 88, e51595(2014).
  28. Rambabu, K. M., Rao, S. H., Rao, N. M. Efficient expression of transgenes in adult zebrafish by electroporation. BMC Biotechnology. 5, 29(2005).
  29. Rapanan, J. L., Cooper, K. E., Leyva, K. J., Hull, E. E. During collective migration, leader keratocytes generate tension in sheet and may become follower or individually migrating cells. Experimental Cell Research. In press, (2014).
  30. Safferling, K., et al. Wound healing revised: A novel reepithelialization mechanism revealed by in vitro and in silico models). The Journal of Cell Biology. 203, 691-709 (2013).
  31. McDonald, T. M., et al. Matrix metalloproteinases and collective cell migration in 24 primary zebrafish explant cultures: MMP13 plays an inhibitory role and MMP14 may respond to stretch during reepithelialisation. Cell Biology International Reports. 20, 24-36 (2013).
  32. Haage, A., Nam, D. H., Ge, X., Schneider, I. C. Matrix metalloproteinase-14 is a mechanically regulated activator of secreted MMPs and invasion. Biochemical and Biophysical Research Communications. , (2014).
  33. Sire, J. -Y., Girondot, M., Babiar, O. Marking zebrafish, Danio rerio (cyprinidae), using scale regeneration. The Journal of Experimental Zoology. 286, 297-304 (2000).
  34. Xu, Z., et al. Teleost skin, an ancient mucosal surface that elicits gut-like immune responses. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110, 13097-13102 (2013).
  35. Keren, K., Yam, P. T., Kinkhabwala, A., Mogilner, A., Theriot, J. A. Intracellular fluid flow in rapidly moving cells. Nature Cell Biology. 11, 1219-1224 (2009).
  36. Bereiter-Hahn, J., Strohmeier, R., Kunzenbacher, I., Beck, K., Voth, M. Locomotion of Xenopus epidermis cells in primary culture. Journal of Cell Science. 52, 289-311 (1981).
  37. Nishikawa, A., Shimizu-Nishikawa, K., Miller, L. Isolation, characterization, and in vitro culture of larval and adult epidermal cells of the frog Xenopus laevis. In Vitro Cellula., & Developmental Biology. 26, 1128-1134 (1990).
  38. Schober, M., et al. Focal adhesion kinase modulates tension signaling to control actin and focal adhesion dynamics. The Journal of Cell Biology. 176, 667-680 (2007).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи