Методическая статья

Полу-высокопроизводительного скрининга для потенциальных засухой толерантности в салат ( Lactuca посевная) зародышевой плазмы Коллекции

DOI:

10.3791/52492

⸱

17 апреля 2015 г.

 , 
1Agricultural Research Service, United States Department of Agriculture

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол был разработан для скрининга большой коллекции зародышевой плазмы листового овощного салата (Lactuca sativa L.) на устойчивость к засухе, чтобы определить небольшой пул салата-кандидата для использования в физиологических, молекулярных и генетических исследованиях для определения основных черт засухоустойчивости наряду с программами селекции.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол описывает метод, с помощью которого большая коллекция листового зеленого овощного салата (Lactuca sativa L.) была проверена на вероятные засухоустойчивые признаки. Доступность пресной воды для использования в сельском хозяйстве вызывает растущую обеспокоенность в Соединенных Штатах, а также во многих регионах мира. Краткосрочные засухи наряду с регулятивным вмешательством в регулирование водообеспеченности в сочетании с надвигающейся угрозой долгосрочных климатических сдвигов, которые могут привести к сокращению осадков во многих важных сельскохозяйственных регионах, усилили потребность в ускорении выведения сельскохозяйственных культур, адаптированных к повышению эффективности использования водных ресурсов, чтобы сохранить или расширить производство в ближайшие годы. Этот протокол не является пошаговым руководством по выявлению на физиологическом или молекулярном уровне засухоустойчивых черт салата, а скорее представляет собой метод, разработанный и усовершенствованный путем скрининга тысяч различных сортов салата. Характер этого скрининга частично основан на упорядоченных измерениях, сосредоточенных только на трех показателях водного стресса: относительном содержании воды в листьях, увядании и дифференциальном росте растений после стресса от засухи. Цель быстрого скрининга большой коллекции зародышевой плазмы состоит в том, чтобы сузить пул кандидатов до такой степени, чтобы можно было применять более интенсивные физиологические, молекулярные и генетические методы для выявления специфических засухоустойчивых признаков в лаборатории или в полевых условиях. Кандидаты также могут быть непосредственно включены в программы селекции в качестве источника засухоустойчивых признаков.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Доступность воды для орошения была проблемой на большей части территории Соединенных Штатов и во всем мире на протяжении десятилетий, но исследования реакции на стресс от засухи, наряду с другими абиотическими стрессами, отстают от работы в области устойчивости к болезням и насекомым на промышленном, академическом и правительственном уровнях в основном из-за нехватки финансирования. Исторически сложилось так, что вопрос о доступности воды для сельского хозяйства был лишь второстепенной задачей на уровне директивных органов. В последнее время из-за нескольких сильных засух в важных регионах сельскохозяйственного производства как в Соединенных Штатах, так ив Австралии доступность пресной воды оказалась в центре внимания как на национальном, так и на международном уровнях, что привело к тому, что гораздо больше ресурсов было направлено на исследования по созданию засухоустойчивых сортов основных зерновых культур. Хотя это смещение акцента в сторону выведения засухоустойчивых основных культур является полезным, как и многие области исследований растений, специализированные культуры в значительной степени остались позади.

Сильная засуха в настоящее время ограничивает производство овощей в Калифорнии, крупнейшем регионе производства салата (Lactuca sativa L.) в Соединенных Штатах3. Эти краткосрочные погодные условия в сочетании с законодательными и судебными мерами наряду с долгосрочным изменением климата4,5 в совокупности привели к сокращению воды, доступной для сельского хозяйства во многих из наиболее продуктивных регионов Калифорнии. Производство салата в Калифорнии представляет собой индустрию стоимостью 1,5 миллиарда долларов, на которую приходится почти 80% производства салата в Соединенных Штатах3. Листовые овощи имеют высокое содержание воды в листьях, а салат, в частности, имеет неглубокую корневую систему6,7, что делает культуру уязвимой к водному стрессу. В салате-латуке, как и во всех других культурах, выведение засухоустойчивых сортов будет приобретать все большее значение, поскольку запасы пресной воды для орошения становятся все более ограниченными8.

