Методическая статья

Высокопроизводительный скрининг для химических модуляторов посттранскрипционно регулируемых генов

DOI:

10.3791/52568

⸱

3 марта 2015 г.

 ,  , 
1Laboratory of Translational Genomics, Centre for Integrative Biology, University of Trento, 2High Throughput Screening Core Facility, Centre for Integrative Biology, University of Trento

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь мы описываем анализ репортерного гена на основе клеток как ценный инструмент для скрининга химических библиотек на наличие соединений, модулирующих механизмы посттранскрипционного контроля, осуществляемые через 3' UTR.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

И транскрипции и пост-регуляция транскрипции имеют огромное влияние на экспрессию генов. Тем не менее, общепринятые на основе клеток методы скрининга сосредоточиться на регуляции транскрипции, являясь, по сути, направленные на выявление промотора таргетирования молекул. В результате, после транскрипции механизмы в основном раскрыты в экспрессии генов развития целевых лекарств. Здесь мы опишем клеточном анализе, направленную на изучение роли нетранслируемой области (3 '3 УТР) в модуляции судьбе своего мРНК, и в идентификации соединений, способных изменить его. Анализ основан на использовании люциферазы репортерного конструкта, содержащего 3 'UTR из интересующего гена стабильно интегрирован в болезнь релевантных клеточной линии. Протокол разделен на две части, с особым акцентом на первичном скрининге, направленной на идентификацию молекул, влияющих на активность люциферазы после 24 ч обработки. Вторая часть протоколаописывает против скрининга необходимо разделить соединения, модулирующие активность люциферазы в частности, путем УТР в 3 '. В дополнение к подробным протокола и репрезентативные результаты, мы обеспечиваем важных соображений о развитии анализа и проверки на попадание (ов) на эндогенной мишени. Описано на основе клеток репортер ген анализ позволит ученым идентифицировать молекулы, модулирующие уровни белка с помощью пост-транскрипционных механизмов, зависящих от 3 'UTR.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В течение длительного периода транскрипции регуляции экспрессии генов считалось, играть существенным, если не исключительную роль в области контроля над производством белка. Накопленные данные, однако, показывает, что после транскрипции регулирование способствует столько же, если не более, регуляции транскрипции, чтобы определить клеточный белок обилие 1,2. Посттранскрипционных контроль экспрессии генов является гораздо более сложным и сложным, чем это было на первый взгляд. В самом деле, все различные этапы пост-контроля транскрипции появились, чтобы быть регламентированы, в том числе процессинга мРНК, локализации, оборота, перевод 3, а также недавно описанных обратимой РНК метилирования 4. Из числа посттранскрипционных регуляции процессов могут быть затронуты, анализа, описанного ниже фокусируется на тех, которые связаны 'нетранслируемой области (3' мРНК 3 UTR). 3 'UTR широко влияет мРНК судьбу в основном через специфического взаимодействия РНК-связывающего прoteins и некодирующие РНК к ее регуляторных последовательностей и / или вторичных структур 5. Таким образом, малые молекулы, которые изменяют эти взаимодействия или вмешиваться в верховьях передачи сигнала сместится баланс, который регулирует белковый изобилие. Этот терапевтический подход имеет особое значение для человека патологий, для которых существуют доказательства того, показывающие, что болезнь-актуальных гены подвергаются пост-транскрипционной регуляции, которая, таким образом, представляет собой потенциальную мишень для фармакологического вмешательства. Таким образом, системы, позволяющие для скрининга модуляторов уровни мРНК "путем вмешательства с посттранскрипционных механизмов управления в формате высокой пропускной могут стать ценным инструментом в идентификации возможных методов лечения романа.

Описанный на основе клеток ген-репортер анализ позволяет для идентификации соединений, способных модулировать мРНК судьбу с помощью механизмов, зависящих от ее 3'-UTR. Он состоит из нескольких главная Сomponents (рисунок 1) и требует несколько предварительных шагов для проверки возможности анализа. Прежде всего, репортер конструкция предназначена для включения UTR 3'от интересующего гена. 3 'UTR слит с конца гена-репортера, например, люциферазы светлячка (фиг.1). Любые изменения в пост-транскрипционных механизмов контроля, осуществляемого с помощью вставленной 3 'UTR изменит стабильность и / или эффективность трансляции этого химерного транскрипта, что приводит к различным уровням люциферазы. Таким образом, изменения в активности люциферазы служить косвенной мерой пораженной после регуляции транскрипции интересующего гена. Второй компонент системы является контроль репортерной конструкцией, идентичной плазмида экспрессии, который выражает тот же ген-репортер, но не содержит каких-либо 3 'UTR. Два репортер плазмиды могут быть разработаны в лаборатории с использованием обычных протоколов молекулярной биологии и приобрести у коммерческих источников.

Выбор соответствующей клеточной линии является критическим для строительства анализа. Какие клеточная линия оптимальная модель зависит от многих факторов, начиная от клинических потребностей, таких как максимальное сходство с патологией просто практических вопросов, таких как характеристики доступности, transfectability и роста. Важно отметить, что до продолжения необходимо убедиться, что слияние 3 'UTR, чтобы гена-репортера имеет ожидаемый эффект на уровне химерного транскрипта. Отсутствие существенных различий в люциферазы сигнал от 3 'UTR-подшипника и управления репортера конструкций временно трансфицировали в выбранных клетках будет означать, что 3' UTR не работает в этой клеточной модели, запроса на поиск альтернативных единиц. Для формата высокой пропускной, 3'-UTR-подшипников и контроль конструкции репортера люциферазы должно быть стабильно интегрирована в выбранной клеточной линии. Использование стабильно интегрировать по трансфицированыклеточная линия, предпочтительно по нескольким причинам. Это позволит расширить выбор сотовой модели, включая труднодоступных трансфекции клеточных линий, уменьшить изменчивость в данных, возникающих в результате колебаний эффективности трансфекции, стихают затраты. Кроме того, при временной трансфекции клеток очень часто перегружена плазмиды ДНК, ведущем к насыщению системы. В этих условиях дальнейшее увеличение экспрессии репортера может быть сложным, что приводит к снижению чувствительности к потенциальным соединений повышающей регуляции.

Наконец, когда все компоненты пробы, установлены, очень важно, прежде чем перейти к формату высокой пропускной определить целесообразность анализа, то есть, если активность люциферазы может быть действительно вверх и вниз регулируется частности, с помощью вставляется 3 ' УТР. Лучшие контроль будет малые молекулы, представленные модулировать стабильность или возможности перевода мРНК с помощью UTR 3'интерес. Если наличие нихневозможно, суррогатные управления, имитирующие желаемого эффекта не принимаются. Это могут быть микроРНК или РНК-связывающие белки, известные проявляют свое действие посредством связывания с 3 'UTR интереса. Оценка таких элементов управления, прежде чем первичный скрининг показывает не только функциональные возможности разработанного теста, а также позволяет для оценки его динамический диапазон, чувствительность и производительность в формате высокой пропускной способности.

Использование описанного протокола мы провели скрининг в 2000-библиотеки соединений 6. Нейробластома, наиболее распространенным экстракраниальных твердое опухоль младенчестве, был использован в качестве биологической модели и 3 'UTR онкогена MYCN, чьи амплификации сильно предсказывает неблагоприятный исход из нейробластомы, как гена-мишени 7. Рисунок 2 описывает экспериментальную схему. Скрининг был разделен на три трассы с размером партии 27 пластин, обследованных на один проход. Партия 27 пластин включены библиотеки набора спектраПлиты n.1-n.8 + n.25 (первый запуск), N.9-n.16 + n.25 (второй заход) и n.16-n.24 + n.25 (третий ход), каждый плита показан в трех экземплярах. Таким образом, одна библиотека пластина (n.25) анализировали во всех трех прогонов делает возможным сравнение между перспективе. Протокол ниже описывает один проход 9 библиотеки пластин, испытанных в трех экземплярах.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ПРИМЕЧАНИЕ: пропускная способность таких систем анализа зависит от доступного HTS лабораторного оборудования. Этот протокол облегчается EVO 200 робота Tecan Freedom, который выполняет наливных в формате 96-луночного. Миниатюризация в формат 384-а также возможно. Роботизированная система обработки жидкости расположен под колпаком с ламинарным потоком с целью поддержания асептических условий во всех экспериментальных этапов. Если нет жидкого обработки автоматизации не доступен, протокол может быть легко адаптирована к форме низкой пропускной способности.

Первичного скрининга

1. День 1: Подготовка и клеток семян

Примечание: семенной клетки с получением 80% слияния в момент тестировани активности люциферазы, т.е. 48 ч после посева.

  1. Ресуспендируют трипсином CHP134-mycn3UTR клеток нейробластомы до концентрации 2 × 10 5 клеток / мл в среде RPMI, содержащей 10% FBS и 1% L-глутамина. Для 27 пластин подготовки по крайней мере, 250 мл клеточной суспензии с учетом обработки жидкой, корыта мертвые объемы и повторяющихся операций пипетки. Вылейте клеточной суспензии в стерильной водохранилище и поместить его на робота столом.
  2. Поместите 9 штрих-кодом белые плоским дном 96-луночных и коробку 200 мкл стерильной советы пипетки на роботе столом. Смешайте клеточной суспензии с помощью пипетки перед каждым шагом устроения, чтобы избежать клеток урегулирования под действием силы тяжести. Разлить 75 мкл клеток в каждую лунку пластины 9, чтобы получить конечную плотность 1,5 × 10 4 клеток на лунку.
  3. Покрытие пластин с крышками и оставить их за пределами инкубаторе в течение 30 мин, чтобы позволить клеткам оседать на дно скважины. Это будет минимизировать краевые эффекты.
  4. Повторите шаги 1,2 и 1,3 раза для того, чтобы подготовить общее количество 27 пластин.
  5. Место пластин при 37 ° С и 5% СО 2 и инкубируют в течение 24 ч.

2. День 2: Лечение клеток с помощью библиотечных соединений

ntent "> Примечание: Библиотека малая молекула Коллекция спектр состоит из 2000 соединений, расположенных в 8 строк и 10 столбцов в 25 96-луночные планшеты при концентрации 10 мМ в ДМСО Лунки на первых и последних столбцах пусты для контроля. . Соединение скрининговых исследований обычно проводится при 1-10 мкМ концентрации соединения 8. Протокол скрининга, описанный здесь фиксирует 2 мкм, как в рабочей концентрации и 24 ч в качестве конечной анализ точки.

  1. Оттепель 9 библиотеки соединений пластин при комнатной температуре.
  2. Приготовьте два корыта стерильной PBS и PBS-0,5% ДМСО решений и разместить их на робота столом. Для каждой библиотеки пластины, подготовить и соответствующей метки один разбавления пластины - полипропилен U-дно 96-луночного планшета с рабочим объемом не менее 400 мл. Заполните каждую лунку колонок 2 до 11 разбавления пластин с 398 мкл стерильной PBS с использованием фиксированных советы жидкости проводника. Заполните столбцы 1 и 12 с 50 мкл стерильной PBSс 0,5% ДМСО, чтобы воспроизвести концентрацию транспортного средства в контрольных лунках (0,02%).
  3. Поместите два библиотеки пластин, соответственно, помеченные разведения пластин, две коробки 50 мкл советы стерильной пипеткой и шесть ячеек пластин на робота столом. Раскройте клетки пластины.
  4. Пипеткой 2 мкл 10 мМ маточного раствора из одной из двух пластин библиотеки в соответствующей разбавления пластины и хорошо перемешать. Это приведет к промежуточной концентрации соединений 50 мкМ. Используя тот же самый набор наконечников, обойтись 3 мкл разведении 50 мкМ в течение 3 со штрих белых 96-луночных планшетах с клетками. Это разбавление схема приводит к 2 мкМ, работающих концентрацию каждого тестируемого соединения.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы избежать ненужных манипуляций с подсказками, использовать полный набор 96 советов с самого начала, хотя библиотека пластины содержат только 80 соединений. Это возможно, поскольку первые и последние столбцы библиотеки пластин пусты.
  5. Замените советы пипетки и повторите StEP 2,4 для второго библиотеки пластины.
  6. Обложка клетки пластины и вернуть их в инкубатор на 24 ч.
  7. Повторите шаги 2,3-2,6 еще два раза для остальных библиотеки пластин.

