Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Хитозан / интерферирующих РНК наночастиц опосредованного молчания генов в развитии болезни Векторный личинки комаров

14K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/52523

⸱

25 марта 2015 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Biology, Kansas State University, 2Department of Medical and Molecular Genetics, Indiana University School of Medicine, 3Eck Institute for Global Health, University of Notre Dame, 4Department of Biological Sciences, University of Notre Dame, 5Department of Entomology, Kansas State University

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Здесь мы описываем процедуру для ингибирования функции генов в вектор болезнь комаров посредством использования хитозана / интерферирующих РНК наночастиц, которые проглатывании личинками.

Аннотация

Комарами-переносчиками нанести больший человеческие страдания, чем любой другой организм, - и убивают более одного миллиона человек каждый год. Комар генома проекты способствовали развитию исследований в новых гранях комаров биологии, в том числе функциональных генетических исследований на первичном африканского вектора малярии Anopheles gambiae и денге и желтая вектора лихорадка Комар желтолихорадочный. РНК РАДИОПОМЕХ (RNAi-) опосредованного молчание генов была использована для генов-мишеней, представляющих интерес в обоих этих переносчиков болезней видов комаров. Здесь мы опишем процедуру подготовки хитозана / интерферирующих РНК наночастиц, которые в сочетании с пищей и попадает в организм личинок. Это технически прост, высокая пропускная способность и относительно недорогой методики, который совместим с длинной двухцепочечной РНК (дцРНК) или малых интерферирующих РНК (киРНК) молекул, была использована для успешного нокдауна ряда различных генов в A. gambiae и А. AegyptiЛичинки. После личинок кормления, нокдаун, который проверяется с помощью Qrt-PCR или гибридизация, могут сохраняться по крайней мере до конца стадии куколки. Эта методика может быть применимо к широкому разнообразию комаров и других видов насекомых, в том числе вредителей сельского хозяйства, а также других не-модельных организмов. В дополнение к его полезности в научно-исследовательской лаборатории, в будущем, хитозан, недорогой, нетоксичного и биоразлагаемого полимера, потенциально может быть использована в поле.

Введение

Кровь векторные кормления комаров родов малярийного и Aedine передачи болезнетворных агентов, ответственных за некоторые из худших бедствий человечества. По оценкам, 3,4 млрд человек находятся под угрозой заражения малярией, которая отвечает за более половины миллиона случаев смерти в год по всему миру. Результаты борьбы с малярией от инфекции Plasmodium Sp. Паразиты, которые передаются людям через укусы инфицированных комаров рода Anopheles, в том числе основной африканского вектора Anopheles gambiae ( http://www.who.int/topics/malaria/en/ , 2014) 1. Комар желтолихорадочный является основным вектором комаров для вируса денге, которая вызывает лихорадку денге, неспецифический лихорадочного заболевания, которое наиболее широко распространенным и значимым arboviral заболеванием в мире. Вирус денге в настоящее время угроза> 2,5 миллиарда человек в тропиках, с годовой incidenCE примерно 50 миллионов случаев, в результате ~ 24000 смертей в год ( http://www.cdc.gov/dengue/ , 2014) 2. Несмотря на разрушительное глобальное воздействие комарами заболеваний на здоровье человека, эффективные средства профилактики и лечения этих заболеваний не хватает. Борьба с комарами в настоящее время лучший способ профилактики заболеваний.

Потенциал для борьбы с членистоногими заболеваний, передающихся от генетического манипулирования векторных насекомых была признана на протяжении более четырех десятилетий 3. Трансгенные штаммы A. Aegypti инженерии, чтобы иметь репрессируемый женский конкретных фенотип нелетающих недавно сделали потенциал для использования трансгенных стратегий борьбы с переносчиками реальность 4-6. Эти достижения были оспорены исследователям в выявлении новых генетических задач по борьбе с переносчиками и дополнительных средств манипулирования функции гена в вектор комаров. Изменение экспрессии генов Dразвитие тором, как это было в случае с женщинами нелетающих комаров 4, может способствовать выяснению новых стратегий по борьбе с переносчиками. Тем не менее, в значительной степени из-за технических проблем, функции немногих генов, были охарактеризованы в процессе развития А. gambiae, А. Aegypti, или другие виды комаров.

