Экспериментальная оценка мыши Общительность с помощью автоматизированной обработки изображений подход

Краткое содержание

Этот протокол описывает метод количественной оценки мыши коммуникабельность. Мыши на видеопленку, как они двигаются и взаимодействуют в специальной клетке. Обработка Movie позволяет автоматизированной количественной оценки общительности с высокой точностью и надежностью.

Аннотация

Мышь является предпочтительной моделью организма для тестирования лекарств, предназначенных для повышения коммуникабельности. Мы представляем метод количественной оценки общительности мыши, в котором тест мыши помещается в стандартном аппарате и соответствующие формы поведения оцениваются трех различных сессий (называется сессия I, II и III).

Устройство имеет три отделения (смотри рисунок 1), левый и правый отсеки содержат перевернутую чашку , которая может разместится мышь ( так называемый "стимул мышь").

В Сессия I, тест мышь помещают в клетку и ее подвижность характеризуется числом переходов, сделанных между отсеками. В сессии II, стимул мыши находится под одной из перевернутых чашек и коммуникабельность испытательной мыши количественно с помощью количества времени он тратит около чашку , содержащую прилагаемую стимул мыши против пустого перевернутой чашки. В сессии III, перевернутые чашки удалили d оба мышей свободно взаимодействуют между собой. Общительностью тестовой мыши в сессии III количественно определяется числом социальных подходов оно делает к стимульном мыши и сколько раз он избегает социальный подход, стимул мыши.

Автоматизированная оценка фильма обнаруживает нос тест мыши, что позволяет определить все описанные меры общительности в сессии I и II (в сессии III, подходы определены автоматически, но классифицируются вручную). Чтобы найти нос, образ пустой клетки в цифровой форме вычитают из каждого кадра из фильма и полученное изображение бинаризуется идентифицировать пиксели мыши. Хвост мыши автоматически удаляется и две наиболее удаленные точки оставшейся мыши определяются; это близко к носу и основания хвоста. Анализируя движение мыши и используя аргументы непрерывности, нос идентифицируется.

"Рисунок 1" SRC = "/ файлы / ftp_upload / 52508 / 52508fig1.jpg" />
Рисунок 1. Оценка Общительность течение 3 -х сессий Сессия I (сверху):.. Acclimation тестовой мыши к клетке Сессия II (средний):. Тест мышь свободно перемещаться в клетке , в то время как стимул мыши заключена в перевернутой чашки Сессия III (внизу): Оба теста мыши и стимул мыши могут свободно перемещаться и взаимодействовать друг с другом.

Введение

Недостатками коммуникабельность является одним из основных симптомов доменов в диапазоне неврологическими расстройствами, в том числе расстройств аутистического спектра (РАС) ^1,2. Это существенно ограничивает способность пациентов развивать отношения и в значительной степени влияет на пациентов, семей и лиц , осуществляющих уход ^2,3.

В попытке лучше понять механизм , лежащий в основе нарушенную коммуникабельность и разработки методов лечения, несколько мышиных моделей изучались ^1,4-9. Одним из таких является штамм BALB / с мыши, инбредным штамм , который проявляет поразительно низкую коммуникабельность, напоминающие черты наблюдаются у пациентов с ASD5 ^8-12. Так , например, BALB / C мыши отображает более низкую частоту социальных подходов и , как правило , негативный ответ на социальные подходы раздражителем мыши (например, социальное избегания) , чем компаратор напряжения Swiss Webster ^10.

Для того, чтобы проверить, является ли effectiv предложенное лечениее в повышении коммуникабельности, необходимы объективные меры. Широко принято рамки для анализа общительности в стандартизированном аппарат , который имеет три отделения (см рисунок 1).

Левый и правый отсеки содержат каждая перевернутую чашку проволоки, которая вмещает социально заметную стимул мыши. Тест мыши выпущена в устройство для трех интервалов 10 мин (сеансов I-III); Сессия I оценивает двигательную активность тест-мыши, в то время сессии II и III оценить различные аспекты общительности тестового мыши.

В сеансе я, тест мыши дают акклиматизироваться к устройству. В этой сессии, число переходов, что тест мыши делает между различными отсеками измеряется. Важно отметить, что меры коммуникабельность, полученные в стандартном трехсекционном аппарата зависит от двигательной активности, а также снижение двигательной активности может запутать интерпретацию Sociспособность данных.

В сессии II, тест мыши свободно перемещаться и стимул мыши находится под одной из перевернутых чашек (уравновешенный). Мыши раздражителя 4-недельных беспородных мышей-самцов ICR, возраста и пола соответствует испытуемым мышей. Стимул мыши заключена в перевернутой чашке в сторону обозначенной как социальный отсек, а пустой перевернутый чашка помещается в указанную сторону, как несоциальна отсека. В сессии II, общительностью тестовой мыши количественно путем сравнения времени прохождения вблизи от "социального" перевернутой чашки (менее 2 см от отеля) против времени он проводит рядом с "асоциальный" перевернутой чашки, и к тому времени , она проводит в социальной купе против времени он проводит в несоциальна отсеке. Swiss Webster мышей компаратор проводят значительно больше времени в социальной отсеке рядом с социальной перевернутой чашки по сравнению с BALB / с мышей, которые не показывают никакого существенного предпочтение социальнойперевернутая чашка или социальное отделение ^12.

В сессии III, испытания и стимулирования мышей могут свободно взаимодействовать (перевернутые чашки удалены). Меры общительности, стереотипные модели поведения и переходы между отсеками надежно получены в третьей сессии 10 мин свободного взаимодействия между тестом и стимулирования мышей и анализировали. В этом докладе, коммуникабельность испытательной мыши количественно с помощью двух мер: 1) число социальных подходов он делает к стимул мыши, где социальный подход определяется как движение вперед (нос сначала) в направлении стимула мыши так, чтобы нос менее 2 см от стимула мыши; 2) число избеганий социальных подходов стимула мыши. Тест мыши считается избегать подхода, если он поворачивает или отдаляется от стимула мыши, или если она временно прекращает движение ( "замирания") после того, как стимул мыши подошел тест мыши. BALB /гр мышей показывают снижение числа социальных подходов , сделанных в направлении стимула мыши и увеличение числа отрицательных ответов на социальных подходов стимула мыши, по сравнению с компаратором штамма Swiss Webster ^10.

Оценка поведенческих фильмов традиционно делается вручную, т.е. путем тщательного просмотра фильма (возможно , на пониженной скорости) и активации секундомера в течение времени мышь проводит в определенном отделении или рядом с одним из перевернутых чашек ^10. Этот метод требует, наблюдая фильма несколько раз, и, следовательно, очень много времени. Кроме того, точность ограничена по времени реакции рейтер для измерения секундомера и способности воспринимать ли мышь в пределах 2 см от перевернутой чашки. В недавней работе, двух соединений, (D-серин и D-циклосерин) доказали свою эффективность в восстановлении общительность BALB / с мышей ^9,10,12. Известно, что оба компонента ППБУпоздно рецептор NMDA, который , как известно, играет центральную роль в социальном поведении ^2,12. Большой массив соединений, как известно, модулировать активность рецептора NMDA в различных четко определенных способов, и потенциал для прорыва в лечении ASD делает ускоренную оценку этих соединений приоритет и быстрый автоматический метод оценки весьма желательно.

Ниже описан автоматический процедура анализа, разработанная для оценки общительности мыши. Он использует методы обработки изображений на всех кадрах из фильмов мыши, чтобы определить положение мыши или мышей. В сессиях I и II, он дополнительно определяет положение носа и использует его для вычисления меры общительности. В сессии III, он автоматически определяет все подходы, но требуется ручное классификация (социальный подход, социальная избегание, или другой).

Протокол

Протокол для простоты объяснения было разделено на 2 части: 1) Экспериментальная процедура и 2) автоматизированный анализ. Все животные были обработаны в соответствии с Руководством по уходу и использованию лабораторных животных ^15, и все процедуры были одобрены уходу и использованию комитета Institutional животных путем.

