Использование флуоресцентной активированной сортировки клеток для изучения тип-специфической для клеток экспрессии генов в тканях мозга крыс

Summary

Целью этого протокола является использование метода сортировки флуоресцентно активированных клеток (FACS) для сортировки конкретных типов нервных клеток для последующего анализа экспрессии генов, специфичных для конкретного типа клеток, эпигенетических маркеров и/или экспрессии белков.

Abstract

Мозг состоит из четырех основных типов клеток, включая нейроны, астроциты, микроглию и олигодендроциты. Несмотря на то, что нейроны не являются самым распространенным типом клеток в мозге, они являются наиболее широко изученными из этих типов клеток, учитывая их прямую роль в влиянии на поведение. Другие типы клеток в мозге также влияют на функцию и поведение нейронов через сигнальные молекулы, которые они производят. Нейробиологи должны понимать взаимодействия между типами клеток в мозге, чтобы лучше понять, как эти взаимодействия влияют на нейронные функции и заболевания. На сегодняшний день наиболее распространенным методом анализа экспрессии белка или гена является гомогенизация образцов целой ткани, обычно с кровью, и без учета типа клеток. Этот подход представляет собой информативный подход к изучению общих изменений в экспрессии генов или белков, которые могут влиять на нейронные функции и поведение; Тем не менее, этот метод анализа не способствует более глубокому пониманию экспрессии генов, специфичных для каждого типа клеток, и влияния межклеточной коммуникации на нейронные функции. Анализ поведенческой эпигенетики является областью растущего внимания, в которой изучается, как модификации структуры дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) влияют на долгосрочную экспрессию и поведение генов; Тем не менее, эта информация может быть релевантной только в том случае, если она анализируется специфичным для каждого типа клеток образом, учитывая дифференциальную линию и, следовательно, эпигенетические маркеры, которые могут присутствовать на определенных генах отдельных типов нервных клеток. Описанный ниже метод сортировки флуоресцентных активированных клеток (FACS) обеспечивает простой и эффективный способ выделения отдельных нервных клеток для последующего анализа экспрессии генов, экспрессии белков или эпигенетических модификаций ДНК. Этот метод также может быть модифицирован для выделения более специфичных типов нервных клеток в мозге для последующего анализа, специфичного для каждого типа.

Introduction

Целью описанного ниже протокола является выделение отдельных типов клеток из гетерогенной популяции нервной ткани для последующего анализа экспрессии генов, специфичных для конкретного типа клеток, экспрессии белка или даже эпигенетических маркеров. Мозг состоит из многих типов клеток, которые происходят от различных клеток-предшественников и обладают свойствами и функциями, специфичными для каждого типа. Несмотря на эти различия, эти различные типы нервных клеток могут экспрессировать сходные рецепторы и внутриклеточные сигнальные молекулы, что затрудняет анализ этих более распространенных белков для измерения или интерпретации с помощью традиционных методов. Нейробиологи должны определить функцию и активацию этих различных типов клеток в мозге, а также то, как они могут индивидуально влиять на поведение, поскольку в конечном итоге это станет первым шагом к определению более специфических лекарств и терапевтических мишеней для неврологических и нейропсихиатрических заболеваний. Несмотря на эту всеобъемлющую цель исследований в области нейробиологии, может быть трудно выделить отдельные типы нейронных клеток из мозга для анализа экспрессии генов или белков, активации сигнальных молекул или модификации эпигенетических маркеров на ДНК. Из методов, которые используются в настоящее время, иммуногистохимия может идентифицировать экспрессию белков специфичным для клеточного типа образом в сочетании с дополнительным окрашиванием маркера, специфичного для клеточного типа, хотя это зависит от специфических антител, которые могут правильно окрашивать интересующие белки, и это может быть трудно количественно определить. Гибридизация in situ может идентифицировать специфическую локализацию матричной рибонуклеиновой кислоты (мРНК) в отдельных клетках мозга, но это трудоемкий процесс, который также ограничивает совместный анализ конкретных типов клеток и позволяет анализировать только один или, возможно, несколько генов, представляющих интерес. Микродиссекция лазерного захвата использует лазер для выделения субпопуляций клеток, которые визуализируются с помощью микроскопии; однако трудоемкий характер этого процесса и относительно низкий выход могут значительно ограничить последующий анализ уровней белков или мРНК, особенно если экспрессия этих молекул изначально низкая. Флуоресцентная сортировка активированных клеток (FACS) является относительно новым методом в области нейробиологии для выделения отдельных типов клеток из мозга для последующего анализа экспрессии генов¹ и/или эпигенетических мишеней². Этот процесс также может быть использован для сортировки конкретных типов нервных клеток для последующего анализа экспрессии генов, специфичных для конкретного типа клеток, экспрессии белков или эпигенетических маркеров. FACS используется в ряде областей медицинских исследований, таких как рак и иммунология, на протяжении десятилетий для подсчета и сортировки различных клеток на основе физических или биохимических^{характеристик.} Кроме того, проточная цитометрия классически используется для анализа экспрессии белка на клеточной основе с использованием специфических антител. Описанная ниже процедура использует преимущества классических методов проточной цитометрии для выделения отдельных типов клеток для последующего анализа конечных точек молекулярной биологии. Проточный цитометр может анализировать несколько тысяч клеток в секунду, что делает его быстрой и эффективной альтернативой описанным выше методикам. Кроме того, клетки могут быть выделены на основе клеточной экспрессии определенного белка (например, рецептора нейротрансмиттера) или комбинации двух или более белков (колокализация нескольких белков в определенном типе клеток). Это позволяет пользователю изолировать очень селективные типы нервных клеток на основе их молекулярных свойств, чтобы идентифицировать их функцию в мозге.

