Высокопроизводительный скрининг для химических модуляторов посттранскрипционно регулируемых генов

Summary

Здесь мы описываем анализ репортерного гена на основе клеток как ценный инструмент для скрининга химических библиотек на наличие соединений, модулирующих механизмы посттранскрипционного контроля, осуществляемые через 3' UTR.

Abstract

И транскрипции и пост-регуляция транскрипции имеют огромное влияние на экспрессию генов. Тем не менее, общепринятые на основе клеток методы скрининга сосредоточиться на регуляции транскрипции, являясь, по сути, направленные на выявление промотора таргетирования молекул. В результате, после транскрипции механизмы в основном раскрыты в экспрессии генов развития целевых лекарств. Здесь мы опишем клеточном анализе, направленную на изучение роли нетранслируемой области (3 '3 УТР) в модуляции судьбе своего мРНК, и в идентификации соединений, способных изменить его. Анализ основан на использовании люциферазы репортерного конструкта, содержащего 3 'UTR из интересующего гена стабильно интегрирован в болезнь релевантных клеточной линии. Протокол разделен на две части, с особым акцентом на первичном скрининге, направленной на идентификацию молекул, влияющих на активность люциферазы после 24 ч обработки. Вторая часть протоколаописывает против скрининга необходимо разделить соединения, модулирующие активность люциферазы в частности, путем УТР в 3 '. В дополнение к подробным протокола и репрезентативные результаты, мы обеспечиваем важных соображений о развитии анализа и проверки на попадание (ов) на эндогенной мишени. Описано на основе клеток репортер ген анализ позволит ученым идентифицировать молекулы, модулирующие уровни белка с помощью пост-транскрипционных механизмов, зависящих от 3 'UTR.

Introduction

В течение длительного периода транскрипции регуляции экспрессии генов считалось, играть существенным, если не исключительную роль в области контроля над производством белка. Накопленные данные, однако, показывает, что после транскрипции регулирование способствует столько же, если не более, регуляции транскрипции, чтобы определить клеточный белок обилие ^1,2. Посттранскрипционных контроль экспрессии генов является гораздо более сложным и сложным, чем это было на первый взгляд. В самом деле, все различные этапы пост-контроля транскрипции появились, чтобы быть регламентированы, в том числе процессинга мРНК, локализации, оборота, перевод ^3, а также н....

Protocol

ПРИМЕЧАНИЕ: пропускная способность таких систем анализа зависит от доступного HTS лабораторного оборудования. Этот протокол облегчается EVO 200 робота Tecan Freedom, который выполняет наливных в формате 96-луночного. Миниатюризация в формат 384-а также возможно. Роботизированная система обработки жидкости расположен под колпаком с ламинарным потоком с целью поддержания асептических условий во всех экспериментальных этапов. Если нет жидкого обработки автоматизации не доступен, протокол может быть легко адаптирована к форме низкой пропускной способности.

Первичного скрининга

1. День 1: Подготовка и клеток семян

....

Results

Использование описанного подхода мы провели скрининг с 2000-библиотеки соединений для потенциальных модуляторов посттранскрипционных контрольных механизмов, оказываемое через 3 'UTR гена MYCN. Рисунок 3 иллюстрирует результаты первичного скрининга на примере одной библиотеке пластины. Люциферазы сигнала отображается как процент обработанных носителем контрольных получали путем измерения активности люциферазы в трех повторах пластин CHP134-mycn3UTR клетках, обработанных соединений в одной библио.......

Discussion

Этот протокол описывает клеточный анализ репортерного гена, направленный на идентификацию модуляторов, нацеленных на 3'-UTR-зависимые посттранскрипционные процессы. Он включает в себя первичный скрининг и контрскрининг и, при необходимости, может сопровождаться анализом цитотоксичности. Результатом первичного скрининга является ряд ценных соединений-кандидатов, воспроизводимость и специфичность которых дополнительно подтверждаются при контрскрининге.

Идентификация первичных попаданий основана .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Планшет для культуры 96-луночный белый	PerkinElmer	6005688
StorPlate 96-луночный U-образный дно (планшет для разведения)	PerkinElmer	6008190
100 мл одноразовый корыто для реагентов	Tecan	10 613 048
300 мл одноразовый роботизированный резервуар	VWR	PB12001301
Роботизированные наконечники DITI 50  μ l Стерильные	наконечники Tecan	30038607
робота DITI 200  μ l Стерильный	Tecan	30038617
Matrix 1,4 мл 2D с штрих-кодом, пробирки с плоским дном	Thermo Scientific	3711
ONE-Glo Luciferase Assay System	Promega	E6120
RPMI	Lonza	BE12-918F
PBS-1x, без Ca2+, Mg2+	Lonza	BE17-516F
L-Glutamine 200  mM	Lonza	BE17-605E
FBS	Lonza	DE14-801F
DMSO	Sigma-Aldrich	D8418
Коллекция Spectrum (составная библиотека)	MicroSource Discovery Systems	N/A
Tecan Freedom EVO200 робот		/A
Tecan F200	Текан	Н/Д