1. Процедура Экспериментальная

1. Установите клетку, которая представляет собой черный неотражающие оргстекла прямоугольный ящик (52 х 25 х 23 см ³⁾ разделен на три отсека: социальные, несоциальна и нейтрального среднего отсека (рисунок 1). Поместите перевернутые чашки проволоки в каждой из концевых отсеков во время сессий I и II (обсуждается ниже) и дом стимул мыши во время сессии II.
2. Настройте камеру таким образом, что клетка заполняет поле зрения. Так как освещение может помешать поведение мыши, сохранить яркость не более 3,5 лк внутри клетки, исходя из отраженного света отЛампа накаливания и измеренная на полу клетки в направлении вверх. Кроме того, использование инфракрасного источника света, который мышей не может чувствовать, но камера может обнаружить. Запишите все фильмы в 720 х 480 стандартной четкости.
3. Запись одного кадра пустой клетки для последующей обработки изображений (так называемый "опорный кадр") и сохранить в виде черно-белое изображение.
4. Сессия I: Введение тест-мышь в клетку и волны рукой по клетке, что указывает на начало сеанса (сравните автоматизированный анализ). Запись фильма в течение 10 мин. В конце 10 мин, поместить курсор в исходную клетку.
5. Сессия II: Положите стимул мышь под одной из перевернутых чашек (уравновешенный).
6. С помощью кнопки или "Социальный" левый "социальная справедливость", чтобы выбрать, является ли стимул мыши в перевернутой чашки на левой или в перевернутой чашке справа.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Перевернутая чашка с стимульном мыши называется "социальная чашка", тогда как другойКубок "несоциальна чашка". Отсек, в котором социальная чаша расположена называется социальной отсек, отсек с несоциальна чашка несоциальна отсек, а средний отсек "нейтральный отсек".
7. Введем тест-мышь в клетку. Волна руки над клеткой, чтобы указать начало сеанса св зи. Запись фильма в течение 10 мин. Важно отметить, что держать мышей в общительности аппарате перед удалением перевернутые чашки, чтобы начать заседание III.
8. Сессия III: Удалить перевернутые чашки, отпустите обе мыши и позволяют тестировать и стимулирующие мышей свободно взаимодействовать друг с другом. Волна руки над клеткой, чтобы указать начало сеанса св зи. Запись фильма в течение 10 мин. В конце 10 мин, поставить обе мышей обратно в соответствующие клетки.

2. Автоматический анализ

ПРИМЕЧАНИЕ: Команды в разделе 2 выпускаются через графический интерфейс пользователя (рисунок 2) , что коннаше программное обеспечение управления установлен. Здесь мы объясним обработку шаг за шагом, что наше программное обеспечение позволяет; Программное обеспечение также способен выполнять анализ в пакетном режиме без ввода данных пользователем.