Для выполнения FACS, нейронные клетки преобразуются в одноклеточную суспензию, которая пропускается через проточную ячейку, которая переносит и выравнивает клетки так, что они проходят одним файлом через световой луч и лазеры для анализа. Компьютер получает данные из каждой ячейки и наносит их на гистограмму для анализа заданных параметров (размера, зернистости и флуоресценции). На основе этих параметров клетки могут быть немедленно отсортированы в отдельные пробирки для их запоминания и последующего анализа любой желаемой конечной точки. В описанном ниже протоколе используются три антитела для сортировки нейронов (с использованием антигена тимоцитов 1, антитела Thy1), астроцитов (с использованием глиального транспортера глутамата, антитела GLT1) и микроглии (с использованием кластера дифференцировочной молекулы 11B, антитела CD11b). Этот протокол может быть использован, как описано ниже, или модифицирован с помощью различных антител в зависимости от типа клеток, которые человек хотел бы выделить для своих собственных экспериментов.

Есть несколько предостережений, которые следует учитывать при определении того, подходит ли этот протокол для конкретных экспериментов. Одно важное предостережение может касаться конкретного типа клеток, которые необходимо выделить. В этом протоколе используются три антитела, которые являются внеклеточными антителами, которые позволяют экспериментатору сохранить типы клеток нетронутыми во время процедуры окрашивания, тем самым сохраняя целостность РНК, ДНК и белков внутри. Вполне возможно, что кто-то может захотеть изолировать определенный тип нервных клеток с помощью антитела, которое идентифицирует белок, экспрессирующийся только внутри этой конкретной клетки. Например, может потребоваться изолировать дофаминергические нейроны с помощью антитела к тирозингидроксилазе или изолировать ацетилхолиновые нейроны с помощью антитела к холинацетилтрансферазе. Эти белки являются внутриклеточными и, таким образом, требуют фиксации и проникновения в клеточную мембрану для последующего окрашивания соответствующими антителами. Хотя это было ^{сделано и раньше}, этот процесс может значительно снизить выход РНК или ДНК из этих проникнутых клеток. Еще одним предостережением может быть то, что не все антитела подходят для FACS. Например, в настоящее время можно использовать антитело, которое очень хорошо работает для вестерн-блоттинга, метода, который требует денатурации белков. Это антитело не обязательно может быть пригодным для идентификации этих типов клеток с помощью FACS, учитывая, что белки не денатурируются ни в одном из этапов данного протокола, и, таким образом, антитело может не иметь способа связываться с присущим ему антигеном. Компании предоставляют листы спецификаций, в которых указаны приложения, для которых антитела были одобрены. Если антитело не было одобрено для проточной цитометрии, это не должно отпугивать вас от использования этого протокола с конкретным антителом; однако следует знать, что это не гарантируется, что он будет работать для FACS. Третье предостережение этого протокола связано с количеством клеток, которые человек пытается выделить. FACS является отличным методом получения максимально возможного количества клеток даже из небольшого кусочка ткани, но также возможно, что если кто-то захочет выделить относительно разреженную популяцию клеток из относительно небольшой области мозга, то выход от одного животного будет по своей природе низким. В этом случае может потребоваться объединение мозговой ткани нескольких животных в одной и той же группе лечения, чтобы получить количество клеток, необходимое для последующего анализа; тем не менее, в недавней публикации использовалась генно-таргетная предварительная амплификация кДНК для последующего анализа экспрессии генов из небольшого числа активированных нейронов (5-6%) из большего набора отсортированных нейронов, что указывает на то, что можно анализировать экспрессию генов даже из небольших подмножеств нервных клеток без объединения большого числа животных⁶Последнее предостережение этого метода заключается в том, что у вас должен быть доступ к сортировщику клеток, который находится не слишком далеко. Сортировщик ячеек — это сложная машина, которая требует серьезного обучения для правильной эксплуатации. Таким образом, эти машины часто управляются квалифицированным техническим специалистом на основном предприятии. Кроме того, цель этой процедуры состоит в том, чтобы диссоциировать нервную ткань, окрасить ее на специфические антитела и немедленно доставить эти образцы в сортировщик в течение короткого периода времени (возможно, полдня). Эти временные рамки помогут повысить выживаемость и выход выделенных клеток и сохранить целостность клеток для последующей обработки и анализа. Если все описанные выше параметры соблюдены, FACS является отличным методом для анализа специфической экспрессии генов и белков нервной ткани по типу клеток.

Все эксперименты проводились в соответствии с Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC) Университета штата Делавэр и Руководством Национальных институтов здравоохранения по уходу и использованию лабораторных животных.

Protocol

1. Подготовка к забору тканей (15 – 30 мин)

1. Отполируйте огнем три комплекта стеклянных пипеток Пастера в уменьшающемся диаметре и пронумеруйте их «1» = диаметр примерно 1 мм, «2» = диаметр примерно 0,75 мм и диаметр «3» = диаметр примерно 0,50 мм.
2. Ресуспендируйте лиофилизированный фермент А со всем буфером А в соответствии с протоколом, прилагаемым к набору для нейронной диссоциации (см. Таблицу материалов). Не делайте вихрей. Разложите раствор по 50 мкл и храните при температуре -20 ºC для последующего использования.
3. Приготовьте 1 л буфера для удаления миелина и вакуумный фильтр для стерилизации [буфер для удаления миелина = 1 000 мл 0,1 М фосфат-буферного раствора (PBS), 2 мл 500 мл 500 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) и 10 г бычьего сывороточного альбумина (БСА)].
4. Разрежьте лист нейлоновой сетки на небольшие квадраты размером 1 х 1 дюйм (2,5 х 2,5 см), которые будут использоваться для фильтрации клеточного мусора и автоклавы в небольшой стакан, покрытый алюминиевой фольгой.
5. Приготовьте 1 л буфера для промывки [буфер для промывки = 1 000 мл 0,1 М PBS, 2 мл 500 мМ ЭДТА и 10 г БСА].

2. Коллекция тканей

1. Включите водяную баню до 37 ºC.
2. Приготовьте буфер X из набора для нейронной диссоциации, добавив бета-меркаптоэтанол в буфер X до конечной концентрации 0,067 мМ (для 4 образцов добавьте 13,5 мкл 50 мМ бета-меркаптоэтанола в 10 мл буфера X).
3. Приготовьте смесь ферментов 1, смешав 50 мкл фермента P с 1 900 мкл буфера X для каждого образца, как описано в протоколе набора для нейронной диссоциации Например, для 4 образцов смешайте 200 мкл фермента P с 7 600 мкл буфера X.
4. Поместите Buffer X на водяную баню при температуре 37 ºC.
5. Поместите 2 мл холодного буферизованного раствора соли Хэнка (HBSS) (без Ca⁺⁺ и Mg⁺⁺) в одну лунку стерильного 6-луночного планшета для культивирования для каждого образца, который будет собран, и держите на льду для вскрытия тканей.

3. Рассечение тканей (45 мин – 1 час)

1. Введите животному соответствующий объем раствора для эвтаназии (коммерческий раствор барбитуратов, например, эвтазола) в соответствии с рекомендациями Комитета по уходу и использованию животных (IACUC) и перфузируйте всю кровь холодным 0,9% физиологическим раствором.
   1. Вводите крысам с передозировкой раствора для эвтаназии.
   2. Контролируйте анестезию с помощью дыхания и защемления пальцев ног. Когда животное в достаточной степени обезболено (отсутствие реакции на ущипывание пальца ноги и глубокое, медленное дыхание), крысу можно перфузировать.
   3. Чтобы перфузировать крысу, разрежьте грудную полость с помощью сверхпрочных ножниц. Разрежьте диафрагму, чтобы обеспечить доступ к сердцу. Разрежьте ребра с обеих сторон до верхней части груди, чтобы обеспечить полный доступ к сердцу. В этот момент грудная клетка может быть отведена в сторону с помощью пары гемостатиков.
   4. Выполните перфузию сердца путем введения иглы 18 G (для взрослых крыс), прикрепленной к электрическому насосу, в левый желудочек сердца. Насос набирает холодный 0,9% солевой раствор.
   5. Затем разрежьте правое предсердие небольшими ножницами, чтобы кровь и жидкий перфузат могли отточить из организма.
   6. Перфузируйте крысам примерно 10 мл (для взрослых крыс) 0,9% физиологического раствора для удаления всех периферических иммунных клеток и факторов.
2. Рассеките нужную часть области мозга с помощью стерильных бритвенных лезвий и соответствующего рассечения, затем поместите кусочки ткани в холодный HBSS без Ca²⁺ и Mg²⁺,
   ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол требует HBSS без Ca²⁺ и Mg²⁺ на ранних этапах протокола, поскольку эти ионы могут мешать ферментам, необходимым для диссоциации нейронов.
3. После того, как все образцы тканей будут собраны, вернитесь на чистый стол или стерильный капюшон для обработки тканей.

4. Нейронная диссоциация (1 час)

1. Нарежьте каждый образец ткани на мелкие кусочки с помощью стерильных бритвенных лезвий на крышке 6-луночного планшета для культивирования. Этот протокол использовался для образцов тканей в дозе около 30 - 100 мг, но он одобрен для образцов тканей в дозе до 400 мг. Для образцов тканей с концентрацией более 400 мг объемы реагентов должны быть соответствующим образом увеличены.
2. Используйте 1 мл свежего HBSS без Ca²⁺ и Mg²⁺ для переноса нарезанных кубиками кусочков ткани с помощью пипетки в стерильную центрифужную пробирку объемом 2 мл. Повторяйте шаги 4.1 и 4.2 для всех образцов до тех пор, пока все образцы не будут перенесены в центрифужную пробирку объемом 2 мл.
3. Центрифугируйте образцы при давлении 300 x g в течение 2 мин в режиме ОТ и аспирируйте надосадочную жидкость.
4. Добавьте 1 900 μл теплой Enzyme Mix 1, приготовленной на этапах 2.2 и 2.3, в каждый образец и закройте пробирки.
5. Инкубируйте образцы в течение 15 минут на водяной бане при температуре 37 ºC, переворачивая пробирки несколько раз каждые 5 минут, чтобы повторно суспендировать осевшие кусочки ткани.
6. Тем временем приготовьте смесь ферментов 2, смешав 20 мкл буфера Y с 10 мкл размороженного фермента A (для 4 образцов смешайте 80 мкл буфера Y с 40 мкл размороженного фермента A).
7. Добавьте 30 μл Enzyme Mix 2 в каждый образец и аккуратно переверните. Не делайте вихрей.
8. Диссоциируйте каждый образец ткани с помощью пипетки Пастера «1», растирая вверх и вниз 30 раз.
9. Инкубируйте образцы в течение 15 минут на водяной бане при температуре 37 ºC; переворачивайте пробирки несколько раз каждые 5 минут, чтобы снова суспендировать осевшие кусочки ткани.
10. Диссоциируйте каждый образец ткани с помощью пипетки Пастера «2», растирая вверх и вниз 30 раз. Избегайте образования пузырей.
11. Диссоциируйте каждый образец ткани с помощью пипетки Пастера «3», растирая вверх и вниз 30 раз. Избегайте образования пузырей.
12. Инкубируйте образцы в течение 10 минут на водяной бане при температуре 37 ºC; переворачивайте пробирки несколько раз каждые 5 минут для повторного суспендирования осевших клеток.
13. Нанесите суспензию одиночных клеток на штамм клеток размером 80 микрон, помещенный поверх пробирки сокола объемом 15 мл, чтобы удалить крупные частицы мусора, и промойте фильтр и клетки 10 мл HBSS (с Ca²⁺ и Mg²⁺), чтобы остановить ферментативные реакции. Повторяйте до тех пор, пока каждый образец не будет переложен в чистую пробирку объемом 15 мл.
14. Центрифугируйте образцы при 300 x g в течение 10 минут в режиме RT и отсасывайте из надосадочной жидкости.

5. Истощение миелина (45 мин)

1. Тщательно повторно суспендируйте гранулы клеток с 400 μл буфера для удаления миелина.
2. Добавьте указанное количество шариков для удаления миелина и пипетку вверх и вниз, чтобы тщательно перемешать.
   Примечание: Объем используемых гранул для удаления миелина будет зависеть от размера ткани, возраста животного и количества миелина, ожидаемого в этой конкретной области мозга. Например, для образца гиппокампа взрослой крысы (приблизительно 300 мг) инкубируйте образец со 100 мкл гранул для удаления миелина.
3. Выдерживать 15 минут в холодильнике при температуре 4 ºC.
4. Промойте каждый образец 5 мл буфера для удаления миелина.
5. Центрифугируйте образцы при давлении 300 x g в течение 10 мин при RT.
6. Во время центрифугирования образцов поместите 1 колонку для каждого образца в магнитное поле магнитного сортировщика и поместите чистый фильтр 80 микрон поверх каждой колонки.
7. Подготовьте колонки и профильтруйте, промыв каждую колонку 1 мл буфера для удаления миелина 3 раза (всего 3 мл). Соберите все проточные воды в контейнер для отходов, например на дно пустого ящика для чаевых.
8. Поместите пробирку из полистирола с круглым дном объемом 5 мл непосредственно под каждой колонной при подготовке к сбору проб.
9. Когда клетки закончат центрифугирование, отобрать надосадочную жидкость и тщательно повторно суспендировать в 500 мкл буфера для удаления миелина. Сразу же нанесите клеточную суспензию на колонку и соберите клетки в пробирку ниже.
10. Промойте фильтр и колонку буфером для удаления миелина 1 мл 4 раза (всего 4 мл).
11. Центрифугируйте сбор клеток при 300 x g в течение 10 мин при RT.
12. Аспирируйте надосадочную жидкость, и теперь клетки готовы к окрашиванию.

6. Окрашивание живых клеток для FACS (1 час для окрашивания)

1. Кратковременно вихревыми (2 сек) клетки отделить пеллеты и немедленно добавить 5 мкл Fc-блока (антикластеры дифференцировки 32, CD32), снова сделать вортексом и инкубировать в холодильнике при температуре 4 ºC в течение 5 мин.
2. Между тем, приготовьте первичную смесь антител, добавив три первичных антитела в промывочный буфер следующим образом: 0,125 мкл аллофикикоцианина (APC) -конъюгированного антитела CD11b (1:800), 1 мкл анти-GLT1 антитела (1:100) и 0,4 мкл флуоресцеина изотиоцианата (FITC) – конъюгированного антитела Thy1 (1:250) на каждые 100 мкл промывочного буфера. Каждый образец получит 100 μл первичной смеси антител для инкубации; Однако, если ваш образец намного больше 400 мг ткани, вы можете рассмотреть возможность соответствующего увеличения объема вашей первичной смеси антител
3. Подготовьте пробирки для контроля одиночного окрашивания, удалив всего 2 мкл клеток из каждой пробирки с образцом и добавив их в каждую пробирку для контроля окрашивания. К контрольным группам «одинарного окрашивания» относятся: только APC-CD11b, только GLT1, только FITC-Thy1, только вторичные антитела ПЭ и «пустой» или неокрашенный контроль.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Все образцы должны быть представлены во всех контрольных показателях, таким образом, в каждую контрольную пробирку для окрашивания следует добавить 2 мкл клеток из каждого образца.
Кратковременно перебейте
4. пробирки (2 сек) и добавьте 100 мкл первичной смеси антител в каждую пробирку с образцом и 100 мкл соответствующего первичного антитела в каждую контрольную пробирку для окрашивания, снова закрутите пробирки, накройте пробирки алюминиевой фольгой для защиты флуоресцентных антител от любого света и инкубируйте пробирки в холодильнике при температуре 4 ºC в течение 20 мин. Образцы следует хранить в прохладном месте (при температуре 4 ºC) в течение оставшейся части процедуры, чтобы сохранить целостность образцов и антител.
Кратковременно перебейте
5. пробирки и добавьте 2 мл промывочного буфера в каждую пробирку.
6. Центрифужные пробирки при 350 x g в течение 5 минут при 4 ºC.
7. Тем временем приготовьте смесь вторичных антител, добавив 0,2 мкл ПЭ-конъюгированного вторичного антитела против кролика на каждые 100 мкл промывочного буфера. Каждый образец получит 100 μл вторичной смеси антител; Однако, если ваш образец намного больше 400 мг ткани, вы можете рассмотреть возможность соответствующего увеличения объема вашей первичной смеси антител.
8. Когда центрифугирование будет завершено, слейте надосадочную жидкость с каждого образца в раковину и промокните пробирки вверх дном на бумажном полотенце.
Кратковременно смочите
9. пробирки и добавьте 100 мкл смеси вторичных антител в каждую пробирку с образцом и соответствующее вторичное антитело в каждый контроль окрашивания, снова закрутите пробирки, накройте пробирки алюминиевой фольгой и инкубируйте пробирки в холодильнике при температуре 4 ºC в течение 15 мин.<бр/> ПРИМЕЧАНИЕ: Контрольная трубка для окрашивания, предназначенная только для GLT1, должна получать вторичную смесь антител.
10. После инкубации кратковременно перебейте пробирки и добавьте в каждую пробирку по 2 мл промывочного буфера.
11. Центрифугируйте пробирки при давлении 350 x g в течение 5 минут при температуре 4 ºC.
12. Когда центрифугирование будет завершено, слейте надосадочную жидкость с каждого образца в раковину и промокните пробирки вверх дном на бумажном полотенце.
13. Сделайте пробирки вихревыми и добавьте в каждую пробирку 0,25 мл стерильного PBS. Образцы готовы к сортировке.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для большего количества клеток может потребоваться 0,5 мл стерильного PBS; Тем не менее, лучше всего начать с меньшего объема, так как образец всегда может быть разбавлен, если он слишком концентрирован на клетках.
    ПРИМЕЧАНИЕ: По желанию добавьте ДНКазу в пробирку, чтобы предотвратить слипание клеток и, таким образом, засорение сортировщика. Образцы также могут быть отфильтрованы с помощью стерильного фильтра 80 микрон непосредственно перед сортировкой, чтобы избежать засорения сортировщика.
14. Отнесите клетки в сортировщик на льду. Соберите клеточные популяции в центрифужные пробирки объемом 2 мл без нуклеазы по 0,5 мл стерильного PBS в каждой пробирке.
15. После сортировки сверните клетки при 300 x g в течение 2 мин при 4 ºC. Отасуньте большую часть PBS и заморозьте клетки в морозильной камере при температуре -80 ºC до дальнейшей обработки либо для экстракции РНК (см. 1 для получения дополнительной информации о протоколе), экстракции ДНК (см. 2 для более подробной информации о протоколе) или лизиса клеток для анализа белка.

Results

Важность истощения миелина и перфузии тканей

Рисунок 1 показывает важность истощения миелина. Истощение миелина (шаги с 5.1 по 5.12 вышеуказанного протокола) происходит, когда суспензию одиночных клеток инкубируют в гранулах для удаления миелина, промывают и затем пропускают через колонку на магнитном сортировщике. Цель этих шагов — уменьшить количество клеточного мусора, присутствующего в каждом образце. Поскольку нейроны диссоциированы и растираются, он может срезать процесс...

Discussion

Как и многие другие ткани и системы, мозг состоит из гетерогенной популяции клеток, которые функционируют вместе, влияя на поведение. Анализ экспрессии генов, экспрессии белков или эпигенетических модификаций отдельных клеток в пределах этой гетерогенной популяции может раскрыть информацию о функции системы в целом, идентифицировать клеточные процессы, регулирующие как нормальное поведение, так и патологические процессы, а также обеспечить специфичные для типа клеток мишени для потенциальных методов лечения. Вполне возмо...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Набор для нейронной диссоциации (P)	Miltenyi Biotec	130-092-628
Шарики для удаления миелина II	Miltenyi Biotec	130-096-733
Колонны LS	Miltenyi Biotec	130-042-401
Сепаратор QuadroMACS	Miltenyi Biotec	130-090-976
MACS MultiStand	Miltenyi Biotec	130-042-303
Нейлоновый сетчатый лист	Amazon	CMN-0074-10YD	ширина 40 дюймов, размер ячейки 80 микрон
Fc Block / анти-CD32	BD Biosciences	BDB550270	реактивность для крысы
APC-конъюгированное антитело CD11b	Biolegend	201809	реактивность для крысы
Кролик анти-GLT1	Novus Biologicals	NBP1-20136	реактивность для крысы или человека
PE-конъюгированный антикролик вторичное антитело	eBioscience	1037259	вторичное антитело к анти-GLT1
FITC-конъюгированное антитело против крысы CD90 (Thy1) мышиного антитела	Biolegend	202504	реактивность для крыс