3. День 3: Выполните люциферазы

Примечание: Перед выполнением анализа люциферазы, можно мультиплексировать его с жизнеспособности клеток анализа, основанного на сокращение резазурин, чтобы получить индекс клеточной жизнеспособности из каждой лунки 9. Мультиплексирование люциферазы и жизнеспособность анализа Анализы приводит к уменьшению сигнала люциферазы, что, однако, может быть проигнорирован, если эти клетки обеспечивают достаточно высокий уровень активности люциферазы. Активность люциферазы могут быть обнаружены с помощью различных коммерческих и домашние 10,11 люциферазы реагентов со стабильным сигналом люминесцентного.

  1. Равновесие водостойких реагент люциферазы выбора до комнатной температуры. Убедитесь, что объема достаточно для всех анализируемых пластин. Для 27 пластинынеобходимо будет с 170 мл реагент люциферазы с учетом обработки жидкой, корыта мертвый объем и повторяющихся операций пипетки. Вылейте люциферазы реагента в пласт и поместите его на робота столом.
  2. Удалить 9 пластин с ячейками, из инкубатора, разместить их на робота стол, раскрыть и подождать, пока не доведены до комнатной температуры. Добавить 50 мкл реагента люциферазы в луночный планшет с пластиной. Между пластинами, ввести задержку, равную времени люминесценции считывания одной пластины. Это будет гарантировать, что все планшеты измеряли в течение временного интервала, равной от реагента того.
  3. После 30-минутной инкубации, поместите первую пластину в фотометр и измерения люминесценции после краткого встряхивании шагу. Повторите эти действия для всех плит. Запись штрих-код каждой пластины и связать его с соответствующим файлом данных, чтобы избежать ошибок, связанных с большим количеством обрабатываемых пластин.
  4. Повторите шаги 3.2-3.3 раза для остальных 18 пластин с ячейками.
  5. Собирают оставшиеся реагент люциферазы и хранить его при температуре -20 ° С.

4. День 4: Анализ данных

  1. Процесс экспериментальные данные с помощью нормализации всех образцов в среднем на-пластины управления обработанных носителем. Для каждой библиотеки соединения, вычислить среднее значение х и SD над трижды.
  2. Выберите до регулирования и вниз для регулирования хиты, установив порог X ± к х SD, где средняя значение х и SD вычисляются по всем анализа обрабатываются ценностей, а К определяется константой.
  3. Выберите произвольный пороговые <20% обработанных носителем управления, когда снижение люциферазы сигнала, скорее всего, связанных с соединением токсичности. Отбросив ниже этого порога хиты значительно снизить количество ложноположительных попаданий в борьбе с экранирования.
    Примечание: Вместо управления на основе нормализации, экспериментальные данные могут быть обработаны применения Z счет или его надежной аналоговый B Sсердцевина 12. Кроме того, альтернативные статистические подходы для выбора хит доступны 12.

5. Counter-скрининг

ПРИМЕЧАНИЕ: Соединения, указанные в основного экрана (с маркировкой «хиты») подтверждены и оценены специфики встречной проверки.

