Методическая статья

Иммуногистохимия и множественные Маркировка с антителами из того же вида-хозяина по изучению взрослых гиппокампа нейрогенеза

DOI:

10.3791/52551

⸱

22 апреля 2015 г.

 ,  ,  , 
1Hans Berger Department of Neurology, Jena University Hospital

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта видеостатья иллюстрирует всеобъемлющий протокол для обнаружения и количественной оценки всех стадий взрослого нейрогенеза гиппокампа в пределах одного и того же участка ткани. Нами был разработан метод преодоления ограничений непрямой множественной иммунофлуоресценции, возникающих при недоступности подходящих антител от разных видов хозяев.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Нейрогенез является строго регулируется, многоступенчатый процесс, в котором новые нейроны генерируются из активированного нервной стволовой клетки с помощью более совершенных промежуточных подтипов предшественников. Каждый из этих подтипов выражает набор конкретных молекулярных маркеров, которые, вместе с конкретными морфологических критериев, могут быть использованы для их идентификации. Как правило, иммунофлуоресцентные методы применяются с участием подтипов специфических антител в сочетании с экзо- или эндогенных маркеров пролиферации. Здесь мы опишем иммунного методы для обнаружения и количественного определения всех этапах взрослого гиппокампа нейрогенеза. Они включают в себя применение тимидина аналогов, transcardial перфузии, обработки ткани, тепло-индуцированной поисковых эпитоп, ABC иммуногистохимических, рассеянный непрямой иммунофлюоресценции, конфокальной микроскопии и сотовый количественной оценке. Кроме того, мы представляем очередную несколько протоколов иммунофлюоресценции, которая обходит проблемы ˙Usually, вытекающие из необходимости использования первичных антител, поднятые в одних и тех же видов хозяев. Это позволяет точно идентифицировать все гиппокампа подтипов предшественников вместе с маркером пролиферации в пределах одного раздела. Эти методы являются мощным инструментом для изучения регуляции различных подтипов предшественников параллельно, их участие в патологий головного мозга и их роль в специфических функций головного мозга.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Две области мозга конструктивно генерировать новые нейроны на протяжении всей жизни, субвентрикулярная зона боковых желудочков и субгранулярной зона (SGZ) в зубчатой ​​извилине гиппокампа (ГД). Новорожденные нейроны происходят из нервных клеток-предшественников и пройти через различные этапы морфологического и физиологического развития до достижения зрелости 1,2. С медленно деления радиальной глии, как стволовые клетки (тип 1) последовательных стадий переходные делящиеся клетки-предшественники промежуточных возникает. Более недифференцированные подтипов (тип 2a и 2b типа) имеют неправильную форму с короткими, касательных процессов. Они генерируют нейробласты (тип 3), которые постепенно выйти из клеточного цикла, чтобы стать незрелые нейроны (с дендриты распространялась и на молекулярном слое) и, наконец, интегрироваться в гиппокампе сети, зрелые зернистых клеток. Из-за их особых физиологических особенностей эти клетки обеспечивают схемы с улучшенными пластичность 3 suggesка уникальную роль в гиппокампе функции. На самом деле, исследования последнего десятилетия вызвал значительный доказательства того, что нейрогенез вносит свой ​​вклад в пространственной памяти, разделение образов и эмоционального поведения 4,5.

Нейрогенез может быть изучено с использованием различных подходов. Аналоги тимидина включить в ДНК во время S-фазы клеточного цикла и позволяют рождение знакомств, количественного и судьба анализ новорожденных клеток 6-8. Последовательное применение различных аналогов тимидина (например, CldU, EDU или ПИН) могут быть использованы для изучения обновление клеток или клеточных популяций, родившихся в различные моменты времени в ходе эксперимента 9. Альтернативный, эндогенный маркер клеточной пролиферации является Ki67. Это выражается в делящихся клетках на всех этапах клеточного цикла (G1, S, G2, M), за исключением фазы покоя (G0) и в начале G1 10,11. Для анализа фенотипа новорожденных клеточных популяций у взрослых dentatе извилины несколько сценических конкретных молекулярных маркеров может быть использован, например, GFAP, нестина, DCX и NeuN 1,6. GFAP является маркером зрелых астроцитов, но также выражается в радиальной глии-подобные клетки во взрослом переднего мозга. Нестин представляет собой промежуточный нити, характерные для радиальных глиальных клеток, как и в начале промежуточных клеток-предшественников. DCX является ассоциированный с микротрубочками белок экспрессируется в промежуточных предшественников, нейробластов и незрелых нейронов. На основании (со) выражения этих трех маркеров и морфологических особенностей меченых клеток четыре различных подтипов клеток-предшественников можно выделить: тип 1 (GFAP +, нестин +, DCX -), тип 2а (GFAP -, нестин + , DCX -), тип 2б (GFAP -, нестин +, DCX +) и 3 (GFAP -, нестин -, DCX +) 1. Co-маркировка DCX вместе с NeuN, которая выражается в постмитотических нейронов, позволяет дифференцировать immaturе (DCX +, NeuN +) и зрелых (DCX -, NeuN +) гранул нейроны.

Указанные выше маркеры часто используются для иммунофлуоресцентным сотрудничества маркировки и последующего конфокальной микроскопии, чтобы проанализировать количество и личности новорожденных клеток. Это обычно требует антител из различных видов хозяев, чтобы предотвратить нежелательное антител перекрестной реактивности. Тем не менее, большинство первичных антител, пригодных для исследования нейрогенеза поднимаются либо у кроликов или мышей (например, мыши α-BrdU, мыши α-NeuN, кролика α-Ki67, кролика α-GFAP). Это приводит к серьезным ограничениям в количестве и комбинации антигенов, которые могут быть оценены в одной секции. Это, в свою очередь, не только увеличивает усилие окрашивания, а несколько окрашивание должны быть выполнены, но также может поставить под угрозу достоверность результатов. Кроме того, некоторые антигены, восприимчивы к фиксации формалином индуцированных эпитопа маскировки (например, Ki67, Нестин). Здесь мы опишем изменения от классических протоколов единичного и множественного иммунноокрашивания (например, поиск эпитоп, несколько последовательный иммуноокрашивание, использование нестин-GFP трансгенных мышей 12), что преодолеть многие из этих проблем. В частности, протокол последовательного многократного иммунофлюоресценции позволяет окрашивание против до четырех различных антигенов, даже если часть антител, полученных из того же хоста. Это дает возможность одновременно регистрировать типа 1, типа 2а, 2b типа и клеток типа 3-предшественников, а также их пролиферативную активность в течение одной секции.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ПРИМЕЧАНИЕ: Все процедуры, связанные с живых животных были проведены в соответствии с директивой ЕС 86/609 / EEC руководящие принципы по уходу и использованию лабораторных животных и утвержденной местным комитетом по этике (Thüringer Landesamt für Lebensmittelsicherheit унд Verbraucherschutz).

1. внутрибрюшинного введения тимидина аналогов

  1. Взвешивание животных день перед инъекцией. Рассчитайте количество аналога тимидина, необходимое для всех инъекций запланированных на следующий день, а также отдельных весовых поправкой объемов инъекции 10 мг / мл маточного раствора.
  2. Подготовка 10 мг / мл маточного раствора тимидина. (ВНИМАНИЕ! Аналогов тимидина являются токсичными. Следуйте конкретные Паспорта безопасности (MSDS), предоставленные поставщиками, т.е. носить халат и перчатки, использовании химических вытяжку).
    1. Возьмите аналог тимидина из морозильной камеры и довести его до комнатной температуры, ок. 21 ° С. Взвешивание 10 мг и добавитьстерильный физиологический раствор (для BrdU и CldU) или 0,04 N NaOH (в стерильном физиологическом растворе; для ПИН), вихревые. Место для по крайней мере 10 - 15 мин на водяной бане 50 ° и вихря каждые 2 - 3 мин для растворения порошка.
      Примечание: использование решения для до 24 ч при хранении при комнатной температуре и в течение нескольких недель при -20 ° С. Защитите решения от света (крышки алюминиевой фольгой). Всегда проверяйте осадков и вновь растворяются, если необходимо.
  3. Задержите курсор за шкирку и внутрибрюшинно вводят соответствующий, вес с поправкой на объем исходного раствора (при комнатной температуре) с помощью тонкой дозировки шприца с 30 G иглой.
    Примечание: В случае CldU и ПИН должны быть введены последовательно в течение того же животного, считают вводят эквимолярные концентрации (например, 42,5 мг / кг CldU и 57,5 мг / кг ПИН, которые соответствуют 50 мг / кг BrdU). Таким образом, отрегулировать громкость инжекцион- 10 мг / мл исходных растворов соответственно.

2. Подготовка ткани

  1. ПреRe 4% формальдегида в 0,1 М фосфатного буфера рН 7,4 в день перед перфузии. Хранить при 4 ° С.
  2. Транскардиальную заливать глубоко под наркозом мышей (3,5% изофлуран) через левый желудочек с помощью 10 мл охлажденного льдом PBS, а затем с 40 мл охлажденного льдом формальдегида (скорости потока 5 мл / мин). Рассеките мозг и пост-исправление в том же фиксаторе в течение 24 ч при 4 ° С.
  3. Передача мозги последовательно в 10% (24 ч при 4 ° С) и 30% сахарозы (до раковины мозга, прибл. 48 ч). Для замораживания, медленно погрузить криопротекции мозги в -25 ° C изопентан, пока не было пузырей появляются из ткани. Хранить при -80 ° С.
  4. Вырезать корональные разделы 40 мкм толщиной на морозный микротоме (температура блока при -25 до -16 ° C). Перевод Последовательно секций, в которых антифриза раствора, содержащего лунки для культивирования клеток пластины 24-а (рисунок 1). Хранить при -20 ° С.

"Рисунок Рисунок 1. Схематическое изображение передачи микротомных ломтики в 24-луночного планшета. Начало в А1 и поместите последующие ломтики в строке А, после A6 перейти к следующей строке Б и так далее. При достижении D6, вернуться к A1 и продолжить. Такое расположение ломтиками позволяет для количественного определения каждого п-го участка всего мозга. Для количественного новорожденных клеток принимать все 6-го отдела головного мозга (в эквиваленте к содержанию одного столбца), для иммунофлуоресценции фенотипирования принять все 12-го отдела (эквивалент содержания 2 чередующихся строк одного столбца).

3. Иммуноокрашивание

ПРИМЕЧАНИЕ: разделы обрабатываются свободное плавание, как правило, в 6-луночные планшеты оснащены несущей пластиной и сетчатыми вставками. В качестве исключения, блокирование, антител инкубации и реакция ABC сделаны в 12-ти или 24-луночных планшетах без сетчатыми вставками (от 0,5 до 1 мл на Wлокоть достаточно, в зависимости от числа срезов, которые должны быть окрашены). Во время этих шагов, трансфер разделы с помощью тонкой кистью (полоскания с каждым новым раствора). Все инкубации сделали при непрерывном перемешивании (макс 150 мин).

  1. Иммуногистохимия (метод АВС)
    1. Передача участков с антифризом в TBS и тщательно промыть (один раз O / N при 4 ° С, 5 раз при комнатной температуре в течение 10 мин каждый), чтобы полностью удалить антифриз.
    2. Выдержите в течение 30 мин в 1,5% H 2 O 2 в TBS-T, чтобы утолить активности эндогенной пероксидазы. Обратите внимание на спокойный и вновь погрузиться разделы, если необходимо. Промыть 3 раза в TBS в течение 15 минут каждый.
    3. Дополнительно: В то же время подогрева нагревательный шкаф и 2 N HCl до 37 ° C. Инкубировать срезы в течение 30 мин при 37 ° С в 2 N HCl к денатурации ДНК. Мягко отдельные разделы с помощью кисти.
    4. Дополнительно: Нейтрализовать секции в течение 10 мин в 0,1 М боратного буфера, рН8.5, RT. При перемещении кратко тампоном сетчатые вставки, содержащие разделы по бумажным полотенцем, чтобы удалить объедки HCl. Промойте 2 раза в TBS в течение 15 минут каждый.
    5. Выдержите в TBSplus к проницаемыми ткани, а также заблокировать неспецифических сайтов связывания антител, 1 ч при комнатной температуре.
    6. Выдержите в первичных антител разводят в TBSplus, о / N при 4 ° С. Промыть 3 раза в TBS в течение 15 минут каждый.
    7. Инкубируют в биотинилированного вторичного антитела, разбавленного в TBSplus, 3 ч при комнатной температуре. Промыть 3 раза в TBS в течение 15 минут каждый. Тем временем ...
    8. Подготовьте ABC комплекс в соответствии с протоколом производителя (1% + 1% B в TBS-T). Оставляют на 30 минут при комнатной температуре перед использованием. Инкубируйте разделы в АБ реагента в течение 1 ч при комнатной температуре. Промыть 3 раза в TBS в течение 15 минут каждый.
    9. Подготовка 50 мл 0,5 мг / мл DAB в TBS-T в 6- или 12-луночный планшет, разделен на две половины и пипетки 4 мл или 2 мл на лунку, соответственно. Передача части в DAB раствора (ВНИМАНИЕ! DAB токсичен. Последующие за УдельныйС MSDS, предоставляемые поставщиком, то есть носить халат и перчатки, использовать химическую вытяжку).
    10. Добавить 0,5 мл 1% H 2 O 2 в оставшихся 25 мл раствора DAB, перемешать и пипетку эквивалентные объемы, как описано выше в каждую лунку, чтобы начать реакцию с пероксидазой. Инкубировать в течение 12 мин. Промыть 3 раза в TBS в течение 15 минут каждый.
    11. Mount разделы к слайдам желатина, сухой воздух O / N. Покровное с постоянным монтажа среды.
    12. Дополнительно: контрастное до размещения покровное (см раздел 3.5).
      Примечание: Если отношение сигнал-шум является низкой из-за высокого фона, повторите H 2 O 2 лечение после инкубации с АБ реагента (этап 3.1.8).
  2. Multiple-иммунофлюоресценции
    1. Одноместный или одновременно несколько иммунофлюоресценции
      1. Передача участков с антифризом в TBS и тщательно промыть (один раз O / N при 4 ° С, в 5 раз при КТ в течение 10 мин каждый), чтобы полностью удалитьtifreeze.
      2. Дополнительно: как шаги 3.1.3 - 3.1.4.
      3. Выдержите в TBSplus к проницаемыми ткани и блокировать неспецифические сайтов связывания антител, 1 ч при комнатной температуре.
      4. Инкубируют в коктейль первичного антитела (например, крысы α-BrdU, морской свинки α-DCX, коз α-GFP), разбавленного в TBSplus, O / N при 4 ° С. Промыть 3 раза в TBS в течение 15 минут каждый.
      5. Выдержите в коктейль флуорохромом-сопряженных вторичными антителами (например, родамин красный α-крыса, Alexa-647 α-морскую свинку, Alexa-488 α-коза, все происходит в осла), разбавленный в TBSplus, 3 ч при комнатной температуре или O / N при 4 ° С. Отныне защитить разделы от света. Промыть 3 раза в TBS в течение 15 минут каждый.
      6. Mount разделы к слайдам желатина, сухой воздух O / N. Покровное водным монтажной среды.
    2. Последовательное многократное иммунофлюоресценции с первичными антителами из того же вида-хозяина
      1. Как шаги 3.2.1.1 - 3.2.1.3.
      2. Выдержите в Интернетпервый первичное антитело (например, кролика α-антиген), O / N при 4 ° С. Промыть 3 раза в TBS и один раз в TBS-T в течение 10 мин каждый.
      3. Выдержите в первом флюорохром-сопряженных вторичными антителами (например, родамин красный-Conj. Осел α-кролик), 3 ч РТ. Отныне защитить разделы от света. Промыть 3 раза в TBS и один раз в TBS-T в течение 10 мин каждый.
      4. Инкубируйте в 10% нормальной сывороткой же хосте, что первичными антителами (например, сыворотки кролика) в течение 3 ч, чтобы насытить RT открытые paratopes на первом вторичного антитела. Промыть 3 раза в TBS и один раз в TBS-T в течение 10 мин каждый.