С момента своего открытия в С. Elegans 7, РНК-интерференция (RNAi), которая сохраняется у животных, растений и микроорганизмов, широко используется для функциональных генетических исследований в самых разнообразных организмов, в том числе насекомых 8,9. РНК-интерференция путь инициируется Dicer, который расщепляет долгое дсРНК в короткие 20-25 нуклеотидных длиной миРНК, которые функционируют как последовательности конкретных интерферирующих РНК. siРНК, гены тишина, которые дополняют друг друга в последовательности, способствующие ускорению транскриптов, декольте, и нарушение перевод 9. Длинные молекулы дцРНК (обычно 300-600 б.п.) или пользовательские миРНК, направленные на particulaг последовательность может быть использована в научно-исследовательской лаборатории по глушителей любой интересующий ген. Управляя когда интерферирующих РНК доставлен, исследователи могут контролировать время, в которое ген глушителей посвященных. Это преимущество полезен, поскольку он может быть использован для преодоления проблем, таких как летальность развития или бесплодие, которые могут препятствовать производство и техническое обслуживание штаммов, несущих наследственные мутации, дорогой и трудоемкий процесс, который пока не имеется у всех видов насекомых. Хотя степень молчания генов путем РНК-интерференции может варьироваться от гена с геном, ткани к ткани, и животного к животному, RNAi широко используется для функционального анализа генов в комаров и других насекомых 8,9.

Три препятствующие стратегии доставки РНК были использованы в комаров: микроинъекции, впитывая / местного применения и приема внутрь. Для подробной истории и сравнения с использованием этих трех методов в насекомых, пожалуйста, обратитесь к Ю. и др 8. Wе успешно использовали микроинъекции 10 в качестве средства доставки миРНК целевой гены развития в А. Aegypti эмбрионы, личинки, куколки, так и 11-14. Тем не менее, это трудоемкий стратегия доставка требует и настройки микроинъекции и искусной рукой. Кроме того, микроинъекции это стресс для организма, сбивающий фактор, особенно когда поведенческие фенотипы будут оценены. Наконец, поставка микроинъекции не может быть расширено до поля для борьбы с переносчиками. В качестве альтернативы, замачивания в организм интерферирующих РНК решение также стало популярным средством индукции молчание генов, как это удобно и не требует большого оборудования или труда. Замачивание уже в основном применяются в клеточной линии насекомых изучает 8, но в недавнем исследовании, нокдаун был достигнут в А. Aegypti личинки погружают в раствор дцРНК 15, который животные, казалось, глотания. Тем не менее, для исследований, анализ нескольких experimentaл группы или фенотипы, замачивание, а дорого. Лопес-Мартинес и др. 16 описано регидратации приводом RNAi, новый подход к вмешательства доставку РНК, которая включает обезвоживание в солевом растворе и регидратации с одной капли воды, содержащей интерферирующих РНК. Такой подход не сократить затраты, связанные с целого животного погружения, но дороже, чем микроинъекции и может быть ограничено в своем применении к видам, которые могут выдерживать высокие осмотические давления. Кроме того, трудно представить себе, как погружение, или дегидратации / регидратации методики погружения может быть приспособлен для борьбы с переносчиками в этой области. По этим причинам, для пост-эмбриональных исследований, доставка интерферирующих РНК с проглоченной пищи жизнеспособной альтернативой стратегии.

Хотя стратегии приеме внутрь на основе не работать во всех видов насекомых, пожалуй, самое частности дрозофилы, оральный доставка интерферирующих РНК, смешанный с пищей способствовало гена сиlencing в различных насекомых 8,17, в том числе А. Aegypti взрослых 18. Мы описали хитозана наночастиц опосредованного RNAi в А. gambiae личинки 19 и успешно применил этот подход к снижению экспрессии генов в A. Aegypti личинки 20,21. Здесь методика этой процедуры RNAi, который включает в себя улавливания из интерферирующих РНК в полимерной хитозана, подробно. Хитозан / помехи наночастицы РНК образуются путем самосборки поликатионов с интерферирующих РНК с помощью электростатических сил между положительными зарядами аминогрупп в хитозана и отрицательных зарядов, переносимых фосфатных групп от основной цепи интерферирующих РНК 19. Процедура, описанная совместим с длинных молекул дцРНК (далее именуемые дсРНК) или двухцепочечной Серна (далее по тексту миРНК). После синтеза хитозан / помехи наночастицы РНК смешивали с пищей личинок и доставленЛичинки при приеме внутрь. Эта методика является относительно недорогим, не требует большого труда и оборудование 19, и способствует высокой пропускной анализ нескольких фенотипов, в том числе анализа поведения 20,21. Эта методика, которая может быть адаптирована для молчания генов исследований в других насекомых, в том числе других переносчиков болезней и насекомых вредителей сельского хозяйства, потенциально могут быть использованы для молчания генов в различных других видов животных. Кроме того, хитозан, недорогой, нетоксичный и биоразлагаемый полимер 22, потенциально могут быть использованы в области для конкретных видов борьбы с комарами.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Москит Виды и разведение

