Методическая статья

Са изображений

12.4K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/52588

⸱

6 мая 2015 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Institute for Ophthalmic Research, University of Tübingen, 2Graduate School of Cellular & Molecular Neuroscience, University of Tübingen, 3Bernstein Centre for Computational Neuroscience, University of Tübingen, 4Molecular Genetics Laboratory, University of Tübingen, 5Centre for Ophthalmology, University of Tübingen

В этой статье

Краткое содержание

Мы опишем протокол для мониторинга динамики Ca 2+ в аксонов фоторецепторов колбочек, используя препарат ломтик экс-естественных условиях сетчатки мыши. Этот протокол позволяет комплексные исследования конус Са 2+ сигналов в качестве важного млекопитающих модельной системы, мышь.

Аннотация

Фоторецепторов сетчатки конуса (конусов) служат дневного видения и основу цвета дискриминации. Они подвергаются дегенерации, часто приводит к слепоте во многих заболеваний сетчатки. Кальций (Са 2+), ключевой вторичный мессенджер в передаче сигналов фоторецепторов и метаболизма, было предложено быть косвенно связаны с дегенерацией фоторецепторов в различных моделях на животных. Систематически изучая эти аспекты конуса физиологии и патофизиологии была затруднена из-за трудности электрически записи с этих маленьких клеток, в частности, в мыши, где сетчатка доминируют стержневых фоторецепторов. Чтобы обойти эту проблему, мы установили Ca 2+ протокол изображения двухфотонный помощью мыши трансгенной линии, которая выражает генетически закодированного Са 2+ биосенсора TN-XL исключительно в конусах и может быть гибридных моделей с мыши для дегенерации фоторецептора. Протокол, описанный здесь, включает подготовку вертикальных секций (R20; ломтики ") на сетчатке мышей и оптических изображений легких стимулирования, вызвали изменения в конус Са 2+ уровня. Протокол также позволяет "в-ломтик измерения" абсолютных концентраций Са 2+; как запись может следовать калибровки. Этот протокол позволяет исследования в функциональных свойствах конуса и, как ожидается, внести свой ​​вклад в понимание конуса Са 2+ сигналов, а также потенциального участия Са 2+ в фоторецепторов смерти и дегенерации сетчатки.

Введение

Видение начинается с активации светло-индуцированной фототрансдукции каскада в фоторецепторов сетчатки. Род фоторецепторы позволяют зрение на низких уровнях освещенности, в то время как конус фоторецепторов посредником цвета и высоким разрешением дневного видения. Многие фоторецепторов-специфических генов подвержены мутации, которые приводят к дегенерации этих клеток. Количество молекулярных маркеров, связанных с потерей фоторецепторов были идентифицированы 1, но до сих пор подробные молекулярные механизмы и последовательность событий, остаются неясными. Измененные Са 2+ гомеостаз предположил, чтобы быть триггером фоторецепторов гибели клеток, гипотеза поддерживается регуляцию активности Са 2+ -зависимых протеаз калпаина типа в процессе дегенерации 2,3. Тем не менее, на сегодняшний день, эта гипотеза не подкреплены физиологических измерений Ca 2+. Несоответствия в нескольких исследованиях о влиянии Ca 2+ антагонистов в рекишечные заболевания более осложняется участие Са 2+ в гибели клеток 4-6, призывая методов оценки непосредственно Са 2+ в млекопитающих фоторецепторов колбочек.

Ранее большинство электрических записи и исследования изображений Ca 2+ были проведены в амфибий и рептилий моделей из-за легкого доступа к конусов 7-9. Тем не менее, млекопитающих фоторецепторов физиология может отличаться от не-млекопитающих 10 и особенно в контексте человеческого наследственного дегенерации сетчатки, лучшее понимание млекопитающих фоторецепторов физиологии ключом к развитию инновационных методов лечения. Многие модели мыши, имитирующие заболеваний сетчатки человека имеются, но мало известно о Ca 2+ динамики в конусах мыши 11. Электрические методы не подходят для высокой пропускной записей из конусов, в частности, не у мышей, где прутки (~ 97%) значительно больше, чем конусы (~ 3%) 12 . Кроме того, чувствительные электрофизиологические методы, такие как цельноклеточных записей патч-зажим беспокоить внутриклеточный среду и предоставить данные о Са 2+ токов, но не на абсолютных внутриклеточной концентрации Са 2+. Следовательно, несмотря на более низкую временным разрешением, изображения является методом выбора при решении вопросов о конусных Са 2+ динамики. Ключевой вопрос с изображениями, как выборочно пометить конусы с флуоресцентным Ca 2+ индикатор красителя. Правильное компартментализация и сотовый специфика трудно достичь, "основная загрузка" синтетический Са 2+ индикатор красителей в тканях. Как следствие, помеченных конусов, стержней 13,14 и Müller глиальные клетки не могут быть надежно отличается. Кроме того, синтетические красители, как правило, утечка из клеток, предотвращая длительные записи в соответствии условий. Кроме того, синтетические загрузки Ca 2+ показатели по своей форме АМ-эфира является проблематичным, поскольку он требует деtergents (например, ДМСО) и генерирует формальдегид 15. Для абсолютных измерений Са 2 +, логометрических показатели являются обязательными. Тем не менее, лучшими в настоящее время синтетические пропорциональный показатель Fura-2 требуется возбуждающего света в диапазоне от 700 до 760 нм (для двухфотонном возбуждении), который, в зависимости от его интенсивности, могут сами по себе стимулировать конусы, и, таким образом, препятствовать исследования конус Са 2+ динамика в физиологических условиях освещения.

В отличие от синтетических красителей, генетически закодированные Са 2+ показатели могут быть выражены в типа селективного образом клеток. Они не вытекать из клеток, и, следовательно, если избегать отбеливание, длительные и надежные измерения логометрических возможны. Типа селективный сотовый выражение Ca 2+ биосенсоров, в сочетании с двумя-фотонной микроскопии, представляет собой мощный инструмент для оценки и изучения внутриклеточной Са 2+ под значительной степени физиологических условиях 13,16,17 . Здесь мы опишем протокол для изучения световой раздражитель вызывал-конус Са 2+ динамика в трансгенных Ca 2+ биосенсора мыши линии (HR2.1: TN-XL), которая выражает лада на основе Ca 2+ биосенсора TN-XL 18 выборочно в конусах, в человеческом красный опсина промоутер HR2.1 19. Чтобы получить доступ к конусные клеммы, был использован препарат экс-естественных ломтик 20. Протокол был уже успешно используется в трех исследованиях на функции конуса у здоровых мышей 10,21,22. Кроме того, протокол позволяет изучать конуса Са 2+ сигналов в конкретных генетических заболеваний, например, путем скрещивания модели мыши для наследственной дегенерации сетчатки с HR2.1: мышей ТН-XL.

Протокол

Все процедуры на животных были проведены придерживаясь принципов и законов для защиты животных, определенных Федеральным правительством Германии и утвержденных институциональной защиты животных комитета в Университете Тюбингена.

1. Животные модели

  1. HR2.1: TN-XL Са 2+ биосенсора мыши
    1. Используйте трансгенного HR2.1: TN-XL мыши линии выражения Ca 2+ биосенсора TN-XL выборочно конуса фоторецепторов 10. Используйте 3 - 6 недель мышей обоего пола поднятой со стандартным 12 часов день / ночь ритм.

2. Препарирование сетчатки

  1. Физиологический раствор
    1. Подготовьте свежемолотый 2 л внеклеточный раствор, содержащий 125 мМ NaCl, 2,5 мМ KCl, 1 мМ MgCl 2, 1,25 мМ NaH 2 PO 4, 26 мМ NaHCO 3, 0,5 мМ L-глутамина и 20 мМ (+) глюкозы. Смешайте все ингредиенты до полного растворения.
    2. "Пузырь" внеклеточный растворс carboxygen (95% O 2, 5% СО 2) в течение 5 - 10 мин. Добавить CaCl 2 до концентрации 2 мМ.
    3. После барботирования внеклеточный раствор, измерить его рН. РН должно быть 7,4, в противном случае вполне вероятно, что были допущены ошибки в процессе приготовления раствора. Держите постоянную температуру кип скорость и решение всей эксперимента, чтобы обеспечить постоянное значение рН.
    4. Отделите акции в 2 колбы, по одному для сетчатки рассечение и один для установки записи (перфузии).
  2. Энуклеации глаза и изоляция сетчатки (5 - 10 мин)
    1. Поддерживать тусклый красный освещение в рабочей зоне для энуклеации. Используйте светодиоды с длиной волны максимума излучения 650 нм (или больше), чтобы избежать отбеливания конусов во время вскрытия.
    2. Темно-адаптировать мышь в течение 2 ч, поставив свою клетку в хорошо проветриваемом, защищенном от света, окна для того, чтобы шишки были полностью информированы в момент записи.
    3. Анестезировать мышь под laboratoRy капот с изофлуран (5%) с использованием испарителя и газонепроницаемый контейнер, который содержит стандартный клетку мыши. Внимательно следуйте указания производителя при обращении с испарителя. Используйте перчатки и маску, чтобы уменьшить воздействие аллергенов.
    4. Используйте бинокулярный микроскоп с 10 - 40-кратном увеличении для вскрытия.
    5. Жертвоприношение анестезированной мышь путем обезглавливания.
    6. Для ориентации, отмечают в верхней части каждой глаз (= спинной) с водонепроницаемым пером. Следите ли с помощью левой или правой глаза.
    7. Снимите глаз тщательно, используя изогнутые ножницы путем разрезания зрительный нерв за глазное яблоко. Для вскрытия, передача глазного яблока в чашке Петри, содержащей недавно carboxygenated внеклеточный раствор. Для передачи глазное яблоко, держите его зрительного нерва пень.
    8. Пирс глаз в любой точке вдоль границы между роговицей и склерой (т.е., на зубчатый край) с резким инъекционной иглой.