      5. Инкубируют в TBSplus с 50 мкг / мл неконъюгированного одновалентные фрагменты Fab, направленные против множества первичных антител (например, α-кролика IgG (H + L)), чтобы покрыть эпитопы, которые могут быть признаны второй вторичными антителами, O / N в 4 ° С.
      6. Промыть по крайней мере 3 раза в TBS и один раз в TBS-T в течение 10 минут каждый. При перемещении кратко SWAб сетчатые вставки, содержащие разделы по бумажным полотенцем, чтобы удалить любые объедки Fab.
      7. Инкубируют на втором первичного антитела (например, кролика α-антиген B), O / N при 4 ° С. Промыть 3 раза в TBS и один раз в TBS-T в течение 10 мин каждый.
      8. Выдержите на втором флюорохром-сопряженных вторичными антителами (например, Alexa-488-Conj. Осел α-кролик), 3 ч РТ. Промыть 3 раза в TBS в течение 15 мин каждый, монтировать и покровное, как описано выше.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Для обозначения антигенов с антителами от различных видов хозяев, добавить их к шагу 3.2.2.2 и соответствующие вторичные антитела к шагу 3.2.2.3.
    3. Одним из вторичных антител из одного вида в качестве одного из первичных антител
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол подходит для четверного окрашивания с ВДУ или Ki67 вместе с GFAP, нестина-GFP и DCX.
      1. Строго придерживайтесь шаги протокола 3.2.1.1 - 3.2.1.5. До этого момента не использовать только осла сыворотки в TBSplus.
      2. Выдержите в ТBSplus содержащий 3% козьей сыворотки в течение 1 ч при комнатной температуре. Это охватывает открытые paratopes на α-коза вторичного антитела. Промыть 3 раза в TBS и один раз в TBS-T в течение 10 мин каждый.
      3. Выдержите в AMCA-Conj. козы α-кролика разводили в TBSplus, 3 ч РТ или O / N 4 ° C. Промыть три раза в TBS в течение 15 мин каждый, монтировать и покровное, как описано выше.
    4. CldU, ПИН совместно окрашивание
      1. Промыть, денатурации и нейтрализации разделы, как описано в разделе 3.2.1 (шаги 3.2.1.1 - 3.2.1.2).
      2. Инкубируют при 20 мкг / мл неконъюгированного Fab фрагментов α-мыши IgG (H + L) в TBSplus, 1 час при комнатной температуре. Промыть 4 раза в TBS и один раз в TBS-T в течение 10 мин каждый.
      3. Инкубируют в коктейль первичного антитела, содержащего крысы α-BrdU (1: 400; очищают IgG2) и мышь α-BrdU (1: 350), разведенного в TBSplus, O / N при 4 ° С. Промыть 3 раза в TBS и один раз в TBS-T в течение 10 мин каждый.
      4. Выдержите в коктейль вторичного антитела, содержащий биотинилированные осла α-крыса (1: 500) и FITC-Conj. осла α-мыши Fab-фрагменты (1: 100). Промыть 3 раза в TBS и один раз в TBS-T в течение 10 мин каждый.
      5. Выдержите в Родамина Red-Conj. Стрептавидин, 2 ч при комнатной температуре. Промыть 3 раза в TBS в течение 15 мин каждый, монтировать и покровное, как описано выше.
    5. Усиление сигнала флуоресценции у мышей нестин-GFP
      1. Добавить коз α-GFP в коктейль первичных антител.
      2. Добавить Флуорохром сопряженную вторичного антитела со спектральными свойствами, аналогичными свойствам GFP (например, Alexa 488 Conj. Осел α-козла) коктейлю вторичного антитела.
  3. Поиск Epitope
    1. Провести поиск эпитоп после смывания антифриз. Предварительный нагрев пароход с 6- или 12-луночные планшеты, содержащие 0,1 М цитратного буфера рН 6,0 в 95 - 99 ° С (приблизительно 25 мин).
    2. Передача участков в горячую цитратном буфере и пара в течение 30 мин (покрывать пластины с алюминиевой фольгой, как пластиковый лIDS не термостойких).
    3. Сразу же место пластины на бане со льдом, чтобы остыть. Это помогает защитить ткани морфологию, которая имеет особое значение при работе с срезах мозга постнатального животных.
    4. Промыть 3 раза в TBS в течение 10 минут каждый, чтобы промыть и обезвредить цитрат и продолжить окрашивание.
  4. Мышь антител на мыши ткани
    1. Добавить 20 мкг / мл одновалентные фрагменты Fab α-мышь IgG (H + L; те же хост-видов, чем вторичного антитела), чтобы на первом этапе блокирующим (например, шаг 3.1.5 или 3.2.1.3).
    2. Промойте 4 раза в TBS и один раз в TBS-T в течение 10 минут каждый, и заполните соответствующей протокола.
  5. Cresyl фиолетовый counterstaining
    1. Разогреть крезил фиолетовый раствор до 60 ° С (в стеклянной банке). Выдержите слайды в горячем растворе в течение 3 мин.
    2. Полоскание в н. Dest. и обезвоживают 2 раза по 1 мин каждый в 70%, 96% и 100% изопропанола. Ясно в течение 5 - 6 мин в ксилол или замены ксилола и покровного с совместимым постоянного крепления среды.