  1. Cherry выбрать отдельные хиты из аликвоты, хранящихся в отдельных 2D со штрих труб и создавать новые "ударил пластины", сохраняя соответствующий макет. Не забудьте оставить свободные позиции для контроля.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При отсутствии эффективной системы снятия сливок, можно проверить и контроль и 3 'UTR-клеток, несущих параллельно при первичном скрининге. В этом случае, выбор конкретных соединений, оказывающих воздействие зависит только от вводимого 3 'UTR можно будет после того, как в первичном скрининге, устраняя необходимость в борьбе с экранирования. Тем не менее, параллельно скрининга в двух клеточных линий удвоит анализарасходы.
  2. После протокола для первичного скрининга (раздел «День 1: Подготовка и клеток семян"), для каждого "ударил пластины" подготовить три 96-луночных каждого CHP134-mycn3UTR и CHP134-Ctrl стабильных клеток.
  3. После протокола для первичного скрининга (раздел «День 2: Лечение клеток с библиотекой соединений"), используйте каждый удар пластину для лечения три CHP134-mycn3UTR и три CHP134-Ctrl пластин при 2 мкМ рабочей концентрации.
    Примечание: В то время как счетчик экраном описано здесь, выполняется в трех повторах в разовой дозе 2 мкМ, это может быть полезным, чтобы заменить стандартные повторов и протестировать попаданий в три концентрации в 10-кратных разведений в пределах от 2 мкМ до 20 нМ. Применяя этот подход позволит не только подтвердить данные основного экрана, но и получить предварительные данные доза-реакция на первичные хитов, сводя к минимуму ложных срабатываний. В этом случае, другой трубопровод Анализ должен быть Appliред обработки экспериментальных данных и убедитесь, хиты.
  4. После протокола для первичного скрининга (раздел «День 3: Выполнить люциферазы"), измерить активность люциферазы во всех CHP134-mycn3UTR и CHP134-Ctrl пластин.
  5. После протокола для первичного скрининга (раздел «День 4: Анализ данных"), нормализовать экспериментальные данные обработанных скважин в среднем на-пластины управления обработанных носителем и рассчитать среднее и SD над повторов. Для каждого тестируемого соединения, вычислить раз изменение активности люциферазы в CHP134-mycn3UTR против CHP134-Ctrl клеток. Выберите произвольного изменения раза CUT-офф> 1,5 и значение р-значения <0,01.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В описанных настроек анализа параметров, определяющим для попадания специфичности существенное изменение складка активности люциферазы в CHP134-mycn3UTR против CHP134-Ctrl клеток. При необходимости, можно также оценить соединения токсичность, выполняя одновременно в жизнеспособности клеток в сыворотке крови на себебранной соединения. Это может быть особенно полезно, если первичные хиты счетчик отобранных при анализе дозы. Для разовой дозы, наш опыт показывает сильную корреляцию с уменьшенной активности люциферазы с пониженной жизнеспособности клеток 6. Поэтому, снижение активности люциферазы в клетках-мишенях, а также контрольные клетки можно рассматривать как индикатор соединения на токсичность испытанной концентрации.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Использование описанного подхода мы провели скрининг с 2000-библиотеки соединений для потенциальных модуляторов посттранскрипционных контрольных механизмов, оказываемое через 3 'UTR гена MYCN. Рисунок 3 иллюстрирует результаты первичного скрининга на примере одной библиотеке пластины. Люциферазы сигнала отображается как процент обработанных носителем контрольных получали путем измерения активности люциферазы в трех повторах пластин CHP134-mycn3UTR клетках, обработанных соединений в одной библио...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол описывает клеточный анализ репортерного гена, направленный на идентификацию модуляторов, нацеленных на 3'-UTR-зависимые посттранскрипционные процессы. Он включает в себя первичный скрининг и контрскрининг и, при необходимости, может сопровождаться анализом цитотоксичности. Результатом первичного скрининга является ряд ценных соединений-кандидатов, воспроизводимость и специфичность которых дополнительно подтверждаются при контрскрининге.

Идентификация первичных попаданий основана ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы благодарим Итальянский фонд нейробластомы за полную финансовую поддержку этого проекта.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Планшет для культуры 96-луночный белыйPerkinElmer6005688
StorPlate 96-луночный U-образный дно (планшет для разведения)PerkinElmer6008190
100 мл одноразовый корыто для реагентовTecan10 613 048
300 мл одноразовый роботизированный резервуарVWRPB12001301
Роботизированные наконечники DITI 50  μ l Стерильныенаконечники Tecan30038607
робота DITI 200  μ l СтерильныйTecan30038617
Matrix 1,4 мл 2D с штрих-кодом, пробирки с плоским дномThermo Scientific3711
ONE-Glo Luciferase Assay System PromegaE6120
RPMILonzaBE12-918F
PBS-1x, без Ca2+, Mg2+LonzaBE17-516F
L-Glutamine 200  mMLonzaBE17-605E
FBSLonzaDE14-801F
DMSOSigma-AldrichD8418
Коллекция Spectrum (составная библиотека)MicroSource Discovery SystemsN/A
Tecan Freedom EVO200 робот /A
Tecan F200 ТеканН/Д
Многопланшетный считыватель Tecan N

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Schwanhäusser, B., et al. Global quantification of mammalian gene expression control. Nature. 473 (7347), 337-342 (2011).
  2. Tebaldi, T., et al. Widespread uncoupling between transcriptome and translatome variations after a stimulus in mammalian cells. BMC Genomics. 13 (1), 220(2012).
  3. Mitchell, S. F., Parker, R. Principles and properties of eukaryotic mRNPs. Mol. Cell. 54 (4), 547-558 (2014).
  4. Fu, Y., Dominissini, D., Rechavi, G., He, C. Gene expression regulation mediated through reversible m6A RNA methylation. Nat. Rev. Genet. 15 (5), 293-306 (2014).
  5. Matoulkova, E., Michalova, E., Vojtesek, B., Hrstka, R. The role of the 3’ untranslated region in post-transcriptional regulation of protein expression in mammalian cells. RNA Biol. 9 (5), 563-576 (2012).
  6. Sidarovich, V., Adami, V., Quattrone, A. A Cell-Based High-Throughput Screen Addressing 3’ UTR-Dependent Regulation of the MYCN Gene. Mol. Biotechnol. 56 (7), 631-643 (2014).
  7. Cheung, N. -K. V., Dyer, M. A. Neuroblastoma: developmental biology, cancer genomics and immunotherapy. Nat. Rev. Cancer. 13 (6), 397-411 (2013).
  8. Hughes, J. P., Rees, S., Kalindjian, S. B., Philpott, K. L. Principles of early drug discovery. Br. J. Pharmacol. 162 (6), 1239-1249 (2011).
  9. Herbst, J., et al. Multiplexing a high-throughput liability assay to leverage efficiencies. Assay Drug Dev. Techn. 7 (3), 294-303 (2009).
  10. van Olst, E. S. iebring-, et al. Affordable luciferase reporter assay for cell-based high-throughput screening. J. Biomol. Screen. 18 (4), 453-461 (2013).
  11. Baker, J. M., Boyce, F. M. High-throughput functional screening using a homemade dual-glow luciferase assay. J. Vis. Exp. (88), (2014).
  12. Malo, N., Hanley, J. A., Cerquozzi, S., Pelletier, J., Nadon, R. Statistical practice in high-throughput screening data analysis. Nat. Biotechnol. 24 (2), 167-175 (2006).
  13. Hitti, E., et al. A versatile ribosomal protein promoter-based reporter system for selective assessment of RNA stability and post-transcriptional control. RNA. 16 (6), 1245-1255 (2010).
  14. Oikonomou, P., Goodarzi, H., Tavazoie, S. Systematic identification of regulatory elements in conserved 3’ UTRs of human transcripts. Cell Rep. 7 (1), 281-292 (2014).
  15. Gandin, V., et al. Polysome fractionation and analysis of mammalian translatomes on a genome-wide scale. J. Vis. Exp. (87), (2014).
  16. Conne, B., Stutz, A., Vassalli, J. D. The 3’ untranslated region of messenger RNA: A molecular “hotspot” for pathology. Nat. Med. 6 (6), 637-641 (2000).
  17. Cheneval, D., Kastelic, T., Fuerst, P., Parker, C. N. A review of methods to monitor the modulation of mRNA stability: a novel approach to drug discovery and therapeutic intervention. J. Biomol. Screen. 15 (6), 609-622 (2010).
  18. Pascale, A., Govoni, S. The complex world of post-transcriptional mechanisms: is their deregulation a common link for diseases? Focus on ELAV-like RNA-binding proteins. Cell. Mol. Life Sci. 69 (4), 501-517 (2012).
  19. Michalova, E., Vojtesek, B., Hrstka, R. Impaired pre-mRNA processing and altered architecture of 3’ untranslated regions contribute to the development of human disorders. Int. J. Mol. Sci. 14 (8), 15681-15694 (2013).
  20. Bhattacharyya, A., Trotta, C. R., Peltz, S. W. Mining the GEMS--a novel platform technology targeting post-transcriptional control mechanisms. Drug Discov. Today. 12 (13-14), 553-560 (2007).
  21. Peltz, S. W., Welch, E. M., Trotta, C. R., Davis, T., Jacobson, A. Targeting post-transcriptional control for drug discovery. RNA Biol. 6 (3), 329-334 (2009).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Post transcriptional Regulation3 UTR ScreeningLuciferase Reporter AssayHigh throughput ScreeningChemical ModulatorsCounter ScreeningDisease relevant Cell LineStable IntegrationCompound LibraryFold Change Analysis

Похожие статьи