  1. Поддержание А. gambiae G3 и А. штаммы Aegypti Ливерпуль IB12 (используется в представительных исследований ниже) или другие штаммы проценты в соответствии со стандартной практикой лаборатории или как описано ранее 23,24.

2. дцРНК и миРНК Проектирование и производство

  1. Дизайн праймеров для построения длинных шаблонов дцРНК, специфичные для представляющего интерес гена. Используйте инструмент E-RNAi 25. Производят дцРНК в соответствии со способом выбора или как описано ранее 19.
    1. Для отрицательного контроля, синтезируют дцРНК 19, соответствующий последовательности зеленого флуоресцентного белка (GFP), β-галактозидазы (β-гал), или какой-либо другой ген не экспрессируется в комаров. Если это желательно, дцРНК 19 используется для генерации репрезентативные результаты, представленные ниже, могут быть использованы в качестве положительного контроля. Магазин дсРНК растворяли в РНКазы без воды при температуре -80 °; С до необходимости.
  2. Кроме того, конструкция гена конкретных миРНК соответствии со стандартной практикой лаборатории или, как описано ранее 10. Scramble последовательность бросовой миРНК для разработки негативное Серна управления, не соответствует ни гена комаров. Купите специальные миРНК, которые доступны через ряд авторитетных поставщиков.
    1. Если это желательно, siРНК, 20,21, используемых для получения репрезентативные результаты, представленные ниже, могут быть использованы в качестве положительных контролей. Магазин миРНК растворяли в РНКазы свободной воды при -80 ° С до использования.

3. Подготовка Хитозан / интерферирующих РНК наночастиц

  1. Собирают предварительно сделанный RT 100 мМ сульфата натрия (100 мМ Na 2 SO 4 в деионизированной H 2 O) и 0,1 М ацетата натрия (0,1 М NAC 2 H 3 O 2, -0,1 М уксусной кислоты, рН 4,5 в деионизированной H 2 O) буферы.
  2. Растворите хитозан (≥75%деацетилированный) в 0,1 М буфере ацетата натрия, чтобы сделать 0,02% (вес / объем) рабочего раствора и держать раствор при комнатной температуре перед использованием.
  3. Растворите дсРНК или Серна в 50 мкл деионизированной H 2 O и добавить его в 100 мМ сульфата натрия буфера, чтобы сделать 100 мкл раствора 32 мкг дсРНК / миРНК в 100 мкл 50 мМ сульфата натрия.
  4. Добавить 100 мкл раствора хитозана в растворе дцРНК / миРНК, а затем нагревать смесь на водяной бане при 55 ° С в течение 1 мин. Настройка контроль, добавляя 100 мкл 50 мМ сульфата натрия до 100 мкл раствора хитозана и выполните ту же процедуру.
  5. Сразу Смешайте решения в течение 30 сек по высокоскоростным встряхиванием при комнатной температуре, чтобы способствовать формированию наночастиц.
  6. Центрифуга смеси при 13000 х г в течение 10 мин при комнатной температуре, после чего осадок должен быть виден. Передача супернатант в новую пробирку 1,5 мл. Высушите гранул для ≈10 мин при комнатной температуре перед использованием, чтобы подготовить комаров пищу.
  7. Measure концентрацию дсРНК / миРНК в надосадочной жидкости с использованием супернатанта из-под контроля (см 3.5), как пустым, чтобы рассчитать общее количество дсРНК / миРНК, которые остались в надосадочной жидкости. Использование разницу между количествами исходных дцРНК / миРНК и остающихся в надосадочной жидкости, чтобы вычислить процент дцРНК / миРНК захваченный в наночастицах количествах. Эта эффективность загрузки, как правило, более 90%.
  8. Повторите ту же процедуру, если больше наночастицы необходимости. Сразу же использовать сушеные наночастиц. Воздействие холодного хранения частиц до использования не была оценена.