В этом протоколе изложен метод, с помощью которого был проведен первоначальный скрининг большой коллекции зародышевой плазмы салата, чтобы определить пул потенциально устойчивых к засухе линий-кандидатов для использования в физиологических, молекулярных и генетических исследованиях для определения конкретных засухоустойчивых признаков. Эти кандидаты также могут быть непосредственно использованы в качестве источников засухоустойчивости в селекционных программах для повышения эффективности использования воды в коммерческих сортах. Этот протокол был разработан специально для решения проблем, возникающих в ходе любого скрининга обширной коллекции зародышевой плазмы, особенно вопросов доступности места и рабочей силы. Кроме того, представленный протокол был разработан для использования в салате-латуке, но был успешно адаптирован для использования при скрининге коллекции зародышевой плазмы шпината (Spinacia oleracea) на потенциальную засухоустойчивость и может быть изменен просто для скрининга любой листовой овощной культуры.

Важным соображением перед началом скрининга на засухоустойчивость является понимание того, чем является этот метод, а чем нет. Этот протокол представляет собой быстрый метод, с помощью которого большой пул зародышевой плазмы может быть быстро и эффективно сужен до управляемого числа кандидатов в зародышевую плазму для использования в более целенаправленных и тщательных исследованиях по выявлению индивидуальных черт толерантности. Этот протокол подвергает растения быстро индуцированному сильному водному стрессу в отличие от более естественного медленно индуцированного умеренного продолжительного засухового стресса, который наблюдался бы в полевых условиях. Тип реакции, вызванной внутри предприятия во время этих двух типов событий водного стресса (быстрое обезвоживание в сравнении с естественной засухой), не идентичен9, что может привести к исключению некоторых материалов из будущих испытаний. Эти два стрессовых события не лишены дублирования, и этот протокол должен служить эффективным способом идентификации потенциально засухоустойчивой зародышевой плазмы, содержащейся в большой коллекции. Этот протокол сам по себе не следует считать достаточным для идентификации с высокой степенью достоверности зародышевой плазмы, которая обладает устойчивой засухоустойчивостью в условиях полевого водного стресса, но он представляет собой значительный шаг вперед в быстром скрининге листовых зеленых овощей на потенциальные засухоустойчивые признаки.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Посадка

  1. Пробку поддоны (128 клеток; 28 х 54 см с ячейками 3 см квадратных и 5 см в глубину) со смесью плагин почвы. Для помощи в равномерного заполнения ячеек сжатия почвы в каждом лотке с помощью пустого лотка зажигания.
  2. Завод салат семена ¼ дюйма в глубину 2-3 семян на ячейку. Завод все экспериментальные линии в повторяющихся лотков обеспечивают как засуха подчеркнул и лотки управления для судебного разбирательства засухи.
  3. Вставьте вилку лотков в поддоном без отверстий.
  4. Водные лотки и крышки с перевернутой лоток или пластиковой купол. Прорастание обычно происходит в 48-72 ч. После прорастания снять крышку и перейти лотки в теплице.
    Примечание: Этот протокол также может быть выполнена в ростовых камерах.

2. Рост и Уход за растениями

  1. Водные лотки по мере необходимости из 1-4 недель после появления всходов, обычно это 2-3 раза в неделю, заполнив нижний лоток и позволяет почву насыщается (~ 1 час) лучи, чтобы сидеть в течение длительного периодас в воде, как это может негативно повлиять на здоровье растений и развитие корневой системы и может повлиять на экран засухи.
  2. Оплодотворите лотки один раз в неделю с коммерческой растворимого 20-20-20 удобрения, смешанного со скоростью 1,5 ч.л. / галлон.
  3. Тонкие лотки до одного завода в клеточных 1-2 недель после прорастания.