    9. Держите евы в склеры с парой щипцов и аккуратно вставьте один ножницы лезвие в отверстие, сделанное в предыдущем шаге. Вырезать по зубчатый край, чтобы отделить переднюю часть глаза (роговицы, хрусталика, стекловидного тела) от задней части (наглазника). Сокращение окуляр радиально (в сторону диска зрительного нерва) в положении ручки отметки, чтобы указать положении лежа на спине на сетчатке.
      Примечание: Подготовлено Таким образом, наглазники могут храниться в постоянно carboxygenated решения для последующего использования.
    10. Поверните окуляр в чашке Петри, так что спинной сократить точки от себя. Захват склеры на левой и правой стороне наглазник с парой щипцов каждого вставив кончики щипцы между сетчатки и склеры.
    11. Снять сетчатки, осторожно переворачивая склеры часть наглазник. Наконец, вырезать зрительного нерва с помощью микро рассекает ножницы, чтобы освободить сетчатку от склеры.
      Примечание: Это важный шаг. Избегайте повреждения сетчатки (например, потрогательно и сжимая ее щипцами).
    12. Держите один из краев сетчатки с парой щипцов и аккуратно убрать мусор и стекловидное тело с поверхности сетчатки, используя вторую пару щипцов. При сетчатки поверхность чистая, использовать микро рассекает ножницы, чтобы сделать три дополнительных коротких и радиальные разрезы (примерно каждые 90 °). Эти сокращения позволяют тщательно сгладить сетчатки с фоторецепторов стороной вниз в чашке Петри (рис 1А).
  3. Подготовка фрагмент (10 - 15 мин)
    1. Заранее подготовить мембраны нитроцеллюлозы фильтр для сетчатки нарезки стекла и кавер-квитанции для монтажа ломтики и передачи их в записи камеры. Вырезать нитроцеллюлозный фильтр мембраны в приблизительно 10 х 5 мм размера прямоугольные куски с помощью ножниц. Вырезать покровные в приблизительно 10 х 5 мм размера прямоугольные куски, используя стекольщик.
    2. Медленно опускайте стекла слайд в внеклеточный раствор близок кткань. Осторожно потяните сетчатки на стекле со стороной ганглиозных клеток до захватывая его на самом краю, используя пару щипцов. Этот процесс снижает механические повреждения и складывание ткани.
    3. Выберите область сетчатки, которая связана с соответствующей научно-исследовательской вопрос (см также обсуждение). Помните, долго отсечения в шаге 2.2.9 отмечает спинной сетчатки половину (рис 1А). Сокращение прямоугольную, приблизительно 1 х 2 мм размера кусок из выбранной области сетчатки, используя изогнутый скальпель лезвием. Протрите излишки раствора вокруг ткани.
    4. Поместите мембрану фильтра в верхней части куска сетчатки так, что сторона ганглиозных клеток прилипает к мембране. Сразу же добавить каплю внеклеточной среды на мембрану, чтобы прочно прикрепить ткань с мембраной.
    5. Передача мембраной установлен ткани сетчатки к камере, содержащей нарезки свежего внеклеточный раствор.
    6. Вырезать сетчатки в вертикальных срезов 200 мкмТолщина (Фигура 1В) с использованием свежей лезвие бритвы, прикрепленный к тканевой измельчитель 23. Изменить лезвие для каждого сетчатки кусок.
      Примечание: Блок лезвий бритвы должно быть идеально выровнены с поверхностью камеры нарезки нижней таким образом, чтобы вся мембрана разделяет одновременно, как обозначено "нажав" звук при резке - в противном случае лезвие может согнуть и повредить срез.
    7. Клей одного мембраной установлен кусочек для стеклянной крышкой-скольжения с применением высокого вакуума смазку на мембране заканчивается только (Рис 1С). Держите поверхности стекла ниже сетчатки обезжиренными.
    8. Держите покровного монтажа ломтики покрытые капли внеклеточного раствора в удерживающей камере - замкнутый, защищенном от света контейнер, например, чашку Петри с крышкой, покрытой алюминиевой фольгой - в атмосфере carboxygen при комнатной температуре. Представьте carboxygen путем пропускания небольшой резервуар для воды, чтобы сохранить атмосферу в проведениикамера увлажняется; это предотвращает ломтики от высыхания.
    9. Разрешить ломтиками, чтобы отдохнуть в удерживающей камере в течение 10 - 15 мин перед их перемещением (по одному) к записи камеры. Ломтики можно поддерживать до 4-5 часов в удерживающей камере при комнатной температуре (~ 21 ° С).

3. Двухфотонное Ca 2+ изображений

  1. Двухфотонное микроскопии
    1. Используйте Movable Цель микроскоп (MOM) -типа двухфотонную микроскопа. Оба дизайн и изображений процедуры MOM были описаны ранее 24 подробнее см также 10,21,25 (для источников и компаний, таблица 1).
      Примечание: Любой вертикально двухфотонную микроскоп, который выполняет следующие минимальные требования могут быть использованы: Он должен быть оснащен (а) импульсного лазера перестраиваемого до ~ 860 нм, (б) как минимум двух одновременно приобретенных флуоресценции каналов, (с ) фильтры для ECFP и флуоресценции цитрин (D)свет стимулятор (для возможных конструкций, см 24,26) и (е) программное обеспечение, которое позволяет записывать время истек последовательности изображений с частотой кадров, достаточной для решения Ca 2+ сигналы, представляющие интерес.
    2. Начало системы визуализации двухфотонного, как указано производителем. Строго следовать рекомендациям лазерной безопасности Фонда. Начните лазер и настроить его на ~ 860 нм.
    3. Перевести кусочек от удерживающей камеры в камеру записи и немедленно начать перфузии с внеклеточной carboxygenated решения. Поддержание скорости потока перфузии 2 мл / мин и температуре 37 ° С в камере записи.
    4. Используйте 20X 0,95 NA погружением в воду цели. Если возможно, используйте ПЗС-камеры в сочетании с инфракрасной светодиодной ниже записи камеры, чтобы найти кусочек сетчатки (рис 2). В противном случае найдите кусочек, используя два-Фотон изображений (см 3.1.5).
    5. Переключение в режим визуализации двух фотонов, чтобы посмотреть выражение биосенсора. Включитьдва канала обнаружения для флуоресцентной визуализации ECFP и цитрина.
    6. Используйте программное обеспечение получения изображений, который управляет двухфотонную микроскоп для сканирования и выберите строку конуса терминалов для записи (рис 3а). Набор получения изображения 128 х 16 пикселя изображений (31,25 Гц) или аналогичной конфигурации. Ограничить область сканирования, чтобы конус терминалов, чтобы избежать отбеливания фотопигментов в наружных сегментах.
      Примечание: Для TN-XL датчика кальция (τ = ~ 0,6 сек для связывания Са 2+, τ = ~ 0,2 сек для Ca 2+ развязывание, см 16) с минимальной скоростью кадров ~ 8 Гц рекомендуется.
  2. Свет стимуляция и запись
    1. Используйте суб-этап полного светового поля стимулятор, как описано в другом месте, чтобы 10,21,26 выполните следующие действия.
      Примечание: простое решение для полного светового поля стимулятора является использование двух полосовых-отфильтрованные светодиодов (например, "синий": 360 ВР 12, "зеленый": 578 ВР 10)которые соответствуют длины волны чувствительности мыши конусов, но в то же время не перекрываются с фильтров, используемых для регистрации флуоресценции (ср. 3.2.4). Свет от светодиодов фокусируется конденсатора через нижнюю часть записи камеры (рисунок 2). Для получения подробной информации о данной конструкции стимулятор, его калибровки интенсивности света используются и вызванных ставки фото-изомеризации конуса, см 10,21,26.
    2. Включите лазер и позволит шишки, чтобы приспособиться к лазерной сканирующей и стимулом фонового света (20 - 30 сек, см также потенциальные ловушки), прежде чем представлять световых раздражителей (см 3.2.3) или применения фармакологических средств.
    3. Начать презентацию произвольных раздражители (например, вспышки света, как показано на рисунке 3B, C). В случае стимулятора, описанной в пункте 3.2.1, генерировать стимулы посредством модуляции интенсивности двух светодиодов с течением времени с использованием микропроцессорной плате под контролем специального программного обеспечения (дляПодробнее см 10,21,26).
    4. Начало записи двух каналов флуоресценции (например, на 483 нм для "голубой" лобзики доноров ECFP и при 535 нм для «желтой» FRET-акцептора;. Для спецификации см таблицу 1) одновременно с использованием соответствующего программного обеспечения получения изображений (см также 3.1 0,6). Например, в случае вспышки света (Фиг.3В, С), запись по меньшей мере, 8 - 10 стимулирующих презентаций (испытаний).
  3. Калибровка "В-среза" Ca 2+
    1. Запись Са 2+ сигналы в конусных терминалов (как описано в 3.1.6 и 3.2.4) и извлекать базового уровня Ca 2+ в наборе конусов (как описано в 3.4).
    2. Переключатель в положение "свободного Ca 2+" ​​внеклеточной среде с 5 мкМ иономицина (растворенного в ДМСО) и 10 мМ EGTA (или, альтернативно, BAPTA) добавили. Запись конус терминалы снова каждые 5 мин, чтобы определить минимальное соотношение флуоресценции (R мин), т.е. соотношение в (ближайшем) отсутствие внутриклеточного Ca 2+. Это может занять от 15 - 30 мин.
      Примечание: Система перфузии требуется, что позволяет переключение между различными резервуарами.
    3. Переход к внеклеточной среде с 5 мкМ иономицина (растворенного в ДМСО) и 2,5 мМ Ca 2+. После инкубационного периода от 5 мин, запись шишки снова каждые 5 мин, чтобы измерить максимальную соотношение флуоресценции (R макс), то есть соотношение в присутствии насыщающих концентраций внутриклеточного Ca 2+. После Ionomycin приложение, это может занять от 3 ​​- 15 мин для отношения Ca 2+, чтобы стать стабильным.
      Примечание: Воздействие ломтики с высокой Са 2+ и Ionomycin в течение длительного периода в конечном итоге может привести к повреждению клеток. Включить только клетки в анализе, которые сохраняют свою нормальную морфологию. Концентрации (т.е., ЭДТА,, иономицином), возможно, потребуется адаптировать. Для более подробной информации о калибровке Ca 2+Протокол см 13,17.
  4. Анализ данных
    Примечание: Используйте для обработки изображений и анализа данных пакет программного обеспечения, совместимого с соответствующим программным обеспечением микроскопа и способной работать скрипты анализа пользовательских.
    1. Загрузите файл данных изображений и рисовать регионы интереса (трансформирования) вокруг каждого конуса терминала (Рисунок 3А). Для каждого кадра, средней интенсивности флуоресценции в пределах ROI и вычитать фоновой флуоресценции, перед вычислением отношения (R) между FRET-акцептора (цитрин) и доноров (ECFP) флуоресценции (R = F A / F D; Рисунок 3B, C). Это отношение, как правило, используется в качестве прокси-сервера для относительной внутриклеточной концентрации Ca 2+, но после калибровки (см 3.3), а также абсолютные концентрации можно оценить (см 3.4.3).
      Примечание: плодоножки может быть признано их расположения в наружной плексиформной слоя и их морфология (несколько уплощенная "капли" меньше чем конусаsomata, расположенный на конце конуса аксона).
    2. Средние испытания раздражитель (рис 4А). Экстракт параметры отклика от усредненных следов (фиг.4В), таких как Са 2+ базовом уровне (R) основания до световой стимуляции, пиковой амплитуды (R AMP) и площади под кривой (R A) в качестве мер по размеру отклика. Кроме того, экстракт кинетики реагирования из усредненных следов, таких, как повышение отклика (т нарастания) и времени затухания (т затухания) (= соответствующих интервалов времени между 20% и 80% R усилителя, см иллюстрацию на рис 4B). Для более подробной информации о том, как определить эти параметры, см 10.
    3. Рассчитать оценку абсолютного конуса Са 2+ концентрации на основании измерений из шагов 3.3.1-3.3.3. Используйте отношения для минимального и максимального Ca 2+ концентрации, R мин и макс R, соответственно, донор флуоресценции в Са 2+ -связанного (F D, Са переплете) и -unbound (F D, Са-бесплатно) состояние, а также в естественных условиях константа диссоциации (K d = 0,77 см 16) для TN-XL с следующее Уравнение (аналог 27):

figure-protocol-1

Результаты

Объединив вертикальные ломтики (рисунок 1), приготовленные из HR2.1: TN-XL мыши сетчатки с двух фотонов томографии (рис 2), мы были в состоянии выполнить логометрических измерения светового стимула, вызвали Ca 2+ сигналов в аксонов фоторецепторов конуса , Этот подход представляет собой значительное улучшение в доступе и визуализации мыши конусов над уже существующими методами оптических изображений с синтетическими Са 2+ показателей. Например, конус-специфическая экспрессия генетически закодированного логометрической Ca 2+ биосенсора TN-XL значительно облегчил идентификацию конуса аксонов (см трансформирования на фиг.3А). Таким образом, наш протокол устраняет риск записи сигналов неясного происхождения, как, например, "смешанные" сигналы с обоих вкладов от конуса и стержень аксонов.

Наш подход позволяет решения одного пробные ответов на уровне INDIVIдвойной конус аксона. Свет-вызывала экструзии Са 2+ из конуса терминала отмечен увеличением и уменьшением донора и акцептора флуоресценции, соответственно (фиг.3В). Снижение коэффициента флуоресценции (R) соответствует экструзии Са 2+ из конуса терминала (рис 3C), вызванного светоиндуцированного гиперполяризации конуса и последующего закрытия напряжения закрытого Са2 + -каналов. Поскольку несколько конуса аксонов может контролироваться одновременно (3А), сбора данных является очень эффективным и сотни ответов конуса Са 2+ могут быть собраны в одном эксперименте. По оценке этих ответов количественно (фиг.4), конус Са 2+ сигналы могут быть сравнены и оценены в диапазоне условий (см обсуждение).

Это часто бывает достаточно, чтобы использовать соотношение между FRET-акцептора (цитрин) и -donor (ECFP) флуоресценции(F / F D; подробнее см 3.4) в качестве относительной меры внутриклеточного Са 2+ уровня. Тем не менее, всякий раз, когда это необходимо, соотношение может быть откалиброван для получения абсолютных внутриклеточные концентрации Ca 2+ ([Ca 2+]) (рисунок 5). В фоновой подсветки, используемой в этом протоколе (подробнее см 10 и Рисунок 3 легенда), калибровка дали оценку абсолютной отдыхает [Ca 2+] в "дикого типа" HR2.1: TN-XL мыши конус терминалы 243 ± 159 нМ (среднее ± стандартное отклонение), который находится в пределах диапазона, указанного на мышах, описанных в литературе 11.

figure-results-1
Рисунок 1. Подготовка вертикальных сетчатки ломтиками. () Изолированные и плоскими сетчатки готовы для нарезки. (Б) Прямоугольный кусок сетчатки (си ее красный квадрат в A) установлен на фильтровальной бумаге мембраны (темно-серый), после нарезки. (С) Вид сверху мембраны монтажа сетчатки срез закрепленного на покровного стекла с использованием смазки. (D) Схематическое изображение части сетчатки срез (см красный флажок в C). Фоторецепторы конуса указаны в зеленый. В, брюшной; D, спинной; N, носовые; Т, временная; ОС, наружный сегмент; ОНЛ, наружный ядерный слой; OPL, внешний сетчатый слой; INL, внутренний ядерный слой; IPL, внутренний слой сетчатого; ВКТ, ганглиозных клеток слой. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

figure-results-2
Рисунок 2. Двухфотонное изображений сетчатки ломтиками: Иллюстрация конфигурации записи Топ:. Вода погружения объектив фокусировки будетутра лазера сканирования (красный вниз стрелка) в сетчатку, и сбора испускаемого флуоресценции (стрелки вверх). Объектив также собирает передается инфракрасный свет от светодиода, установленного освещения ниже конденсатора при визуализации срез с помощью ПЗС-камеры Центр:.. Сетчатке ломтик установлен в записи камеры и перфузии внеклеточный раствор Bottom: Линза фокусировки света от светодиодов стимуляции (и инфракрасный светодиод для изображений ПЗС-камеры) через прозрачное дно камеры записи в ткани сетчатки. ИК-светодиод, ИК-светодиод; ПЗС, прибор с зарядовой связью; ВР, полосовой. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

figure-results-3
Рисунок 3. Свет-Вызываниеответы D Ca 2+ в аксонов терминалов мыши конуса фоторецепторов. () Слева: Записи сосредоточены на синаптических терминалов (красная коробка) колбочек (зеленый) в сетчатке ломтиками право:. Пример для записанной области с 7 отдельных терминалов. Флуоресценции был записан с помощью двух каналов:. Один для лада-акцепторной цитрин (вверх; 535 BP 50) и один для лада-доноров ECFP (внизу; 480 BP 32) (Б) светло вызвали изменения в цитрин (F) и ECFP флуоресценции (F D), записанные в одной ROI. ответы (C) Ca 2+ (как отношение F A / F D) конусной терминала серии 1 сек ярких световых вспышек в 5-секундными интервалами. ROI, область интересов; ВР, полосовой фильтр; Ж, интенсивность флуоресценции; Au, условные единицы; FRET, Ферстер резонанс переноса энергии; ECFP, усиливается голубой белок флуоресценции. Интенсивность стимула (как рСкорость Хото-изомеризации в 10 3 · Р · с -1 за конуса):. 13,0 и 12,8 для м- и S-опсинов, соответственно, добавляя на уровне фона (= светодиоды выключены, лазерное возбуждение сканирования) ~ 10 Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

figure-results-4
Рисунок 4. Примерная количественный анализ светло-вызванных конуса Са 2+ ответов () светло вызвало Са 2+ ответы (как ΔR) из одного терминала конуса (отдельные исследования: серые следы, п = 16; средний:. Черный след ) (B) Параметры определяются для среднего Ca 2+ ответ:. Опираясь Ca 2+ уровня (R базу), представляющий базовую перед световой стимуляции, размер ответа в АРEA-под-кривой (R A) и амплитудой (R усилителя), кинетики реакции начала (т подъеме, промежуток времени от 20% до 80% от R усилителя) и смещения (т распада, промежуток времени от 80% 20% R усилителя). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

figure-results-5
Рисунок 5. Оценка абсолютной концентрации Ca 2+. Отдых Ca 2+ концентрации ([Ca 2+], как отношение F A / F D), записанного в аксонов 8 конуса в мыши TN-XL (кругов, со средним ± SD) для различных внеклеточных решения: два раза в стандартном внеклеточной среде (Ctrl 1 и 2), а затем с минимальным («нулевой») [Ca 2+] (10 мМ EGTA) апd с высокой [Ca 2+] (2,5 мм), последние два условия в присутствии 5 мкМ иономицином, чтобы уравновесить внеклеточный и внутриклеточный Са 2+. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Обсуждение

Предварительно существующие протоколы, использующие электрофизиологические записи одноклеточных или Ca 2+ изображений с синтетическими люминесцентных индикаторов бороться, чтобы записать Ca 2+ динамику мыши конуса фоторецепторов по ряду технических причин (см введение). Протокол, описанный здесь, позволяет измерять Са 2 + сигналов и даже абсолютных Са 2+ уровня в отдельных, определенных мыши конуса терминалов в эффективной и относительно простой способ.

Этот протокол уже успешно используется в трех исследованиях, касающихся различных аспектов функции конуса в сетчатке здорового мыши. В первом исследовании 10, HR2.1: мышь TN-XL характеризуется использованием иммуногистохимии, ERG записи, двухфотонную Ca 2+ изображений и фармакологию, показывая, что конус-специфическая экспрессия Са 2+ биосенсора не мешает конус анатомия и функция. Во втором исследовании 21, хроматическаяи ахроматические свойства отклика мыши конусов были намечены по сетчатке, демонстрируя поразительные различия в функции конуса между «зеленой» опсина доминируют спинного и "голубой" опсина доминируют вентральной части сетчатки мыши. Эти региональные различия в свойствах конуса соответствует распределение дифференциального контраста в естественной среде (т.е., небо против земли), предполагая, что различные спектральные типы мыши конусов обеспечивают (ближайшем) оптимальной выборки ахроматических контрастов и, таким образом, может предложить эволюционное преимущество. В третьем исследовании 22 обратной обратной связи, который конуса аксонов получают от горизонтальных клеток исследовали. Как и все предлагаемые механизмы обратной связи по горизонтали ячейки действуют на напряжения закрытого Ca 2+ каналов в конусе аксонов 28, конус терминал Са 2+ может служить в качестве прокси для горизонтальных клеток в конусе взаимодействий. Исследование Kemmler и сотрудники 22 опорымнение, что горизонтальные клетки используют сложную систему обратной связи, содержащую несколько механизмов для управления фоторецепторов выпуск глутамата.

Эти исследования показывают универсальность описанного протокола и показать, что она может быть приспособлена к широкому диапазону вопросов относительно функции конус и синаптические цепи. Кроме того, протокол дает возможность изучать местное Ca 2+ сигналов в разных отсеках конуса, в направлении лучшего понимания конуса физиологии. Такое знание важно понять патофизиологические процессы в вырождающихся конусов, в конечном счете, позволит рационального развития потенциальных терапевтических подходов, в частности, для дегенеративных заболеваний, влияющих на конусы.

В HR2.1: TN-XL мыши линии, Ca 2+ биосенсора экспрессируется по всей конуса, за исключением наружного сегмента. Это дает возможность для прямого и логометрической оценки Са 2+ динамическийс отделениями в разных конуса. С изменениями в Са 2+ токи в наружном сегменте отражаются в терминалах через мембранный потенциал и в результате активации напряжения закрытого Са 2+ каналов, процессы в космическом сегменте можно наблюдать косвенно.

Потенциальные ловушки:

Рассечение сетчатки является важным шагом: В мыши, сетчатка отделяется от окуляра, как правило, между наружных сегментов фоторецепторов и пигментного эпителия. Таким образом, светочувствительный наружных сегментов фоторецепторов изолированной сетчатки подвергаются и чрезвычайно чувствительны к механическим повреждениям. Большое внимание должно быть принято, чтобы не повредить, касаясь фоторецепторов сторону с инструментами или путем перемещения ткани боком на клейкой поверхности (например, мембрану фильтра).

Высококачественные сетчатки ломтики могут быть признаны под микроскопом их чистой режущей поверхности ис помощью хорошо организованной фоторецепторов слоя с четко определенными наружных сегментов. Функциональная оценка качества среза может быть сделано быстро мигающий яркий свет стимулы и определения процентного отзывчивых конусов (например, в поле зрения с 10 - 20 конусов). Здесь, качество реакция должна быть оценена путем расчета отношения сигнал-шум (S / N) (амплитуда базового шума до световой раздражитель против амплитуды световой ответ); S / N 2 - 3 следует рассматривать как минимальный порог. Как правило, отбросить кусочки с менее чем 50%, реагирующих конусов. Также ломтики с шишками, которые отображают чрезмерное поведение спонтанной пики (рис 4 в 10) следует выбросить.

Ломтики в записи камеры, которые отвечают вышеупомянутым анатомические и функциональные критерии показывают последовательные ответы в течение 1 - 2 ч (для подробной информации о последовательности реакции, см 10). Потому что ломтики выжить чНаши в удерживающей камере, успешный эксперимент может длиться до 6 часов. Стоит отметить, что существуют некоторые ограничения в отношении к изучению давно, начиная пространственных взаимодействий между конусами и горизонтальными клетками, а нарезка неизбежно разрывает боковые связи в сетчатке глаза сетей. Тем не менее, увеличение толщины сетчатки ломтиками до 300 мкм улучшает эту проблему 22.