Анализ 4. Данные

  1. Количество пероксидазой окрашенных клеток новорожденных в каждой 6-й секции по всей рострокаудального степени зубчатой ​​извилине. Используйте световой микроскоп в 400 раз увеличения.
  2. Умножьте полученные числа клеток с интервалом пересечения, чтобы получить оценку общего числа новорожденных клеток.
  3. Изображение флуоресценции помечены участки с конфокальной лазерной микроскоп оснащен соответствующими лазеров и систем фильтрации. Возьмите стеки в случайных позициях вдоль всей протяженности зубчатой ​​извилине в 400 раз увеличения и анализировать, по крайней мере 50 случайно отобранных клеток, представляющих интерес в полушарии сотрудничества маркировки с другими маркерами.
  4. Умножьте полученные проценты СО-меченых клеток (% / 100) с общим числом новорожденных клеток для расчета абсолютнойчисло конкретных групп населения новорожденных клеток.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы применили методы, описанные выше, чтобы количественно определяет и характеризует новорожденных клеток в послеродовом и взрослых гиппокампа. Поэтому мы использовали дикого типа и нейрогенез с дефицитом циклин D2 выбить (Ccnd2 Ko) мышей содержали в условиях, известных влияют на скорость нейрогенеза (т.е. среде, обогащенной, EE) 13,14. Иммуногистохимическое окрашивание DAB против любой Ki67, ВДУ, CldU или ПИН последовательно выявлены различия в новорожденных числа клеток между дикого типа и ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Количественная и идентификация субпопуляций новорожденных клеток является центральным вопросом во взрослой исследований нейрогенез. Сочетание распространения маркеров и антител против белков, высказанных в ходе определенных этапах взрослого нейрогенеза позволяет иммуногистохимическое выявление этих групп населения. Некоторые из антител или их комбинаций антител требуют особых условий окрашивания.