3. Инициирование засухи

  1. Когда растения четыре недель отдельные лотки в 2 группах. Тема одна группа для острого дефицита воды. Используйте другие лотки, а также поливают управления. Вода в контрольной группе, что и в стадии 2,1 в течение всего эксперимента. В инициации засухи приостановить удобрения всех лотков для остальной части эксперимента.
  2. Экспериментальный период засухи происходит в течение одной недели. На начальном день суда засухи (день 0) заполнить все нижние лотки с водой и дайте почвы в пробке лотков, чтобы стать полностью насыщенным затем слить воду из лотков. Насыщение почвы непосредственно перед началом тHe период стресса поможет свести к минимуму любые изменения в почвенной влаги между отдельными клетками в пробке лотков.

4. Проведение стресс-экрана Основные засухой измеряемых параметров

Примечание: Следующие шаги описывают, как собрать три физиологических измерений, которые будут записаны в течение части экрана засухи в то время как В таблице 1 приводится график проведения измерений в каждый день от засухи стресс испытательного срока.

  1. Измерьте Leaf Относительная доля воды (RWC) в дни 0, 2, 4 судебного разбирательства.
    1. Клип салата растение из лотка и удалите 2 листьев.
    2. Удар 3 диски с каждого листа, используя # 9 пробки буром (~ диаметр 1,6 см). Комбинат листьев ударов, как одного образца.
    3. Взвесить дисков листьев, это значение сырого веса (FW), используемый для расчета RWC, затем поместить диски в чашку Петри.
    4. Добавить дистиллированной воды ровно столько, чтобы пластины для всехой все листовые пластинки плавать. Это необходимо для полной гидратации дисков листьев, чтобы собрать напыщенный веса для RWC анализа. Разрешить диски листьев, чтобы плавать в течение 24 ч при комнатной температуре.
    5. Снимите теперь полностью гидратированных диски лист из пластин и осторожно высушить Внешний вид листовых дисков с бумажными полотенцами перед взвешиванием диски. Запишите эти веса, как напыщенный веса (TW) для RWC расчета.
    6. Место листовые диски на лабораторном бумаги стереть или фильтровальную бумагу диска в открытом Петри и сушат в термостате при 55 ° С в течение 24 ч.
      ПРИМЕЧАНИЕ: бумага предотвращает дисков листьев от присоединения к чашке Петри во время сушки.
    7. Взвешивание сухих листьев диски и записывать в виде сухих веса (DW) для RWC расчета.
    8. Рассчитать RWC по формуле Уэзерли, как описано умные и Бингем 11,12.
      RWC = (FW-DW / TW-DW) * 100
      FW = сырой массы, в TW = напыщенный масса, СМ = сухая масса
    9. Повторите шаг 4,1 для каждого зародышевой плазмы и лечения в исследовании.
  2. Запишите завод хочешь один раз в день, начиная с дня 1 судебного разбирательства засухи и заканчивая, когда 100% растений увядшие, как правило, 4 день или 5.
  3. Фаза восстановления и дифференциального роста
    1. На 6-й день, заключить период засухи стресс и ударные установки войти в фазу восстановления судебного разбирательства. Заполните нижние лотки с водой и дайте засуха подчеркнул лотки впитаться в течение 24 часов, прежде чем возобновить стандартный график полива, шаг 2,1, как управляющие лотков.
    2. Разрешить все растения восстановиться в течение 10 дней.
    3. В 10 дней после засухи стресс урожай надземной части каждого растения полностью, и записать свежий вес.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

При выполнении большого экрана, позволяющей сортировать население желаемым экспериментальной признака, в случае этого протокола ответ от засухи стресс, данные, полученные будет соответственно изменяться от очень подчеркнуть восприимчивы к вероятной засухоустойчивых и во всех пунктах между ними. Рисунок 1 содержит графы, представляющие тип результатов, которые можно ожидать от этого протокола. Представительства сортов трех различных типов салата (ромэн (CoS), crisphead и butterhead) включены в приведенны...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Соображения объема выборки для экрана.