Использование вертикальных срезов сетчатки позволяет избежать сканирования светочувствительным конуса наружных сегментов с помощью лазера возбуждения и, таким образом, в значительной степени предотвращает обесцвечивание Opsin (для широкого обсуждения см 10,21). Тем не менее, записанные Са 2+ сигналов зависит не только от световых сигналов, но также получить затронуты фоновой подсветкой компонента, генерируемого лазером возбуждения сканирования. В самом деле, эффективна подсветка в таких двухфотонных экспериментов изображений представляет собой сочетание рассеянного лазерного света, флуоресцентного света, испускаемого записанного CEзаполняет, и любой индикатор стимулом фон компонента. Таким образом, конусы должны иметь возможность адаптировать по крайней мере 20 - 30 с до лазерного сканирования (с фоновой составляющей светового раздражителя включен) перед записью.

Преимущества и применение:

В то время как некоторые приложения для этого конуса Са 2+ -imaging протокола были описаны выше 10,21,22, другие приложения могут быть предусмотрены: Фармакологические исследования в сочетании с конусом Са 2+ изображений может подтвердить Ca 2+ сигнальных путей в конусах и может быть используется для проверки эффективности и потенции наркотиков, предназначенных для различных игроков в Ca 2+ -signaling 10. Тем не менее, ключевым приложение может быть для изучения заболеваний, влияющих на функцию конуса. Многие модели сетчатки дегенерация мыши, имитирующие человеческие болезни имеются. Например, потеря колбочек 1 (CPFL 1) мышь первичной дегенерации конус модель страданиеот мутации Pde6c 29. С другой стороны, стержень дегенерации 1 (ий 1) мыши страдает от мутации Pde6b. В то время как это вызывает основной стержень дегенерацию фоторецепторов 30 раз го 1 поражение стержень завершены, вторичные наборы конус вырождение 1. Скрещивание этих животных с HR2.1: TN-XL линия позволит изучения и сравнения Ca 2+ динамику первичной и вторичной дегенерации конуса и, вероятно, получить ценную информацию о роли Са 2+ во конус гибели клеток. Кроме того, фармакологически индуцированной конуса дегенерации - например, с использованием селективных ингибиторов PDE6 - может служить для идентификации вниз по течению механизмы конус вырождения 10,29,31.

Таким образом, протокол, описанный здесь, позволяет измерять Ca 2+ в субклеточных отсеков мыши конуса фоторецепторов и представляет большие возможности для выявления конуса физиологию в широком диапазонефизиологических и патофизиологических условиях. Кроме того, этот протокол может быть использован для скрининга фармакологических агентов, предназначенных для мешать конус Са 2+ -signaling и тем самым помочь в создании новых методов лечения для конусных заболеваний.

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего раскрывать.

Благодарности

Эта работа была поддержана Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) (Werner Reichardt Centre for Integrative Neuroscience Tübingen, EXC 307 to T.E. and T.S.; KFO 134 to B.W. and F.P.D.), Федеральное министерство образования и научных исследований Германии (BMBF) (BCCN Tübingen, FKZ 01GQ1002 to T.E и T.B.) и Европейский союз (DRUGSFORD; HEALTH-F2-2012-304963 М.К. и Ф..Д.).

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Высоковакуумная смазкаDow Corning1018817http://www.dowcorning.com
Защитные стеклаR. Langenbrinck24 x 60 мм; http://www.langenbrinck.com
Стеклянные горкиR. Langenbrinck76 x 26 мм; http://www.langenbrinck.com
Лезвия для измельчителя тканейMARTOR KGARGENTAX No. 10440.25 мм; http://www.martor.de
Измельчитель тканейИзготовлен по индивидуальному заказуОсновано на дизайне F. Werblin23, адаптировано Т. Шубертом
Нитроцеллюлозная фильтрующая мембрана сетчатая MerckMilliporeAABG01300Тип фильтра: 0,8 &; m; http://www.emdmillipore.com
Isoflurane CPCP pharmaAP/DRUGS/220/96http://www.cp-pharma.de
UV/зеленый полнофункциональный стимулятор на основе светодиодовCustom-buildдля подробностей, см10Плата
микропроцессора с открытым исходным кодомArduinohttp://www.arduino.cc
Программное обеспечение для обработки изображений CfNTCustom-writtenразработано Майклом Мюумлом; ller, MPI for Medical Research, Гейдельберг,
Германия IgorProWavemetricshttp://www.wavemetrics.com
VC3-4 Система фокальной перфузииALA Scientific Instrumentс 100 μ Наконечник коллектора диаметром М; http://www.alascience.com/
Mai Tai HP DeepSee (Ti:Sapphire laser)Newport Spectra-Physicshttp://www.spectra-physics.com
Микроскоп с подвижным объективом (MOM),
Разработано В. Денком, MPImF, Гейдельберг, Германия		Sutter Instrumentshttp://www.sutter.com/MICROSCOPES/index.html
[header]
XLUMPlanFL 20X/0.95w objectiveOlympushttp://www.olympusamerica.comVaporizer
100 seriesSurgivethttp://www.surgivet.com
Иономицин, Соль кальцияТехнологии жизниI24222http://www.lifetechnologies.com
EGTASigma-AldrichE3889https://www.sigmaaldrich.com
Диметилсульфоксид (ДМСО)Sigma-Aldrich101191250http://www.sigmaaldrich.com
Leica MZ95leica microsystemshttp://www.leica-microsystems.com/

Ссылки

  1. Trifunovic, D., et al. Neuroprotective strategies for the treatment of inherited photoreceptor degeneration. Current Molecular Medicine. 12, 598-612 (2012).
  2. Paquet-Durand, F., et al. Calpain is activated in degenerating photoreceptors in the rd1 mouse. Journal of Neurochemistry. 96, 802-814 (2006).
  3. Paquet-Durand, F., et al. A key role for cyclic nucleotide gated (CNG) channels in cGMP-related retinitis pigmentosa. Human Molecular Genetics. 20, 941-947 (2011).
  4. Frasson, M., et al. Retinitis pigmentosa: rod photoreceptor rescue by a calcium-channel blocker in the rd mouse. Nature Medicine. 5, 1183-1187 (1999).
  5. Bush, R. A., Kononen, L., Machida, S., Sieving, P. A. The effect of calcium channel blocker diltiazem on photoreceptor degeneration in the rhodopsin Pro213His rat. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 41, 2697-2701 (2000).
  6. Pawlyk, B. S., Li, T., Scimeca, M. S., Sandberg, M. A., Berson, E. L. Absence of photoreceptor rescue with D-cis-diltiazem in the rd mouse. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 43, 1912-1915 (2002).
  7. Sampath, A. P., Matthews, H. R., Cornwall, M. C., Bandarchi, J., Fain, G. L. Light-dependent changes in outer segment free-Ca2+ concentration in salamander cone photoreceptors. The Journal of General Physiology. 113, 267-277 (1999).
  8. Choi, S. Y., et al. Encoding light intensity by the cone photoreceptor synapse. Neuron. 48, 555-562 (2005).
  9. Krizaj, D. Calcium stores in vertebrate photoreceptors. Advances in Experimental Medicine and Biology. 740, 873-889 (2012).
  10. Wei, T., et al. Light-driven calcium signals in mouse cone photoreceptors. The Journal of Neuroscience. 32, 6981-6994 (2012).
  11. Johnson, J. E. Jr, et al. Spatiotemporal regulation of ATP and Ca2+ dynamics in vertebrate rod and cone ribbon synapses. Molecular Vision. 13, 887-919 (2007).
  12. Jeon, C. J., Strettoi, E., Masland, R. H. The major cell populations of the mouse retina. The Journal of Neuroscience. 18, 8936-8946 (1998).
  13. Palmer, A. E., Tsien, R. Y. Measuring calcium signaling using genetically targetable fluorescent indicators. Nature Protocols. 1, 1057-1065 (2006).
  14. Paredes, R. M., Etzler, J. C., Watts, L. T., Zheng, W., Lechleiter, J. D. Chemical calcium indicators. Methods. 46, 143-151 (2008).
  15. Tsien, R. Y. A non-disruptive technique for loading calcium buffers and indicators into cells. Nature. 290, 527-528 (1981).
  16. Hendel, T., et al. Fluorescence changes of genetic calcium indicators and OGB-1 correlated with neural activity and calcium in vivo and in vitro. The Journal of Neuroscience. 28, 7399-7411 (2008).
  17. Dreosti, E., Odermatt, B., Dorostkar, M. M., Lagnado, L. A genetically encoded reporter of synaptic activity in vivo. Nature Methods. 6, 883-889 (2009).
  18. Mank, M., et al. A FRET-based calcium biosensor with fast signal kinetics and high fluorescence change. Biophysical Journal. 90, 1790-1796 (2006).
  19. Wang, Y., et al. A locus control region adjacent to the human red and green visual pigment genes. Neuron. 9, 429-440 (1992).
  20. Connaughton, V. P. Zebrafish retinal slice preparation. Methods in Cell Science. 25, 49-58 (2003).
  21. Baden, T., et al. A tale of two retinal domains: near-optimal sampling of achromatic contrasts in natural scenes through asymmetric photoreceptor distribution. Neuron. 80, 1206-1217 (2013).
  22. Kemmler, R., Schultz, k, Dedek, K., Euler, T., Schubert, T. Differential regulation of cone calcium signals by different horizontal cell feedback mechanisms in the mouse retina. The Journal of Neuroscience. 34, 11826-11843 (2014).
  23. Werblin, F. S. Transmission along and between rods in the tiger salamander retina. The Journal of Physiology. 280, 449-470 (1978).
  24. Euler, T., et al. Eyecup scope--optical recordings of light stimulus-evoked fluorescence signals in the retina. Pflugers Archive. European Journal of Physiology. 457, 1393-1414 (2009).
  25. Baden, T., Berens, P., Bethge, M., Euler, T. Spikes in mammalian bipolar cells support temporal layering of the inner retina. Current Biology. 23, 48-52 (2013).
  26. Breuninger, T., Puller, C., Haverkamp, S., Euler, T. Chromatic bipolar cell pathways in the mouse retina. The Journal of Neuroscience. 31, 6504-6517 (2011).
  27. Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsien, R. Y. A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties. The Journal of Biological Chemistry. 260, 3440-3450 (1985).
  28. Thoreson, W. B., Mangel, S. C. Lateral interactions in the outer retina. Progress in Retinal and Eye Research. 31, 407-441 (2012).
  29. Trifunovic, D., et al. cGMP-dependent cone photoreceptor degeneration in the cpfl1 mouse retina. The Journal of Comparative Neurology. 518, 3604-3617 (2010).
  30. Sahaboglu, A., et al. Retinitis pigmentosa: rapid neurodegeneration is governed by slow cell death mechanisms. Cell Death & Disease. 4, e488(2013).
  31. Sahaboglu, A., et al. PARP1 gene knock-out increases resistance to retinal degeneration without affecting retinal function. PloS One. 5, e15495(2010).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

TN XL

Похожие статьи