1. Для каждого фильма, выполните следующие шаги обработки:
   1. Загрузите фильм (нажмите кнопку Load).
   2. Выберите конфигурацию клетку, которая сообщает программе анализа местоположения границ клетки, отсека границ и местоположения чашки. Выберите один из четырех сохраненных конфигураций или вручную настроить все координаты.
      Примечание: Конфигурация обычно не изменяется от одного эксперимента к другому и, следовательно, могут быть использованы повторно.
   3. Для каждого кадра из фильма, выполните следующие шаги обработки (2.1.3.1-2.1.3.6).
      1. Преобразование кадра в оттенках серого, нажав на кнопку "оттенки серого".
      2. Цифровым вычесть опорного кадра в оттенках серого (см шаг 1.3), нажав на кнопку "Subtract". Примечание: Цель этого шага заключается сделать пиксельные васифилисе рамы очень близко к нулю всюду за исключением положения курсора мыши.
      3. Binarize кадр, установив все пиксели ниже определенного порогового уровня до черного, все пиксели выше этого уровня на белый (нажмите на кнопку "Binarize").
         Примечание: Идея заключается в том, что, так как пиксели мыши, как правило, имеют более высокие значения, чем остальные пикселей, пиксели мыши станут белыми, а все остальные пиксели черного цвета. Оптимальный пороговый уровень зависит от условий освещения и может быть определена путем оценки формы мыши на протяжении фильма. Если пороговое значение выбрано слишком низкое, мышь оказывается слишком большим, а пиксели, которые не принадлежат к мыши могут быть окрашены в белый цвет. Если пороговое значение слишком велико, то мышь становится малым, и может распадаться на отключенных куски. В записанных фильмов, оптимальный порог всегда был в пределах от 20 до 35 лет (по шкале от 0 до 255).
      4. Erode ¹³ в бинаризуется раз картина е, а затем ¹³ 2e растянуть раз, то эроде снова в е раз, нажав на кнопку "Erod / Dil".
         Примечание: целью данной процедуры является удаление хвоста. Для разрешения (720 х 480), который был использован, е = 3 работал во всех обстоятельствах.
         Примечание: Программа автоматически проверяет на наличие руки в картине (во время записи фильмов, руки махали через картину, чтобы указать начало сеанса). Если рука присутствует, будет необычно много белых пикселов в кадре к двоичному виду, потому что рука гораздо больше, чем мышь. Условием присутствия стороны является то, что существует более 10000 белых пикселей в кадре в двоичную форму. Программное обеспечение определяет начало сеансов I, II и III, путем обнаружения диапазон кадров, в которых происходят движения рук.
2. В сессиях I и II, по-прежнему выглядит следующим образом:
   1. Обнаружить наибольший связанный компонент множества белых пикселей (Нажмите "LCOMP"). Примечание: Цель Oе этот шаг , чтобы устранить белые пиксели , которые не принадлежат к мыши, например, вызванное движением мыши стимула в сессии II. Самый большой подключенный компонент почти во всех кадров мыши.
   2. Определите два наиболее удаленных белых пикселей (так называемые «концы» из мыши), нажав кнопку "Найти Окончание".
      Примечание: Программное обеспечение устанавливает непрерывность двух концов, то есть для каждого из концов в первом кадре , к которому из концов в последующих кадрах , которым они принадлежат. Основная идея состоит в том, что, поскольку кадры записываются на высокой скорости, концы не могут ехать далеко от одного кадра к другому, так что для правильного продолжения концов от одного кадра к другому является то, что минимизирует сумму расстояний, концы двигаться. Смотрите обсуждение более подробно.
   3. Определите, какой конец мыши нос.
      1. Определить направление, в котором движется мышь, наблюдая, как центр тяжести (НГК)меняется от кадра к кадру (движение зубчатое является движение суммы всех пикселей мыши).
         Примечание: тяж из набора пикселей р _1, ..., р _п с координатами х _1, .., х _п определяется по формуле:
         
         Мыши , как правило , двигаться вперед (то есть, к их носу). В разделе нескольких сотен кадров, всегда есть очень высокая степень достоверности в обнаружении головы / хвоста.
         Примечание: Программное обеспечение автоматически определяет, к которому из обнаруженных заканчивается мышь движется; этот конец идентифицируется как нос и отмечены красным кружком в фильме. Когда обнаруженный нос отмечен красным кружком в каждом кадре, пользователь может проверить качество обнаружения.
3. В сессии III, по-прежнему выглядит следующим образом:
   1. Обнаружение двух крупнейших компонентов белых пикселей.
      1. Если оба приемлемого размера для утраУз и их центры тяжести (винтики) совместимы с винтиками мыши предыдущего кадра, рассмотрим эти два компонента двух мышей.
      2. Рассмотрим мышь размеры приемлемы, если они не изменились более чем на 20% по сравнению с предыдущим кадром, и рассмотрим винтики двух последовательных кадров, как совместимы, если их разность не больше, чем расстояние мышь может путешествовать во времени между кадрами (это расстояние следует от максимальной скорости мыши, которая может быть определена как часть препаратов в серии экспериментов с помощью анализа движения нескольких индивидуальных мышей (как в сеансах I и II).
         Примечание: Если два самых крупных компонентов не приемлемы размеры для мыши, или винтики слишком отличаются от тех, которые в предыдущем кадре, программа автоматически увеличивает порог бинаризации, пока два самых крупных компонентов не имеют приемлемого размера и их COGS совместимы с те из предыдущего кадра.
   2. Нажмите на тест-мышьпервый кадр. Используйте анализ в разделе 2.3.1 для идентификации как испытание и стимул мыши в каждом кадре сессии III.
   3. Определить кадры в сессии III, в котором одна мышь социально подходит другой. Примечание: Программное обеспечение реализует этот шаг автоматически проверяя, что расстояние между мышами меньше, чем типичное расстояние взаимодействия мышей (мы используем 2 см).
   4. Когда программное обеспечение воспроизводит короткий отрезок фильма с обнаруженным подходом к пользователю, нажмите на кнопку, чтобы указать, соответствует ли этот подход как социальный подход испытываемым мыши, социальное уклонение тест-мыши или ни.
      Примечание: Шаг 2.3.4 может быть автоматизировано, если известно, какие мыши тест мыши. Так как эта информация теряется, когда мыши слишком близко друг к другу (или подняться друг на друга), и так как мы до сих пор не нашли способ маркировать мышей таким образом, что можно надежно обнаружить с помощью нашего программного обеспечения и делает не влияет на их поведение, мы вернулись круководство по классификации на данный момент.
4. Для оценки обработанных фильмов, загрузка фильмов с помощью кнопки Load.
   1. Нажмите на кнопку Начать сессии 1, чтобы отобразить первый кадр сессии 1 (или Start Session 2, чтобы отобразить первый кадр сессии 2).
   2. Нажмите на Play / Stop, чтобы запускать и останавливать воспроизведение фильмов.
      Примечание: Обработанные фильмы будут показывать мышь с головой и хвостом, помеченной по-разному цветными кругами. Все меры коммуникабельность отображаются на экране, и обновляется по мере играет фильм.
   3. Экспорт коммуникабельность данные в формате Excel, нажав кнопку "Экспорт".
   4. Нажмите на "компиляцией данных", чтобы собрать все данные всех фильмов в папке в один Excel файл.

Результаты

На рисунке 3 показан цвет рамки поведенческом фильма с пустой клеткой. Мышь не была введена в клетку еще. Положение чашки, (социальные и несоциальна) и границ компартментов накладываются. Цвет рамки пустой клетке преобразуется в 8 бит в оттенках серого , как показано на рисунке 4 , и используется в качестве опорного кадра. Опорный кадр вычитается из любого другого кадра захваченного фильма.

На рисунке 5 показан один из кадров из фильма во вр...

Обсуждение

Объединив видеосъемку мышей и автоматический анализ фильма, мы создали доступную, надежную высокую пропускную способность методики скрининга.

Точность автоматизированного анализа сравнивали с результатами ручного анализа для более чем 100 фильмов. В подавляющем большинстве кадров (> 99%) кадров, нос мыши идентифицируется с хорошей точностью. Большая часть (несколько) misdetections не оказывают никакого влияния на меры общительности, так что около 80% фильмов не требует каких-либо исправле...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Клетка из плексигласа	Norva Plastics, Норфолк, Вирджиния		Размеры и планировка, описанные в рукописи, < и > могут быть скорректированы в соответствии с потребностями.< спальня/> Используйте неотражающее плексиглас для облегчения обработки изображений
Проволочные чашки	Kitchen plus	315	Используйте одну для дома стимульную мышь, одну пустую
видеокамеру	SONY	HDR-PJ790	Может быть заменена любой камерой с<бр/> Сопоставимые характеристики
OpenCV (Библиотека обработки изображений)	Willow Garage	N/A	Можно использовать любую современную библиотеку обработки изображений<бр/>.