Количество образцов, необходимых должны быть основаны на желаемой использования данных из этого экрана. Если результаты качественное издание желательно рекомендуется собирать 3 отдельных растений (3 биологических повторяет) из каждой строки и выполнить минимум 2 экспериментальных повторов, чтобы дать адекватные баллов за качество статистического анализа. Если желаемый результат просто быстро сузить большой бассейн кандидата зародышевой ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы хотели бы поблагодарить Департамент продовольствия и сельского хозяйства Калифорнии за финансирование проекта, который привел к разработке этого протокола. CDFA SCB11019.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Поддон для пробок 128T.O. Plastics
Hummert International		11-8595-1Подойдет лоток для пробок любой марки, но для всех испытаний используйте лотки одного и того же типа.
нижний лоток (Демонстрационный лоток)T.O. Plastics
Hummert International		11-3305-1
заглушка/посадочная смесь (Sunshine Mix #5)Sunshine
Hummert International		10-0467-1При адаптации этого протокола к другой культуре может потребоваться замена другой смеси.  Солнечная смесь #4 использовалась в испытаниях шпината.
удобрение (20-20-20)Jack's: Профессиональное водорастворимое удобрение
Hummert International		07-5915-1Можно использовать любое удобрение, при необходимости регулируйте тип для адаптации этого протокола к конкретным потребностям культуры.

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Dijk, A. I. J. M., et al. The Millennium Drought in southeast Australia (2001–2009): Natural and human causes and implications for water resources, ecosystems, economy, and society. Water Resour. Res. 49, (2013).
  2. Aghakouchak, A., Feldman, D., Stewardson, M. J., Saphores, J., Grant, S., Sanders, B. Australia’s Drought: Lessons for California. Science. 343, 1430(2014).
  3. Tolomeo, V. California Agricultural Statistics 2012 Crop Year. USDA National Agricultural Statistics Service Pacific Regional Office-California. , http://www.nass.usda.gov/Statistics_by_State/California/Publications/California_Ag_Statistics/Reports/2012cas-all.pdf (2013).
  4. Cavagnaro, T., et al. Climate Change: Challenges and Solutions for California Agricultural Landscapes. White paper CEC-500-2005-189-SF. California Climate Change Center. , Available from: http://www.energy.ca.gov/2005publications/CEC-500-2005-189/CEC-500-2005-189-SF.PDF (2005).
  5. Lobell, D. B., Gourdji, S. M. The Influence of Climate Change on Global Crop Productivity. Plant Physiol. 160, 1686-1697 (2012).
  6. Jackson, L. E., Stivers, L. J. Root distribution of lettuce under commercial production: implications for crop uptake of nitrogen. Biological Agriculture and Horticulture. 9, 273-293 (1993).
  7. Jackson, L. E. Root architecture in cultivated and wild lettuce (Lactuca spp). Plant. Cell and Environment. 18, 885-897 (1995).
  8. Malcom, S., Marshall, E., Aillery, M., Heisey, P., Livingston, M., Day-Rubenstein, K. Agricultural Adaptation to a Changing Climate: Economic and Environmental Implications Vary by U.S Region. USDA Economic Research Service. Economic Research Report Number. 136, Available from: http://www.ers.usda.gov/media/848748/err136.pdf (2012).
  9. Chaves, M. M., Maroco, J. P., Pereira, J. S. Understanding plant responses to drought- from genes to the whole plant. Funct. Plant Biol. 30, 239-264 (2003).
  10. Ingram, J., Bartels, D. The Molecular Basis of Dehydration Tolerance in Plants. Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 47, 377-403 (1996).
  11. Weatherley, P. E. Studies in the water relations of the cotton plant. I. The field measurement of water deficits in leaves. New Phlytol. 49, 81-97 (1950).
  12. Smart, R. E., Bingham, G. E. Rapid Estimates of Relative Water Content. Plant Physiol. 53, 258-260 (1974).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи