Определение мембранного белка топологии с помощью флуоресцентной протеазы Защита (FPP)

Краткое содержание

Здесь мы представляем протокол для определения ориентации и топологии интегральных мембранных белков в живых клетках. Этот простой протокол основан на селективной чувствительности химер к протеазе между интересующим белком и GFP.

Аннотация

Правильная топология и ориентация интегральных мембранных белков необходимы для их правильного функционирования, однако такая информация не была установлена для многих мембранных белков. Представлен простой метод, называемый защитой флуоресцентных протеаз (FPP), который позволяет определить топологию мембранных белков в живых клетках. Этот метод имеет многочисленные преимущества по сравнению с другими методами определения топологии белка в том, что он не требует наличия множественных антител против различных доменов мембранного белка, не требует большого количества белка и может быть выполнен на живых клетках. Метод FPP использует пространственно ограниченное воздействие протеаз на деградацию мембранных белков, меченных зеленым флуоресцентным белком (GFP), для определения их мембранной топологии и ориентации. Этот простой подход применим к широкому спектру типов клеток и может быть использован для определения ориентации мембранных белков в различных субклеточных органеллах, таких как митохондрии, Гольджи, эндоплазматический ретикулум и компоненты эндосомальной/рециркуляционной системы. Мембранные белки, помеченные либо на N-концах, либо на C-концах с помощью слияния GFP, экспрессируются в интересующей клетке, которая подвергается селективной пермеабилизации с использованием детергента дигтонина. Дигитонин обладает способностью проникать через плазматическую мембрану, оставляя внутриклеточные органеллы нетронутыми. Фрагменты GFP, подвергшиеся воздействию цитозоля, могут избирательно разрушаться путем применения протеазы, в то время как фрагменты GFP, присутствующие в просвете органелл, защищены от протеазы и остаются неповрежденными. Анализ FPP прост, и результаты могут быть получены быстро.

Введение

Плазматических мембранах, а также многочисленные внутриклеточные мембраны, служат в качестве барьеров, разделяющих две водные отсеков. В случае плазменной мембраны, разделение между снаружи и внутри клетки; для внутриклеточных органелл это между цитоплазмой и органелл просвет. Например, эндоплазматический ретикулум (ЭР) мембрана отделяет окислительной среде в просвете ЭР от цитозольной восстановительной среде ^1. Мембранные белки синтезируются на ER-ассоциированной рибосом, и добиться их окончательного топологию в рамках ER мембраны ^2. Приобретение соответствующей ориентации мембраны и топологии для белков является критическим для их нормальной функции. Правильное топологии позволяет соответствующие домены мембранных белков взаимодействовать с их партнерами по связыванию, что позволяет критические пост-трансляционной модификации происходит, и в случае мембранных белков плазмы, позволяет клетке взаимодействовать с и реагировать то его окружении. Чтобы полностью оценить функцию мембранного белка, оно, очевидно, необходимо знать, как белок, который ориентирован относительно мембраны в котором она находится, то есть, ее мембраны топологии. В дополнение к приобретению фундаментальных научных знаний, понимания топологии мембранного белка и какие аспекты поверхности белка подвергаются различных средах имеет выраженных клинических последствия, поскольку мембранные белки составляют большинство фармакологических мишеней ^3. До недавнего времени подходы к определению топологии белка мембраны потребовали значительных затрат времени и денег или требуется реагенты, которые трудно найти.

Экспериментальных и в кремнии подходы были использованы, чтобы определить мембранный топологию белков, находящихся в плазматической мембране. С первых предсказаний мембраной доменов на основе оцененного гидрофобности INDIVIдвойные аминокислоты ^3, многочисленные прогностические алгоритмы теперь доступны в Интернете, и просто требуют знания последовательности что белок аминокислот. Тем не менее, предположения часто центральное место в программах моделирования, предположения, которые могут привести к неверным уступкам топологии ^4,5. Кроме того, в то время как эти компьютерные предсказания может предварительно задать мембраной областей, они не всегда определить, являются ли амино или карбокси-концы белков в цитоплазме, органелл или клеток просвет внешний вид. Даже с увеличением вычислительной мощности, и использование алгоритмов машинного обучения ^6, таких данных еще модели и должны быть проверены с помощью экспериментально полученных данных. Прямое экспериментальное определение мембраны топологии была предпринята с помощью панели моноклональных антител с известными эпитопов, распределенных по всему белка, где оценка их иммунореактивности было сделано до и после повышения проницаемости клеточной мембраны. Этоподход требует набор антител, которые не могут быть доступны для интересующего белка.

Альтернативной стратегией является инженер эпитопов метки, такие как Myc или гемагглютинина (HA) в различных местах по всему белка, снова с последующим определением иммунореактивности до и после мембраны проницаемости. В дополнение к иммуногенных тегов, ферментные метки (в том числе щелочной фосфатазы, β-галактозидазы, или β лактамазы) и химических модификаций, таких как сканирование цистеина все были использованы для определения топологии мембранного белка ^7,8. Дополнительный способ применяется для топологического отображения плазменных мембранных белков зависит от несколько иной подход к эпитопными тегов. В этом способе последовательность тег N-связанной последовательности гликозилирования консенсус NXS / T. Поскольку гликозилирование происходит только тогда, когда такая последовательность присутствует в просвете пути биосинтеза, в присутствии метки в сравнении просветацитозольного отсек легко наблюдать, как массового сдвига на ПААГ с ДСН. Такой подход был применен к multispanning ионного канала CFTR ^9. В то время как все эти подходы были использованы, становится ясно, что все они требуют значительных инвестиций в области молекулярной биологии, чтобы генерировать и последовательность коллектора конструкции.

Для определения топологической информации о трансмембранных белков, расположенных в пределах внутриклеточных органелл оказалась более сложной. Применение технологий, основанных флуоресценции однако, сделали вывод о том мембранной топологии намного проще. Методика бимолекулярного флуоресценции комплементации (BiFC) опирается на взаимодействие двух нефлуоресцирующих фрагментов флуоресцентного белка, восстановление флуоресцентные свойства этого белка ^10. Хотя первоначально описано для определения белок-белковых взаимодействий в естественных условиях ^10, этот подход был также использованчтобы определить топологию белка мембраны в клетках растений ^11. Однако этот подход также занимают много времени, так как требует поколение не только слитых белков с интересующим белком, но и различных слитых белков, направленных на цитозоле или органелл просвет, и требует знания которых внутриклеточных мембран интерес белка находится в ,

Альтернативный простой подход к определению топологию белка мембраны было описано ^12. Анализ, флуоресценции протеазы защиты (FPP) требуется генерирование слитого белка между GFP и гена. Этот подход основан на относительной доступности неспецифических протеаз в GFP части; в зависимости от того, GFP защищен от протеолиза, проживающих в просвет внутриклеточных органелл или подвергается протеолиза присутствует в цитозоле. Таким образом, если GFP фрагмент на интерес белка сталкивается в цитоплазму, она будет подвергаться воздействиюпротеазной активности, и сигнал флуоресценции потеряны. С другой стороны, если фрагмент GFP от интересующего белка сталкивается среды "защищены" от протеазы (например, Гольджи просвет), то сигнал флуоресценции будет сохраняться.

Чтобы протеазы войти в клетку, но не входят внутриклеточные мембранные отделения холестерина связывания препарат дигитонин используется. Холестерин является доминирующим стерин у позвоночных, и в частности, обогащенный плазматической мембраны относительно внутриклеточных компартментах. Гликозид токсин, дигитонин, добывается из растения наперстянки пурпурной. Дигитонинового имеет сродство к холестерина богатых мембран, к чему это приведет мембрану permeabiliztion ^14,16 (рис 1). В дополнение к возможности выхода мелких цитозольных компонентов, дигитонин пермеабилизации также позволяет запись экзогенных молекул, таких как протеиназы К или трипсином. Протокол FPP использует КВСт, что плазменная мембрана содержит до 80% клеточного холестерина ^17, в то время как другие органеллы, такие как ER, Гольджи, эндосомы, митохондрии, имеющие очень низкое содержание холестерина, остаются нетронутыми ^14. Селективное введение холестерина в плазматической мембране было отмечено во многих эукариотических клетках, позволяя использовать дигитониновым-зависимой проницаемости плазматической мембраны в таких разнообразных видов эукариот, как S. Cerevisiae человеческой ^14,18. FPP анализ обеспечивает простое, быстрое и довольно эффективные средства определения () является ли белок мембраной / Associated или свободно диффундируют в цитоплазме и (б) какой домен белка мембраны сталкивается с цитозоле или органелл просвет. Если белок мембраны имеют несколько ориентаций, сигнал будет возникать из доминантной формы и незначительные формы не будут обнаружены. В то время как может быть опасение, что добавление GFP фрагмента к белку на интерес, могут влиять на его функцию и/ Или субклеточном локализации, это на самом деле больше теоретический, чем фактическая. Действительно, многие исследования ясно показали, что GFP тегов не изменяет свойства белка ^19,20.

Протокол

1. Генерация и проверка флуоресцентный белок химерами

1. Добавление зеленый флуоресцентный белок (GFP) в амино- или карбоксильной концах интересующего белка с использованием стандартных рекомбинантных ДНК стратегии ^13.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Хотя мы использовали GFP широко, другие варианты, такие как голубой флуоресцентный белок (СФП), желтый флуоресцентный белок (YFP), DsRed и mCherry могут быть использованы. Улучшения в флюорофора складывающиеся эффективности, яркости и фотостабильностью постоянно вносятся, и следователи должны воспользоваться новейшими конструкциями поколения.
   1. Подтверждение правильности последовательности ДНК и гарантировать, что GFP фрагмент в рамке с белком, представляющего интерес. Выполните последовательность с использованием стандартных рекомбинантных стратегии ДНК ^21.
      Примечание: Многие организации имеют основные средства ДНК, которые следователь рекомендуется обращаться за дополнительной информацией.
   2. Для одинарных или двойных белков проход мембранных, генерироватьоба амино- и карбоксильные концевые варианты слитых белков ^19.
   3. Для мульти-охватывающей белков вставить GFP в пределах предполагаемых петель extramembrane, а также Термини. Обратите особое внимание при генерации трансмембранных химеры с флуоресцентным слитого белка, прикрепленного к амино-концу белка-мишени, как сигнальные последовательности часто расщеплен путем протеолиза когда белок прошел через ER транслокона.
   4. В случае существующих сигнальных последовательностей, вставки флуоресцентного слитого белка дистальнее сайта расщепления с тем, чтобы генерировать зрелый белок, содержащий интактный аминоконцевой тегами флуоресцентный белок. Используют стандартные стратегии рекомбинантных ДНК для генерации химер ^21.
2. Определить наличие достаточного соответствующим локализованного флуоресцентного сигнала в клеточной линии, представляющей интерес.
   1. Соблюдайте клеток под эпифлуоресцентной микроскопии с использованием собственного флуоресценции GFP под appropriели фильтра установить условия. Для GFP наборы фильтров, которые охватывают 510-560 нм, подтверждают, что правильные фильтры используются для флуорофора, используемого.
      ПРИМЕЧАНИЕ: достаточно сигнала достигается тогда, когда оценка на глаз обеспечивает достаточно сильный сигнал, что клеточная структура, в рамках которой сигнал находится легко решается выше фона. Кроме того окрашивание картина GFP-белка должны быть совместимы с тем из маркеров для соответствующего органеллы, и предпочтительно идентична нативной немеченого белка.
3. Определить, будет ли использована стабильную или транзиторную трансфекцию подход основан на белок оценивается.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Стабильный трансфектанты как правило, позволить себе более низкие уровни экспрессии, чем переходных систем. Хотя переходный выражение дает высокий уровень экспрессии белков и интенсивности увеличение сигнала (~ 5-24 часов после трансфекции в зависимости от белка), что также может привести к избыточной экспрессии артефактов, таких как белок Aggregation или насыщение белка ориентации путей, что приводит к ошибочному субклеточном локализации.

2. трансфекции клеток и клеточных культур

Примечание: выбор клеток поддаются анализу FPP, в том числе HEK293, HeLa, COS-7 и СНО клеток ^14. Нижеследующее описание основано на экспрессии мембранных белков в клетках НЕК293.

1. Выращивать человеческие эмбриональные клетки почки (HEK293) как адгезивных монослоев в 6 мл Дульбекко модифицированной Игла среде (DMEM), дополненной 5% фетальной бычьей сыворотки (FBS), 1% пирувата натрия и 250 мкг / мл пенициллина / стрептомицина при 37 ° С с 5% СО _2. Провести все работы, с клетками в ламинарного потока капот культуры ткани. растут клетки в культуральной среде до ~ 80% сливной в Т-75 колбу.
2. Трансфекции клеток с помощью любого стандартного высокой эффективностью, низким метод трансфекции токсичность, включая липидо-, viral- или электропорации на основе технологий для генерации transienт или стабильная экспрессия. Обычно 2 мкг плазмидной ДНК в 1 × 10 ⁶ клеток дает хорошую экспрессию белка воспроизводимое. Поддержание клеток для 5-48 ч в соответствующем среды культуры ткани при 37 ° С в СО _2, способный инкубаторе тканевых культур.
3. Монитор клеток для экспрессии GFP-белка, слитого с использованием эпифлуоресцентной микроскопии с использованием собственной флуоресценции сигнал GFP, с использованием соответствующих наборов фильтров в соответствии с протоколом производителя. Сигнал флуоресценции обычно достигает максимума в течение 24-72 ч после трансфекции. Использование клеток, когда сигнал флуоресценции достигает максимального уровня. Монитор уровни экспрессии белка иммуноблот-анализа с использованием антитела, направленные против либо белка, представляющего интерес, или GFP фрагмента.
4. Для анализа экспериментальных пластин клеток на покровных покрытием. Смотреть либо в конфигурации живых клеток или после фиксации и крепления на микроскопии слайдов. Пластина клеток для достижения 60% -80% слияния в течение 24-48 ч,
   1. Coat покровные с поли-лизина раствор (0,1 мг / мл), так, чтобы вся поверхность покрыта. Инкубировать в течение 30 мин под ультрафиолетовым светом при комнатной температуре, после чего 60 минут в инкубаторе для клеточных культур при 37 ° С. Удалите излишки поли-лизин и промойте покровные в PBS 3 раза.
   2. Кроме того, плиты ячейки на патрон крышки стекла, состоящей из клеточной культуры пластин с оптическим стеклянным дном, чтобы позволить прямой визуализации с целями масло-погружения в воду. Фактическое установки микроскопии зависит от доступного оборудования для исследователя, но должна быть способна быстрых изменений в растворе. В зависимости от типа клеток и клеток формы, клетки должна быть около 60-90% сливной во время анализа FPP.

3. флуоресцентной микроскопии Setup

1. Использование высокой числовой апертуры (NA) масла-иммерсионный объектив для максимального сбора сигнала и пространственным разрешением, например, 60X, 1,42 NA масла иммерсионный объектив. Используйте йе после лазеров для стимулирования флуорофоры: газ аргон 488 нм (GFP и YFP) и 561 диод (ППП, mCherry).
2. Определить оптимальную скорость экспозиции, усиления и захвата изображений для каждой конструкции. Отрегулируйте интенсивность лазера и время экспозиции, чтобы минимизировать фотообесцвечивания (см шаг 7.1.2).
3. Для исследований с использованием нескольких флуорофоры (например, водорастворимого маркера для мембранной проницаемости в концерте с маркерный белок мембраны), выберите соответствующий фильтр устанавливает свести к минимуму сигнала перекрестные помехи и максимально сигнал-шум.

4. Создание оптимальных условий для плазменной мембране пермеабилизирующего

1. Извлеките клеточной культуральной среды от клеток, экспрессирующих только растворимые флуоресцентные белки (например, EGFP, DsRed). Вымойте клетки 3 раза (1 мин каждый) в KHM буфера (110 мМ ацетата калия, 3 мМ MgCl _2, 20 мМ HEPES-NaOH, pH 7,2). Выполнение экспериментов с клетками и все реагенты при комнатной температуре.
2. Место клетки выводап покровные (см шаг 2,4) в KHM буфера на этапе флуоресцентный микроскоп и собирать первый образ, который представляет контроль »непермеабилизированных» стадии.
3. Для селективно проницаемыми плазматическую мембрану, добавить дигитонина (30 мкМ) в буфере KHM к клеткам. Заливать клетки с буфером (буфер + дигитонином) со скоростью 5 мл / мин в течение 10-60 сек.
4. Определение оптимальной концентрации дигитониновых постепенным увеличением концентрации дигитонином. Оптимальная дигитонин концентрация достигается, когда есть полная потеря сигнала флуоресценции от растворимого EGFP в течение 10-60 сек дигитонинового применения. В течение многих клетках применение 10-50 мкМ дигитонином достаточно проницаемыми клеточные мембраны.
   1. Для всех приложений использовать самую низкую возможную концентрацию дигитонина. Собирать изображения, после дигитонинового пермеабилизации для проницаемыми фонового сигнала.
5. Убедитесь, что GFP-белок химеры интерес мембранаtegrated, подтвердив сотовой сохранение сигнала флуоресценции после дигитонинового проницаемости мембраны плазмы ^16.
   1. Экспресс органеллы конкретных флуоресцентный белок ^23. Митохондриальных белков хорошо работать в этой связи ^16, например, pDsRed2-Mito вектора. Определить оптимальные условия экспрессии, как описано в шаге 2.1.
   2. Убедитесь, что дигитонин концентрация подходит для этого типа клеток, занятых счет того, что морфология внутриклеточных органелл остается постоянной в течение длительного (до 60 мин) воздействия дигитонинового.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте протоколы стандарт иммунофлюоресценции микроскопии с использованием антител против различных клеточных отсеках, такие как лизосомы (например, LAMP1), Гольджи (например, TGN38), эндоплазматическая сеть (например, калнексину), эндосомы (например, Rab5), митохондрии (например, цитохром в). Если изменения морфологии / целостности внутриклеточный органелл резко ОвеR 60 мин, вполне вероятно, что дигитонин концентрация была слишком высокой, и требуется снижение дигитониновым концентрации и / или времени экспозиции.
      ПРИМЕЧАНИЕ: дигитонинового является токсичным при вдыхании и попадании на кожу. Используйте соответствующие средства индивидуальной защиты (СИЗ).

5. протеазы Лечение флуоресцентных белков

1. Промыть клетки в KHM буфера, а затем добавить протеазу (протеиназы К; 50 мкг / мл в буфере KHM) непосредственно на клетки. Заливать клеток при скорости потока 5 мл / мин с использованием самотеком систему перфузии непрерывно бане подготовку.
   1. Хранить растворы в 50 мл шприцев и полиэтиленовых труб связано независимых резервуаров к коллектору с одной выходом на ванну (скорость 5 мл / мин поток). Установите всасывающий пипетки для поддержания постоянной (0,5 мл) объема ванны и добиться обмена решение вручную переключаться между перфузии водоемов.
2. Собирать изображения, чтобы определить, является ли фтораescent сигнал сохраняется или ухудшается. Потеря> 90% от начальной интенсивности сигнала в течение 30-60 сек соответствует протеолитической деградации в GFP-белка химеры (см Репрезентативные результаты).
3. Если никакой деградации сигнала не наблюдается с протеиназы К, когда такие потери Ожидается, замените протеиназы К решение с трипсином (4-8 мм), KHM буфера. При необходимости использовать смеси протеиназы К и трипсин. Там нет необходимости, чтобы утолить активность протеаз.

6. Альтернативный подход для белков плазматической мембраны с внешних доменов

1. Для плазменных мембранных белков, проведение анализов для внешних белков люминесцентные химер предшествующих дигитонинового пермеабилизации. Промыть клеток на покровных стеклах в KHM буфера (5 мл / мин х 3 мин), и принимают изображение для предварительного протеазы лечения и количественно предварительно протеазы сигнала флуоресценции, как на стадии 7.
2. Защиту клетки протеазы (протеиназы К; 50 мкг / мл трипсина или 4-8 мм в буфере KHM) в тОн отсутствие дигитонином путем перфузии клетки с KHM средах, содержащих протеазы (скорости потока 5 мл / мин). Собирают изображения флуоресцентного белка, чтобы определить, как быстро сигнал исчезает или как долго сигнал сохраняется.
3. Перед дигитониновым проницаемости, погасить все протеазной активностью, путем промывки клеток в три раза (1 мин каждый) в среде для культивирования клеток, содержащей 10% сыворотки (FBS).
4. Промыть клеток путем перфузии с KHM буфера (скорость потока 5 мл / мин) в течение 2 мин. Приобретать предварительно пермеабилизирующего изображение. Проницаемыми клеточные мембраны, как описано в пункте 4.
5. Собирать изображения, следующие протеазы того, как описано в шаге 5.

Анализ 7. Изображение

1. Используйте инвертированный микроскоп, способный "живая клетка" записи, в которых потеря сигнала флуоресценции можно наблюдать в режиме реального времени. Для непрерывного мониторинга, использовать одинаковые параметры (время экспозиции, усиление, интенсивности лазерного излучения и т.д.).
   1. Определить Experментальные параметры, наблюдая сигнал флуоресценции от GFP-белка процентов в условиях контроля (например, СТК буфер в одиночку). Отрегулируйте усиление, интенсивности и экспозиции лазерного настройки на компьютере приводом микроскопа время, чтобы убедиться, что нет никакой заметной потери интенсивности сигнала в течение 10-20 мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: интенсивность сигнала не абсолютное значение, но на основе системы микроскопа и настройки, доступные каждому PI. Мониторинг изменений в относительной интенсивности флуоресценции.
2. Кроме того, лечить клетки при заданных временных точках в дигитонина последующим протеазы, и исправить клеток перед монтажом на покровных для визуализации. Определите моменты времени эмпирически следующие процедуры шагов 4 и 5. Для первоначального расследования, начинаются с 0, 30, 60, 120 и 300 сек после того дигитонинового или протеазы.
   1. Закрепить клетки (20 мин при комнатной температуре) с использованием достаточного количества фиксатора (3,7% параформальдегида в PBS), чтобы полностью погрузить тысе клетки.
   2. Гасят остаточного параформальдегида путем промывки клеток ФБР, содержащим 20 мМ глицина (3 х 5 мин).
   3. Mount покровные путем удаления избытка жидкости из покровного и обращая покровное на 50 мкл монтажных СМИ на предметные стекла микроскопа для работы с изображениями. Разрешить слайды высохнуть в течение ночи перед визуализации.
3. Сбор флуоресцентной микроскопии изображений (при соответствующих фильтров, совместимых с флюорофор используется), используя функцию захвата видео изображение на компьютере под контролем флуоресцентного микроскопа.
4. Количественная флуоресцентные интенсивности сигнала как функции условия инкубации. Получить средняя интенсивность пикселя в пределах области интереса (ROI), который охватывает отдельную ячейку.

Результаты

Плазматической мембраны пермеабилизирующего

Эффективное плазматической мембраны пермеабилизации определяется с использованием растворимых флуоресцирующих белков (например, GFP, DsRed) (этап 4). Эти белки, когда экспрессируется в клетках, могут свободно диффундируют в цитоплазме, и теряются, когда плазма мембраны проницаемыми с помощью дигитонин (рисунок 2). Полное исчезновение флуоресцентного сигнала должно происходить в течение 10-60 сек дигитонинового при...

Обсуждение

Правильной ориентации и топологии мембранных белков имеет важное значение для их нормальной работы. Несмотря на важность понимания топологии белка мембраны, есть много белков, для которых эти данные полностью отсутствуют. ФПП обеспечивает простой и эффективный способ определения топологию белка мембраны, и тот, который может быть выполнен в большинстве лабораторий. Подход ФПП дает значительные преимущества по сравнению с предыдущими методами для определения топологию белка. Например, нет необходимости иметь панель из не...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Дигитонин	Calbiochem	300410
Протеиназа K Sigma		P2308
Трипсин	Sigma	T3924
Cav1-GFP	Addgene	44433
pAcGFP-1 Golgi	Clontech	632464
полилизин	Sigma	P4707
Монтажный носитель	Dako	цС704