Маркировка деления клетки с синтетическими аналогами тимидина еще золотой стандарт для изучения ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы благодарят С. Тауша за отличную техническую помощь. Работа проводилась при поддержке BMBF (Bernstein Focus 01GQ0923) и DFG (FOR1738).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Введение аналога тимидина
5-Bromo-2′-дезоксиуридина, BrdUSigma-AldrichB9285токсичный (мутагенный, тератогенный)
5-Chloro-2′-дезоксиуридин, CldUSigma-AldrichC6891токсичный (мутагенный, тератогенный)
5-Chloro-2′-дезоксиуридин, CldUMP Biomedicals2105478токсичный (мутагенный, тератогенный)
5-Йодо-2′-дезоксиуридин, IdUMP Biomedicals2100357токсический (мутагенный, тератогенный)
Препарат ткани
Isoflurane-ActavisPiramal Healthcare700211
порошок параформальдегида (PFA)Riedel-De Hä en16005токсичный, легковоспламеняющийся
перфузионный насос PD5206Heidolph Instruments523-52060-00
Masterflex Tygon лабораторная трубка, Ø 0,8 ммThermo Fischer Scientific06409-13
Подающая игла, прямая, 21 G, 1,75 мм оливковый наконечник, 40 ммAgnthos1036
Замораживающий микротом Microm HM 400Thermo Fischer Scientific
24-луночные многолуночные планшеты для клеточных культурGreiner Bio-One662160
ImmunohistochemistryTefal
vitacuisine пароваркаTefalVS 4001
Netwell 24 мм полиэфирная сетка мембранные вставкиCorning3479предварительно загружены в 6-луночные культуральные планшеты
Netwell 15 мм полиэфирная сетка мембранные вставкиCorning3477предварительно загружен в 12-луночные культуральные планшеты Пластиковый
6-луночный комплект Netwell Corning3521для полиэфирных сетчатых мембранных вставок 24 мм
Пластиковый сетчатый комплект Netwell на 12 лунокCorning3520для полиэфирных сетчатых мембранных вставок 15 мм
Vectastain Elite ABCVector LaboratoriesPK-6100
DAB (3,3′-Диаминобензидина тетрагидрохлоридгидрат)Sigma-AldrichD-5637канцерогенный, светочувствительный
Fluoromount-GSouthernBiotech0100-01
Первичные антитела
Rabbit IgG1 α-Ki67Novocastra/ Leica BiosystemsNCL-L-Ki67MM1DAB 1:400/IF 1:100; требуется извлечение
Кролик α-GFAP, AS-3-GFSynaptic Systems173 0021:500
Козий IgG (H+L) α-GFPAcris антителаR1091P1:300
Мышиный IgG1 α-nestinAbcamab61421:200; требуется извлечение эпитопов
Морская свинка IgG (H+L) α-DoublecortinMerck MilliporeAB22531:500
Крыса IgG2a α- BrdU (асцит)AbD Serotec/ Bio-RadOBT0030CXдля выявления BrdU; DAB 1:500/IF 1:400
Крысиный IgG2a α-BrdU (очищенный)AbD Serotec/ Bio-RadOBT0030   для выявления CldU; DAB 1:500/IF 1:250-400
мышь IgG1 α-NeuNMerck MilliporeMAB3771:500
мышь IgG1κ α-BrdUBD Biosciences347580Для обнаружения IdU; DAB 1:500/IF 1:350
Вторичные антитела
Осел &альфа;-морская свинка IgG (H+L)-биотинДианова711-065-1521:500
Осел &альфа;-крыса IgG (H+L)-биотинДианова712-065-1501:500
Осел &альфа;-мышь IgG (H+L)-биотинДианова715-065-1511:500
Коза &альфа;-крыса IgG (H+L)-Alexa Fluor 488Молекулярные зондыA110061:250
Осел α-коза IgG (H+L)-Alexa Fluor 488Молекулярные зондыA110551:250
Осел α-мышь IgG (H+L)-FITC, Fab-фрагментDianova715-097-0031:100
Осел α-мышь IgG (H+L)-Alexa Fluor 647Dianova715-605-1511:250
Осел α-морская свинка IgG (H+L)-Alexa Fluor 647Dianova706-605-1481:250
Осел α-крыса IgG (H+L)-родамин Red-XDianova712-295-1501:250
Осел α-кролик IgG (H+L)-родамин Red-XDianova711-295-1521:250
Осел α-морская свинка IgG (H+L)-родамин Red-XDianova706-296-1481:250
Стрептавидин-родамин Red-XDianova016-290-0841:500
Козий α-кролик IgG (H+L)-AMCADianova111-155-1441:250, работает только с кроликом α-GFAP
Hoechst 33342Молекулярные зондыH35701:1000
DAPIМолекулярные зондыD13061:1000
Blocking
Fab-фрагмент ослик α-мышь IgG (H+L)Dianova715-007-0031:20
Fab-фрагмент ослик α-кролик IgG (H+L)Dianova711-007-0031:20
Нормальная ослиная сывороткаMerck MilliporeS30
Нормальная сыворотка кроликаDianova011-000-010
Нормальная козья сывороткаDianova005-000-001
Бычий сывороточный альбуминSigma-AldrichA7906
Histology
Cresyl violetSigma-AldrichC5042
Neo-ClearMerck Millipore109843нетоксичный заменитель ксилола
Neo-MountMerck Millipore109016постоянная среда
Microscopy
Axioskop 2Carl Zeiss Микроскопия
LSM 710Carl Zeiss Микроскопия
эпитоповдля монтажа