4. Подготовка Москитная пищевые продукты, содержащие хитозан / интерферирующих РНК наночастиц

  1. Подготовка 1 мл 2% раствора агарозы (вес / объем) в деионизированной воде, расплавить агарозу, и держать расплавленного раствора агарозы в 55 ° С на водяной бане в перед использованием.
  2. Смешайте пищевые хлопья рыбы (47% сырого протеина, мин. Сырой жир 10%, макс. Сырой клетчатки 3%) и сухих дрожжей вСоотношение 2: 1 (вес / вес). Измельчите смесь до мелких частиц с помощью ступки и пестика (проходимой через N 50 США стандартной тестовой сито). Используйте заземляющий пищу, которая должна быть коричневого цвета, либо сразу, либо хранить его в плотно закрытой таре при 4 ° С в течение нескольких недель.
  3. В 1,5 мл пробирку, перемешать 6 мг первом пищи с высушенными наночастиц из раздела 3.7 с помощью зубочистки.
  4. Добавить 30 мкл 2% до расплавленного агарозном геле решения пищевой наночастиц смеси; перемешать немедленно и тщательно с помощью зубочистки или пипетки чаевые.
  5. Используйте гель, содержащий продукты питания и наночастицы сразу же кормить личинок комаров. Кроме того, после того, как гель полностью затвердевает при комнатной температуре, хранить гель при 4 ° С и используют на следующий день, или при -80 ° С для последующего использования.

5. Кормление личинок комаров с пищей, содержащей хитозан / интерферирующих РНК наночастиц

  1. Кормление А. gambiae личинки комаров:
    1. Снимите сиngle гель осадок от 1,5 мл трубки с помощью зубочистки и нарезать его на 6 равных кусочков, используя чистую лезвие бритвы или зубной выбор.
    2. Передача 20 третий возрастной стадии личинки в 500 мл чашку Петри, содержащую 100 мл деионизированной воды.
    3. Поток личинки комаров, добавив один кусочек геля гранулы (мелко нарезанный на мелкие кусочки) на чашку Петри один раз в день в течение четырех дней. Обязательно соблюдайте личинки, питающиеся гранулы, которые должны быть значительно уменьшены в размерах или полностью отсутствующего на следующий день. По истечении времени, комары будут развиваться в конце четвертого личинок возрастной стадии.
    4. Запишите каких-либо видимых фенотипических изменений во время эксперимента. Изучить уровни транскриптов и другие фенотипические изменения, как описано в разделе 6 в конце четыре дневного периода.
  2. Кормление А. Aegypti личинки комаров:
    1. Отрежьте гель осадок на 6 равных кусочков, используя чистую лезвие бритвы или зубочистку.
    2. Поместите 50 возрастных синхронизированы 24 часа после яйца инкубационные Fiсначала личинки младших возрастов в чашку Петри в ≈40 мл деионизованной воды.
    3. Личинки один кусочек на чашку Петри в течение 4 часов / день, а затем перенести личинок обратно на обычный личинок рационе 2: 1 Площадь корма для рыб хлопья и сухие дрожжи для остальной части дня. Повторите процедуру ежедневно в течение четырех личиночных возрастов.
    4. Проверьте уровень транскриптов и других фенотипические изменения, как описано в разделе 6 в желаемых развития временных точках.

6. Подтверждение Нокдаун гена

  1. Относительная стенограмма количественного определения Qrt-ПЦР в А. Aegypti и А. gambiae личинки.
    1. Выполнение и анализ Qrt-ПЦР с тремя биологических повторностей по меньшей мере, 10 объединенного контроля против экспериментального личинок, как описано 11,19,20, или в соответствии со стандартной процедурой лабораторной. Представитель результаты приведены ниже.
    2. Для анализа части особый тип ткани / тела (т.е.., Головного мозга или антенны), PERFORM Qrt-ПЦР, как описано в 6.1.1 следующего рассечения восстановить интересующей ткани (например, см Майсур и др. 21).
  2. Подтверждение нокдаун в гибридизация
    1. Синтезируют дигоксигенин-меченого антисмысловых управления рибозонды соответствии со стандартной практикой лаборатории или 26, как описано.
    2. Выполнить в гибридизация в протоколе Хауген и др. 27 для подтверждения парализующим, как описано выше 11,20 и обсуждаются в разделе ниже репрезентативные результаты.
  3. Подтверждение нокдаун иммуногистохимии
    1. Если антитела против белкового продукта гена целевого имеются, выполняют иммуногистохимии, как описано ранее 28, что облегчает идентификацию особей с самых больших уровней нокдауна для анализа фенотипа 20 в качестве примера в representatiве результатов разделе ниже.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

А. gambiae:

Наночастицы хитозана / дцРНК формируются за счет электростатического взаимодействия между аминогруппами хитозана и фосфатными группами дсРНК. Эффективность дцРНК включения в наночастиц, как правило, выше 90%, как измерено с истощением дцРНК из раствора. Силовой микроскопии изображений с атомным показывают, что хитозан-дцРНК в среднем размер частиц 140 нм в диаметре, от 100-200 нм (рис 1).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Хитозан / вмешательства РНК методики описаны здесь в виде наночастиц был использован эффективно генов-мишеней при развитие личинок в А. gambiae (рис 2, 3) и А. Aegypti (рис 4, 5, 6, Столы 1, 2). Хитозан наночастицы могут быть получены либо с длинной дцРНК или миРНК, оба из которых были успешно использованы в комаров, о чем свидетельствуют представительных результатов, описанных здесь. Синтез дсРНК дешевле, чем при покупке Серна, но более трудоемкий. Если хитозан / миРН...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Финансирование от Канзасской сельскохозяйственной экспериментальной станции и Центра геномики членистоногих K-State для KYZ поддержало оригинальную разработку хитозан/дцРНК-опосредованного сайленсинга гена у A. gambiae19. Описанная здесь работа над A. gambiae была частично поддержана R01-AI095842 от NIH/NIAID до KM. Разработка хитозан/siRNA-опосредованного сайленсинга гена у A. aegypti20,21 была поддержана премией NIH/NIAID R01-AI081795 MDS. Содержание данного исследования является исключительной ответственностью авторов и не обязательно отражает официальную точку зрения NIH.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
0,02 мл пипеттманRaininPR20для ресуспендирования интерферирующей РНК
0,2 мл пипеттманRaininPR200для ресуспендирования интерферирующей РНК и получения интерферирующих РНК/наночастиц
0,5 мл градуированная пробирка Fischer Scientific05-408-120для аликвотирования ресуспендированной интерферирующей РНК
пипеттман 1 мл пипеттманRaininPR1000для ресуспендирования интерферирующей РНК и получения интерферирующих РНК/наночастиц
1,5 мл градуированная пробирка Fischer Scientific05-408-046для получения интерферирующей РНК/наночастиц
1М ацетата натрия, pH 4,5TEKnovaS0299для получения буфера ацетата натрия
Уксусная кислота, AIRSTAR. ACS, USP, FCC GradeBDHVWR BDH3092-500MLPдля приготовления буфера из ацетата натрия
Agarose Genetic Technology GradeMP Biomedicals LLC.800668для покрытия подготовленной интерферирующей РНК/наночастиц
центрифугиEppendorf AG5415Dдля гранулирования интерферирующей РНК/наночастиц
Хитозан, из панцирей креветокSigma-AldrichC3646-25Gдля объединения с интерферирующей РНК для приготовления интерферирующих РНК/наночастиц
Dry YeastUniversal Food CorpNAдля приготовления корма для личинок комаров с интерферирующей РНК/ инструмент
наночастиц E-RNAi Немецкийцентр исследования ракаNAдля разработки дцРНК; http://www.dkfz.de/signaling/e-rnai3//
для золотых рыбокWardleyGoldfish FLAKE FOODдля приготовления корма для личинок комаров с интерферирующими РНК/наночастицами
Нагреваемая водяная баняThermo Scientific51221048для нагрева мешающих РНК/наночастиц при температуре 55oC
Леднеприменим не применимдля размораживания интерферирующей РНК и получения интерферирующей РНК/наночастиц
[header]
Ведро для льдаFisher Scientific02-591-44для хранения льда используется во время процедуры
печеньпорошок MP Biomedicals LLC.900396для кормления личинок комаров после интерференционной обработки РНК/наночастицами
Микроволновая печьРазличные поставщикине применимыдля приготовления 2% раствора агарозы
петридиш (100 х 15 мм)875713Фишера Интерферная камера подачи РНК/наночастиц для личинок
pH-метрMettler ToledoS220для приготовления буферов
Лезвие бритвыFischer Scientific12-640для разделения интерферирующей РНК/гранулы наночастиц для питания
миРНКThermo Scientific/Dharmaconcustomдля получения миРНК/наночастиц
Сульфат натрия, безводный (Na2SO4)BDH/распространяемый VWRVWR BDH0302-500Gдля приготовления 50 мМ раствора сульфата натрия, в котором интерферирующая РНК будет находиться ресуспензионный
термометрVWR61066-046для измерения температуры водяной бани
ЗубочисткиVWR470146-908для перемешивания во время мешающих РНК/наночастиц приготовления пищи и резки гелевых гранул
Сверхнизкая морозильная камераРазличные поставщикине подходятдля хранения мешающих аликвот РНК и интерферирующих РНК/наночастиц при температуре -80oC
Вихревой смесительFischer Scientific02-216-108для приготовления хитозана/интерферирующей РНК
Weight paperFischer ScientificNC9798735для деления интерферирующей РНК/наночастиц для кормления
корм Научный

Ссылки

  1. Malaria. , World Health Organization. http://www.who.int/topics/malaria/en (2014).
  2. Dengue. , Malaria Centers for Disease Control and Prevention. http://www.cdc.gov/dengue/ (2014).
  3. Knipling, E. F., et al. Genetic control of insects of public health importance. Bulletin of the World Health Organization. 38 (3), 421-438 (1968).
  4. Fu, G., et al. Female-specific flightless phenotype for mosquito control. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (10), 4550-4554 (2010).
  5. Wise de Valdez, M. R., et al. Genetic elimination of dengue vector mosquitoes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (12), 4772-4775 (2011).
  6. Harris, A. F., et al. Successful suppression of a field mosquito population by sustained release of engineered male mosquitoes. Nature Biotechnology. 30 (9), 828-830 (2012).
  7. Fire, A., et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391 (6669), 806-811 (1998).
  8. Yu, N., et al. Delivery of dsRNA for RNAi in insects: an overview and future directions. Insect science. 20 (1), 4-14 (2013).
  9. Zhang, H., Li, H. C., Feasibility Miao, X. X. limitation and possible solutions of RNAi-based technology for insect pest control. Insect science. 20 (1), 15-30 (2013).
  10. Clemons, A., Haugen, M., Severson, D. W., Duman-Scheel, M. Functional analysis of genes in Aedes aegypti embryos. Cold Spring Harb Protoc. 2010 (10), (2010).
  11. Clemons, A., et al. siRNA-mediated gene targeting in Aedes aegypti embryos reveals that frazzled regulates vector mosquito CNS development. PLoS One. 6 (1), e16730(2011).
  12. Haugen, M., et al. Semaphorin-1a is required for Aedes aegypti embryonic nerve cord development. PLoS One. 6 (6), e21694(2011).
  13. Nguyen, C., et al. Functional genetic characterization of salivary gland development in Aedes aegypti. EvoDevo. 4 (1), 9(2013).
  14. Sarro, J., et al. Requirement for commissureless2 function during dipteran insect nerve cord development. Developmental dynamics: an official publication of the American Association of Anatomists. 242 (12), 1466-1477 (2013).
  15. Singh, A. D., Wong, S., Ryan, C. P., Whyard, S. Oral delivery of double-stranded RNA in larvae of the yellow fever mosquito, Aedes aegypti: implications for pest mosquito control. J Insect Sci. 13, 69(2013).
  16. Lopez-Martinez, G., Meuti, M., Denlinger, D. L. Rehydration driven RNAi: a novel approach for effectively delivering dsRNA to mosquito larvae. Journal of medical entomology. 49 (1), 215-218 (2012).
  17. Scott, J. G., et al. Towards the elements of successful insect RNAi. Journal of insect physiology. 59 (12), 1212-1221 (2013).
  18. Coy, M. R., et al. Gene silencing in adult Aedes aegypti mosquitoes through oral delivery of double-stranded RNA. J Appl Entomol. 136 (10), 741-748 (2012).
  19. Zhang, X., Zhang, J., Zhu, K. Y. Chitosan/double-stranded RNA nanoparticle-mediated RNA interference to silence chitin synthase genes through larval feeding in the African malaria mosquito (Anopheles gambiae). Insect molecular biology. 19 (5), 683-693 (2010).
  20. Mysore, K., Flannery, E. M., Tomchaney, M., Severson, D. W., Duman-Scheel, M. Disruption of Aedes aegypti olfactory system development through chitosan/siRNA nanoparticle targeting of semaphorin-1a. PLoS neglected tropical diseases. 7 (5), e2215(2013).
  21. Mysore, K., Andrews, E., Li, P., Duman-Scheel, M. Chitosan/siRNA nanoparticle targeting demonstrates a requirement for single-minded during larval and pupal olfactory system development of the vector mosquito Aedes aegypti. BMC developmental biology. 14 (1), 9(2014).
  22. Dass, C. R., Choong, P. F. Chitosan-mediated orally delivered nucleic acids: a gutful of gene therapy. Journal of drug targeting. 16 (4), 257-261 (2008).
  23. An, C., Budd, A., Kanost, M. R., Michel, K. Characterization of a regulatory unit that controls melanization and affects longevity of mosquitoes. Cellular and molecular life sciences : CMLS. 68 (11), 1929-1939 (2011).
  24. Clemons, A., Mori, A., Haugen, M., Severson, D. W., Duman-Scheel, M. Culturing and egg collection of Aedes aegypti. Cold Spring Harb Protoc. 2010 (10), (2010).
  25. Horn, T., Boutros, M. E-RNAi: a web application for the multi-species design of RNAi reagents--2010 update. Nucleic acids research. 38, W332-W339 (2010).
  26. Patel, N. H. Ch. 19. In situ hybridization to whole mount Drosophila embryos. A laboratory guide to RNA: Isolation, Analysis, and Synthesis. PA, K. rieg , Wiley-Liss. (1996).
  27. Haugen, M., et al. Whole-mount in situ hybridization for analysis of gene expression during Aedes aegypti development. 2010 (10), Cold Spring Harb Protoc. (2010).
  28. Clemons, A., Flannery, E., Kast, K., Severson, D. W., Duman-Scheel, M. Immunohistochemical analysis of protein expression during Aedes aegypti development. Cold Spring Harb Protoc. 2010 (10), (1101).
  29. Rund, S. S., Hou, T. Y., Ward, S. M., Collins, F. H., Duffield, G. E. Genome-wide profiling of diel and circadian gene expression in the malaria vector Anopheles gambiae. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (32), E421-E430 (2011).
  30. Gaj, T., Gersbach, C. A., Barbas, C. F. 3rd ZFN, TALEN, CRISPR/Cas-based methods for genome engineering. Trends in biotechnology. 31 (7), 397-405 (2013).
  31. Aryan, A., Myles, K. M., Adelman, Z. N. Targeted genome editing in Aedes aegypti using TALENs. Methods. 69 (1), 38-45 (2014).
  32. Sarathi, M., Simon, M. C., Venkatesan, C., Hameed, A. S. Oral administration of bacterially expressed VP28dsRNA to protect Penaeus monodon from white spot syndrome virus. Mar Biotechnol (NY). 10 (3), 242-249 (2008).
  33. He, B., et al. Fluorescent nanoparticle delivered dsRNA toward genetic control of insect pests). Adv Mater. 25 (33), 4580-4584 (2013).
  34. Giljohann, D. A., Seferos, D. S., Prigodich, A. E., Patel, P. C., Mirkin, C. A. Gene regulation with polyvalent siRNA-nanoparticle conjugates. Journal of the American Chemical Society. 131 (6), 2072-2073 (2009).
  35. Davis, M. E., et al. Evidence of RNAi in humans from systemically administered siRNA via targeted nanoparticles. Nature. 464 (7921), 1067-1070 (2010).
  36. Molinaro, R., et al. Polyethylenimine and chitosan carriers for the delivery of RNA interference effectors. Expert opinion on drug delivery. 10 (12), 1653-1668 (2013).
  37. Singha, K., et al. Polymers in small-interfering RNA delivery. Nucleic acid therapeutics. 21 (3), 133-148 (2011).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

qRT PCRin situAedes aegyptiAnopheles gambiae
Хитозан / интерферирующих РНК наночастиц опосредованного молчания генов в развитии болезни Векторный личинки комаров
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.