В этой рукописи описывается протокол исследования обонятельной системы грызунов. Тест на обонятельное привыкание/отвыкание позволит исследователям определить, привыкает ли мышь к многократно возникающему запаху и демонстрирует ли мышь непривыкание при предъявлении нового запаха.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Тестирование на Запах дискриминации и привыкания у мышей
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Это видео демонстрирует технику установления наличия нормально функционирующей обонятельной системы у мыши. Тест помогает определить, может ли мышь различать несоциальные запахи и социальные запахи, привыкает ли мышь к многократно возникающему запаху и демонстрирует ли мышь непривычивание при знакомстве с новым запахом. Поскольку многие тесты на социальное поведение измеряют реакцию подопытного животного на знакомую или новую мышь, ложных срабатываний можно избежать, установив, что животные могут обнаруживать и различать социальные запахи. Аналогичные соображения присутствуют и в обучающих тестах, таких как обусловливание страха, которые используют запах для создания новой среды или обонятельные сигналы в качестве ассоциативного стимула. Дефицит в обонятельной системе может ухудшить способность различать контексты и формировать ассоциацию с обонятельным сигналом во время обусловливания страха.
В тесте на обиход/отвыкивание от запаха мышь неоднократно сталкивается с несколькими запахами. Каждый запах преподносится трижды по две минуты. Исследователь записывает время вдыхания, направленное на запах, как измерение обонятельной реакции. Типичная мышь демонстрирует снижение реакции на запах при повторных проявлениях (привыкание). Затем экспериментатор представляет новый запах, который вызывает усиленное нюхание в сторону нового запаха (привыкание). После многократного предъявления нового запаха животное вновь проявляет привыкание. Этот протокол включает в себя предъявление воды, двух или более несоциальных запахов и двух социальных запахов. В дополнение к уменьшению экспериментальных искажений, этот тест может предоставить информацию о функции обонятельных систем новых линий мышей с нокаутом, нокаутом и условным нокаутом.
Введение
Мыши зависит от обоняния для навигации новых условиях, находя еду, для признания других лиц, и сексуальное поведение 1-3. Важно, что следователи установить, является ли экспериментальные животные имеют функционирования обоняние, перед введением поведенческие тесты, которые включают еду, социальное взаимодействие, или какие-либо запахи, предназначенные для получения ответа от мыши. Аносмия или неспособность различать запахи, может привести к ложных срабатываний или негативов в самых разнообразных поведенческих парадигм, так способность мышь, чтобы обнаруживать и различать запахи должны быть установлены прежде, чем другие типы поведенческих тестов выполняются.
Обонятельная тест привыкание / dishabituation был впервые описан в 1980-х годах 4. Тест был адаптирован для использования у мышей Drs. Му Ян и Жаклин Кроули 5. Это простой и недорогой тест, который позволяет следователю ЭСТАБлиш, что мышь может обнаружить и различать запахи. В дополнение к тестированию обоняние, этот тест позволяет следователю наблюдать общее поведение мыши и должно быть сделано в начале режима тестирования. Качественные наблюдения, касающиеся передвижения мышки, признаки беспокойства, уровень активности, и ответ на социальные запахов в сравнении пищевых запахов может сигнализировать новые области, в которых тестирование может быть выполнена.
В этом тесте, ватные тампоны окунают в различных запахов представлены в мыши три раза подряд. С каждым повторным презентации запаха, мыши привыкают к ватным тампоном, тратить меньше времени на исследование его с каждым последующим представлением. Когда новый запах представлены, dishabituation происходит, и типичный мыши будут тратить больше времени на исследование тампон, указывая, что он может различать между текущим и предыдущим запахов 5. Этот тест вводят одной мыши в то время, и включает в себя 45 мин соотвПериод limation затем 45 мин испытания.
Хотя этот тест легко проводить его можно использовать, чтобы исследовать сложные вопросы о системе мышь обонятельной. Другие интересные испытания обоняния, такие как тест погребенного пищевой, просто установить наличие или отсутствие обоняния. Тем не менее, тест обонятельные дискриминации и привыкание позволяет следователем, чтобы определить, что мышь не только имеет способность обнаруживать запахи, но может различать разные запахи. Структура привыкание и dishabituation был использован, чтобы установить, что новые мутанты могут различать запахи 6,7. В удивительном исследовании, Fadool и его коллеги использовали сложные смеси запахов, чтобы показать, что у мышей с ген-направленной делецией Kv1.3 канала "супер smellers", которые могут различать очень похожие запахи лучше, чем у нормальных мышей 8.
При рассмотрении новой модели мыши нокаутом полезно establisч Наличие нормального поведения для основных сенсорных задач. Когда это сделано в начале режима тестирования, дискриминации и запах тест привыкание дает следователь возможность наблюдать какие-либо необычные поведения. Эти наблюдения могут предотвратить ложные положительные или отрицательные результаты в последующих испытаний, которые относятся к недостоверным характеристики мутанта. Как исследователи продолжают исследовать социальное поведение необходимость проверки основной обонятельной функции становится все более важным. Помимо изучения обоняния в мутантных линий, этот тест может быть использован для решения конкретных вопросов, таких как конкретно, увеличивает ли фармакологическое лечение реакцию животного на раздражители социальных запаха или если их увеличивается ответ на все раздражители запах.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Взрослый самец мыши, используемые в следующем эксперименте были получены и размещены на Бейлор университета при температуре окружающей среды 22 ° C, с 14 ч света и 10 часов темного (с 20:00 до 6:00 ч) суточного цикла. Мыши были даны вволю доступ к пище и воде. Все процедуры в мышей были в соответствии с Национальными Институтами Здоровья Руководства по уходу и использованию лабораторных животных и протокола животных был одобрен Бейлор университета уходу и использованию животных комитета. Мыши были проверены в конце утренней / после полудня. Для всех процедур ниже следователя должны носить перчатки для устранения запахов и предотвращения загрязнения.
1. Подготовка Номера для социальных Запахи
- Подготовка свежих несоциальными запахи каждый день тестирования.
Примечание: следователь должен использовать перчатки, чтобы подготовить запахи.- Заполните 3 центрифужные пробирки с 10 мл воды каждый раз.
- Внесите 100 мкл экстракта банана в 15 мл и #160; коническую трубку и 100 мкл экстракта миндаля во второй 15 мл коническую трубку для 1: 100 разбавления.
Примечание: В третьем трубки 15 мл будет содержать только воду.
2. Подготовка социальных Запахи
- Подготовьте свежие запахи социальных утренним тестирования будет происходить. Получить социальных запахи из двух клеток, которые не были очищены в течение по крайней мере трех дней, и содержат одинаковое число мышей. Получить социальных запахи из мышей того же пола, что и испытуемого.
Примечание: Они должны быть сохранены при комнатной температуре и должны быть использованы в течение 4-6 ч, чтобы поддерживать сильную и последовательную запах.- Определите, сколько социальная запах ватные тампоны должны быть созданы: каждая мышь проходит испытания будут представлены три мазков из социальной запаха 1, и три из социальной запаха 2.
- Подготовка социальных запахи, вытирая ватный тампон в зигзагообразно по дну грязной клетке. Стряхните излишки кроватях цепляясь к кончику.
- Храните тампоны в больших стеклянных банках с крышками или в стаканах, покрытых парафином. Назначить один контейнер для социальной запахом 1 и второй для запах социальной 2.
- Поддерживать исходные клетки запах пределами экспериментальной комнате тестирования.
3. Акклиматизация в Test Mouse
- Наденьте перчатки и весят мышь, чтобы быть проверены и поместить в отдельную клетку с чистой проволоки крышкой сверху и бутылку воды удаляется.
- Разрешить мыши, чтобы привыкнуть к новой клетке в течение 45 мин в комнате, кроме комнату тестирования. Убедитесь, что нет никаких необычных запахов или звуков в комнате.
- Как тестирование занимает около 45 мин, шатаются раз акклиматизационных поставив следующий мышь, чтобы быть проверены в чистую клетку, чтобы акклиматизироваться право перед тестированием текущей мыши.
4. Подготовка тестирования номер
- Поместите свежие ватные тампоны, лабораторное ленту, бутылки, содержащие тампоны социальных запах, трубы из пна-социальной запахи, микропипетка, два таймера, и отходов бутылка с крышкой в комнату тестирования.
- Убедитесь, что тестирование комнате достаточно свободной от запахов, громких звуков, и яркий свет. Не носите душистые одеколоны и лосьоны.
Примечание: наблюдатель не должен быть жевательной резинки или конфеты в период тестирования и должны попытаться ограничить их воздействие на сильный запах продуктов.
5. Порядок Тестирование
- Принесите приспособиться мышь в клетке в комнату тестирования и поместите в клетку на прилавке на высоте, что удобно для просмотра сидя.
- Представьте каждый запаха 3 раза подряд в течение 2 мин каждый раз. Используйте порядок представления, что можно найти в таблице 1.
- Внесите 50 мкл одоранта в аромат для тестирования на кончике ватный тампон и повторно-CAP источник запаха. Поднимите верхнюю часть проволоки клетке и вставьте запаха, деревянный конец тампона в отверстие бутылки воды, Пушинг длина до с нижней стороны провода к вершине. Старайтесь не прикасаться кончиком хлопка к чему, в том числе пальцев, так что загрязнение запах избегать.
- Продолжайте рисовать тампон через отверстие бутылки воды примерно до 1 дюйм в конце хлопка не свисает в клетку. Прикрепите деревянную конец тампона к стороне клетки с использованием лаборатории ленту.
Примечание: Будьте осторожны, чтобы не позволить крышка отступить на клетку, в результате чего громкий шум, который бы нарушить тест мыши. - Сразу начала отсчета времени в течение 2 мин. Используйте один таймер тайм 2 мин презентацию. Запишите общее время, затрачиваемое нюхать запах во время 2 мин судебного разбирательства. Граф поведение нюхают животного с помощью отдельного секундомер. Активный фырканье определяется при нос животного ориентирована на кончике хлопка с его носа ~ 2 см или ближе к кончику.
- После завершения каждого испытания, поднять крышку провода и снимите ватным тампоном, потянув его вниз через ООНderside крышки (это позволяет избежать загрязнения запах, предотвращая кончик хлопок от прикосновения провода). Печать использованный тампон в 500 мл бутыли с отходами.
- Подготовка и вставьте следующий тампон и начать синхронизацию. Разрешить примерно 1 мин между каждым том следственном интервала. Продолжайте, пока каждый аромат не был представлен три раза подряд, в течение 2 мин каждый раз.
- После того, как мышь завершила все испытания, очистить бутылку отходов, содержащих использованные ватные тампоны в мусорное ведро за пределами испытательной камере. Вернуться мышь, чтобы его клетку.
6. Анализ
- Анализ данных для каждой группы условии запах, используя двусторонний ANOVA с последующим Newman-Кеулса или аналогичный тест постфактум, чтобы определить, значительное привыкание (менее времени нюхать последовательных же запахи), и dishabitutation (более нюхает новый запах времени).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Следуя протоколу, описанному, результаты были записаны с использованием десяти взрослых (постнатальный день 90-120) самцов мышей C57BL / 6J и восемь мужчин FvB смешанного фона штамма (50-70-й постнатальный день). Тестирование проводилось с помощью одного исследователя над нескольких дней. Каждая точка на графиках представляет среднее время, проведенное расследование запах.
Когда ватным тампоном, смоченным в воде впервые, мышей тратить много времени на исследования, этот новый объект ...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Результаты, представленные в настоящем документе, являются оптимальными для мышей. Мыши демонстрируют сильный ответ на нового запаха, а затем быстро привыкают. Одним из ключевых шагов в этом методе является подготовка запахов. Следователь должен проявлять большую осторожность, чтобы изолировать запахи друг от друга, чтобы предотвратить загрязнение. Еще одним ключевым аспектом является презентация ватным тампоном. Следователь должен устранить лучшее место наконечника хлопка, так мыши можно исследовать наконечник, но не р...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторам нечего раскрывать.
Благодарности
Эта работа поддержана грантом Исследовательского совета Университета Бэйлора и исследовательским грантом от Фонда эпилепсии.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Клетка для мышей | Allentown | Стандартная клетка | |
| Проволочная крышка | Allentown | BCU Mouse WBL 2500 | |
| Постельное белье | Harlan | 7090 Sani-Chips Ватные палочки | |
| VWR | 89031-270 | 6" деревянная ручка 6" | |
| Экстракт банана | McCormick | ||
| Экстракт миндаля | McCormick | ||
| Лабораторная лента | VWR | 89098-062 | |
| Секундомер | VWR | 62374-000 | |
| Нитриловые перчатки | VWR | 82026 | |
| Хронометраж | VWR | 61161-350 | |
| 15 мл конические трубки | VWR | 89003-294 | |
| 2 л стаканы | Pyrex | 1003 | |
| Парапленка | Парапленка | PM-992 | 4" x 250' |
| Бутылка 1 л с крышкой | VWR | 89000-240 |
Ссылки
- Doty, R. L. Odor-guided behavior in mammals. Experientia. 42, 257-271 (1986).
- Restrepo, D., Arellano, J., Oliva, A. M., Schaefer, M. L., Lin, W. Emerging views on the distinct but related roles of the main and accessory olfactory systems in responsiveness to chemosensory signals in mice. Horm Behav. 46, 247-256 (2004).
- Keverne, E. B. Importance of olfactory and vomeronasal systems for male sexual function. Physiol Behav. 83, 177-187 (2004).
- Gregg, B., Thiessen, D. D. A simple method of olfactory discrimination of urines for the Mongolian gerbil, Meriones unguiculatus. Physiol Behav. 26, 1133-1136 (1981).
- Yang, M., Crawley, J. N. Simple behavioral assessment of mouse olfaction. Curr Protoc Neurosci. Chapter 8 (Unit 8 24), (2009).
- Pan, Y. W., Kuo, C. T., Storm, D. R., Xia, Z. Inducible and targeted deletion of the ERK5 MAP kinase in adult neurogenic regions impairs adult neurogenesis in the olfactory bulb and several forms of olfactory behavior. PLoS ONE. 7, e49622(2012).
- Wesson, D. W., Levy, E., Nixon, R. A., Wilson, D. A. Olfactory dysfunction correlates with amyloid-beta burden in an Alzheimer's disease mouse model. J Neurosci. 30, 505-514 (2010).
- Fadool, D. A., et al. Kv1.3 channel gene-targeted deletion produces 'Super-Smeller Mice' with altered glomeruli, interacting scaffolding proteins, and biophysics. Neuron. 41, 389-404 (2004).
- Arakawa, H., Arakawa, K., Blanchard, D. C., Blanchard, R. J. Scent marking behavior in male C57BL/6J mice: sexual and developmental determination. Behav Brain Res. 182, 73-79 (2007).
- Baum, M. J. Sexual differentiation of pheromone processing: links to male-typical mating behavior and partner preference. Horm Behav. 55, 579-588 (2009).
- Ferguson, J. N., et al. Social amnesia in mice lacking the oxytocin gene. Nat Genet. 25, 284-288 (2000).
- Yang, M., et al. Low sociability in BTBR T+tf/J mice is independent of partner strain. Physiol Behav. 107, 649-662 (2012).
- Best, J. D., et al. Non-associative learning in larval zebrafish. Neuropsychopharmacology. 33, 1206-1215 (2008).
- Wolman, M. A., Jain, R. A., Liss, L., Granato, M. Chemical modulation of memory formation in larval zebrafish. Proc Natl Acad Sci U S A. , (2011).
- Sorge, R. E., et al. Olfactory exposure to males, including men, causes stress and related analgesia in rodents. Nat Methods. 11, 629-632 (2014).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
Теги