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kempermann, G., Jessberger, S., Steiner, B., Kronenberg, G. Milestones of neuronal development in the adult hippocampus. Trends Neurosci. 27 (8), 447-452 (2004).
  2. Ge, S., Sailor, K. A., Ming, G. L., Song, H. Synaptic integration and plasticity of new neurons in the adult hippocampus. J Physiol. 586 (16), 3759-3765 (2008).
  3. Ge, S., Yang, C. H., Hsu, K. S., Ming, G. L., Song, H. A critical period for enhanced synaptic plasticity in newly generated neurons of the adult brain. Neuron. 54 (4), 559-566 (2007).
  4. Castilla-Ortega, E., Pedraza, C., Estivill-Torrus, G., Santin, L. J. When is adult hippocampal neurogenesis necessary for learning? evidence from animal research. Rev Neurosci. 22 (3), 267-283 (2011).
  5. Deng, W., Aimone, J. B., Gage, F. H. New neurons and new memories: how does adult hippocampal neurogenesis affect learning and memory. Nat Rev Neurosci. 11 (5), 339-350 (2010).
  6. Encinas, J. M., Enikolopov, G. Identifying and quantitating neural stem and progenitor cells in the adult brain. Methods Cell Biol. 85, 243-272 (2008).
  7. Burns, K. A., Kuan, C. Y. Low doses of bromo- and iododeoxyuridine produce near-saturation labeling of adult proliferative populations in the dentate gyrus. Eur J Neurosci. 21 (3), 803-807 (2005).
  8. Cameron, H. A., McKay, R. D. Adult neurogenesis produces a large pool of new granule cells in the dentate gyrus. J Comp Neurol. 435 (4), 406-417 (2001).
  9. Vega, C. J., Peterson, D. A. Stem cell proliferative history in tissue revealed by temporal halogenated thymidine analog discrimination. Nat Methods. 2 (3), 167-169 (2005).
  10. Scholzen, T., Gerdes, J. The Ki-67 protein: from the known and the unknown. J Cell Physiol. 182 (3), 311-322 (2000).
  11. Brown, D. C., Gatter, K. C. Ki67 protein: the immaculate deception. Histopathology. 40 (1), 2-11 (2002).
  12. Yamaguchi, M., Saito, H., Suzuki, M., Mori, K. Visualization of neurogenesis in the central nervous system using nestin promoter-GFP transgenic mice. Neuroreport. 11 (9), 1991-1996 (2000).
  13. Kempermann, G., Kuhn, H. G., Gage, F. H. More hippocampal neurons in adult mice living in an enriched environment. Nature. 386 (6624), 493-495 (1997).
  14. Sicinski, P., et al. Cyclin D2 is an FSH-responsive gene involved in gonadal cell proliferation and oncogenesis. Nature. 384 (6608), 470-474 (1996).
  15. Ansorg, A., Witte, O. W., Urbach, A. Age-dependent kinetics of dentate gyrus neurogenesis in the absence of cyclin D2. BMC Neurosci. 13, 46(2012).
  16. Taupin, P. BrdU immunohistochemistry for studying adult neurogenesis: paradigms, pitfalls, limitations, and validation. Brain Res Rev. 53 (1), 198-214 (2007).
  17. Lewis Carl, S. A., Gillete-Ferguson, I., Ferguson, D. G. An indirect immunofluorescence procedure for staining the same cryosection with two mouse monoclonal primary antibodies. J Histochem Cytochem. 41 (8), 1273-1278 (1993).
  18. Burry, R. W. Controls for immunocytochemistry: an update. J Histochem Cytochem. 59 (1), 6-12 (2011).
  19. Tuttle, A. H., et al. Immunofluorescent detection of two thymidine analogues (CldU and IdU) in primary tissue. J Vis Exp. (46), 6-12 (2010).
  20. Miller, R. T., Swanson, P. E., Wick, M. R. Fixation and epitope retrieval in diagnostic immunohistochemistry: a concise review with practical considerations. Appl Immunohistochem. Mol Morphol. 8 (3), 228-235 (2000).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи