Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Вывод из высокоочищенных кардиомиоцитов из человеческих индуцированных плюрипотентных стволовых клеток с использованием малой молекулы-модулированный Дифференциация и последующих глюкозы Голод

19.1K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/52628

⸱

18 марта 2015 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Stanford Cardiovascular Institute, Stanford University School of Medicine, 2Institute of Stem Cell Biology and Regenerative Medicine, Cardiovascular Medicine Division, Department of Medicine, Child Health Research Institute, Stanford University School of Medicine

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Здесь мы описываем надежный протокол для деривации кардиомиоцитов человека, который сочетает в себе дифференцировку сердца с малыми молекулами и опосредованную депривацией глюкозы очистку кардиомиоцитов, что позволяет производить очищенные кардиомиоциты для целей моделирования сердечно-сосудистых заболеваний и скрининга лекарств.

Аннотация

Клеток получают кардиомиоциты плюрипотентные стволовые вызванных деятельностью человека (hiPSC-CMS) стали важным источником клеток для решения проблемы нехватки первичных кардиомиоцитов, доступных для фундаментальных исследований и трансляционных приложений. Чтобы дифференцировать hiPSCs в кардиомиоциты, различные протоколы, включая эмбриоидном тела (EB) основе дифференциации и индукции фактора роста были разработаны. Тем не менее, эти протоколы неэффективны и сильно варьирует в их способности генерировать очищенные кардиомиоциты. В последнее время, малая молекула на основе протокола использованием модуляции сигналов Wnt / β-катенин было показано, чтобы способствовать сердечной дифференциации с высокой эффективностью. С помощью этого протокола, более чем на 50% -60% дифференцированных клеток были сердечный тропонин-положительных кардиомиоциты последовательно наблюдалось. Для дальнейшего повышения чистоты кардиомиоцитов, дифференцированные клетки подвергали голоданию в глюкозу, чтобы специально исключить некардиомиоциты на основе метаболического разностис между кардиомиоцитов и некардиомиоциты. Используя эту стратегию выбора, мы последовательно получили увеличение более чем на 30% в соотношении кардиомиоцитов в некардиомиоциты в популяции дифференцированных клеток. Эти особо чистые кардиомиоциты должны повысить надежность результатов человеческой IPSC основе в пробирке исследования моделирования заболеваний и скрининга лекарственных средств анализов.

Введение

Первичные кардиомиоциты человека трудно получить из-за необходимости инвазивной биопсии сердца, трудности диссоциации до отдельных клеток, а также из-за низкой долгосрочной выживаемости клеток в культуре. Учитывая эту нехватку первичных кардиомиоцитов человека, специфичная для пациента технология индуцированных плюрипотентных стволовых клеток кардиомиоцитов человека (hiPSC-CM) рассматривается как мощный альтернативный источник кардиомиоцитов для фундаментальных исследований, а также клинических и трансляционных приложений, таких как моделирование заболеваний и разработка лекарств1. Ранние попытки дифференцировки плюрипотентных стволовых клеток в кардиомиоциты использовали протоколы дифференцировки с использованием эмбриоидных телец (БЭ), но этот метод неэффективен в производстве кардиомиоцитов, потому что часто менее 25% клеток в БЭ превосходят кардиомиоциты2,3. Для сравнения, протокол дифференцировки на основе монослоя с использованием цитокинов активина А и BMP4 показал более высокую эффективность, чем БЭ, но этот протокол все еще относительно неэффективен, требует дорогостоящих факторов роста и функционирует только в ограниченном числе линий плюрипотентных стволовых клетокчеловека4. Недавно был разработан высокоэффективный протокол дифференцировки кардиомиоцитов на основе монослоя hiPSC путем модуляции передачи сигналов Wnt/β-катенина5. Эти hiPSC-CM экспрессируют сердечный тропонин Т и альфа-актинин, два саркомерных белка, которые являются стандартными маркерами кардиомиоцитов6. Описанный здесь протокол является адаптацией этого метода дифференцировки монослоя на основе малых молекул, не зависящего от клеток,5,7. Мы можем получить бьющиеся кардиомиоциты из ИПСК через 7-10 дней (Рисунок 1). Тем не менее, после дифференцировки кардиомиоцитов, приводящей к 50% битых клеток, иммуноокрашивание последовательно показывает существование популяции некардиомиоцитов, которые являются отрицательными для кардиомиоцитарных специфических маркеров, таких как кардиоспецифический тропонин Т и альфа-актинин. Для дальнейшей очистки кардиомиоцитов и элиминации некардиомиоцитов гетерогенные дифференцированные клеточные популяции подвергали глюкозному голоданию путем обработки их питательной средой с чрезвычайно низким содержанием глюкозы в течение нескольких дней (рис. 2). Это лечение избирательно устраняет некардиомиоциты благодаря способности кардиомиоцитов, но не некардиомиоцитов, метаболизировать лактат в качестве основного источника энергии для выживанияв среде с низким содержанием глюкозы. После этой стадии очистки наблюдается 40%-ное увеличение соотношения кардиомиоцитов к некардиомиоцитам (Рисунок 3, Рисунок 4), и эти клетки могут быть использованы для анализа экспрессии генов, моделирования заболеваний и скрининга лекарственных препаратов.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: Информация о поставщике для всех реагентов, используемых в этом протоколе, указана в таблице 1 и списке материалов. Все растворы и оборудование, контактирующие с клетками, должны быть стерильными, и в соответствии с этим следует использовать асептическую технику. Если не указано иное, проводите инкубацию всех культур во влажном 37 °C и 5%CO2 инкубаторе. В этом протоколе все дифференцировки выполняются в 6-луночных планшетах, в которые засеваются ИПСК После дифференцировки и очистки клетки могут быть диссоциированы и повторно покрыты для последующего использования.

1. Подготовка среды

  1. Для среды E8 приготовьте исходный раствор для каждого компонента среды (NaHCO3, L-аскорбиновая кислота 2-фосфат, селенит натрия, трансферрин, инсулин, FGF2, TGFB1) и храните растворы при температуре -20 °C. Добавьте соответствующее количество исходных растворов во флакон DMEM/F12 и отфильтруйте для стерилизации. Концентрация раствора и настройка реакции для исходных компонентов и среды Е8 приведены в таблице 1.
  2. Для получения раствора внеклеточного матрикса разморозьте матрикс базальной мембраны (обычно поставляемый в концентрации 10 мг/мл) при 4 °C O/N. Матригель обычно используется для культивирования плюрипотентных стволовых клеток, поскольку плюрипотентные стволовые клетки человека могут хорошо адгезировать к этому материалу с помощью альфа-6-бета-1 интегрина9. После размораживания внесите аликвоты 2,25 мг (250 μл) на лед с помощью ледяных наконечников и трубок для пипеток и храните аликвоты при температуре −80 °C.
    1. При предварительном покрытии планшетов ВКМС разморозьте и аликвотируйте раствор внеклеточного матрикса (ВКМС) на льду. Смешайте ECMS и ледяную среду DMEM/F12 в соотношении 1:200 на льду. Храните в прохладном месте, чтобы предотвратить преждевременное затвердевание ECMS.
  3. Для RPMI/B27 без инсулиновой среды добавьте 10 мл B27 Minus Insulin в 500 мл среды RPMI.
  4. Для среды RPMI/B27 (с инсулином) добавьте 10 мл добавки B27 (с инсулином) и 5 мл антибиотика Pen-strep в 500 мл среды RPMI.
  5. Для среды с низким содержанием глюкозы добавьте 10 мл добавки B27 и 5 мл антибиотика Pen-strep в 500 мл среды RPMI, не содержащей глюкозы.
  6. Для среды для замораживания/криоконсервации смешайте фетальную бычью сыворотку с диметилсульфоксидом (ДМСО) в соотношении 9:1. Замораживающая среда может храниться до 1 месяца при температуре 4 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Все среды должны быть отфильтрованы и храниться при температуре 4 °C и использоваться в течение 2 недель, если не указано иное. Если не указано иное, все используемые ниже объемы реагентов/растворов предназначены для одной лунки в 6-луночном планшете.

2. Предварительное покрытие 6-луночных планшетов с помощью ECMS

  1. Сделайте ECMS, смешав матрицу базальной мембраны (например, Matrigel) с ледяной средой DMEM/F12 в соотношении 1:200, затем нанесите по 2 мл свежеприготовленной ECMS в каждую лунку для получения 6-луночного планшета. Каждая лунка в 6-луночном планшете будет получать примерно 90 мг ECMS.
  2. Инкубируйте планшеты с покрытием ECMS в течение 1 часа при 37 °C. Непосредственно перед нанесением покрытия на ячейки аспирируйте раствор DMEM/F12 из каждой лунки. После этого пластины будут готовы к приему клеток.

3. Размораживание замороженных ИПСК

ПРИМЕЧАНИЕ: Внимательно следуйте этой процедуре, так как она может привести к оптимальному культивированию и последующей дифференциации ИПСК в ИПСХ-СМ после цикла замораживания/размораживания.

  1. Разморозьте по одному флакону ИПСК для каждой лунки 6-луночного планшета. Приготовьте коническую пробирку объемом 15 мл с 9 мл холодной среды Е8 с ингибитором ROCK (10 мкМ) для каждого флакона. Ингибитор ROCK улучшает выживаемость ИПСК после криоконсервации10. Держите флаконы на водяной бане при температуре 37 °C, чтобы разморозить ячейки, пока не останется кристалл льда диаметром примерно 5 мм.
  2. Опрыскайте внешнюю сторону флаконов 70% этанолом. Протрите флаконы папиросной бумагой перед тем, как переместить их в стерильный ламинарный колпак.
  3. Переложите ячейки в подготовленную коническую трубку. Один раз промойте флакон 500 μл среды E8 и переложите среду, содержащую размороженные клетки, в ту же коническую пробирку. Центрифугируйте при RT в течение 4 мин при 200 x g.
  4. После центрифугирования отсадите надосадочную жидкость и аккуратно ресуспендируйте клеточную гранулу 2 мл среды Е8 с ингибитором ROCK (10 мкМ). Перенесите ресуспензионные элементы в одну лунку 6-луночного планшета, предварительно покрытого ECMS.
  5. Замените среду на среду E8 без ингибитора ROCK после 24 часов культивирования. Клетки должны прилипнуть к этому времени.

4. Пассаж гиПСК

  1. Как правило, гиПСК пассируются после достижения 75%-80% конфлюенции в 6-луночном планшете. Аспирируйте питательную среду. Быстро промойте лунки 1 мл стерильного, RT PBS. Аспират PBS.
    1. Добавьте 500 мкл 0,5 мМ ЭДТА или 1 раствор для отслоения клеток (например, Аккутазу) и инкубируйте в течение 1-7 мин при РТ. Подходящее время для инкубации ЭДТА зависит от линии hiPSC. Ожидайте увидеть видимое скручивание или утолщение колоний по краям, так как это будет указывать на то, что ЭДТА или раствор для отслойки клеток готов к удалению.
  2. Аспирируйте ЭДТА или раствор для отслойки клеток. Добавьте 1 мл среды Е8 с добавлением 10 μМ ингибитора ROCK. Вытесните колонии HiPSC в лунке путем многократного дозирования вверх и вниз и распыления колоний с помощью пипетки P1000. После завершения колонии должны быть разбиты на 5-10 клеточных групп.
  3. Переложите колонии, взвешенные в 1 мл среды Е8 с ингибитором ROCK, в коническую пробирку объемом 15 мл.
  4. Разбейте крупные клеточные комки на мелкие комки в среде E8. Добавьте в клеточную суспензию соответствующий объем среды Е8 с ингибитором для разбавления клеток. Объем среды, добавляемой для разбавления, зависит от плотности ячеек и количества лунок, которые необходимо засеять. В идеале одна лунка с конфлюентным содержанием ИПСК на 80% должна быть разбавлена в соотношении 1:12.
    1. Добавьте 11 мл среды Е8 с ингибитором ROCK к имеющемуся 1 мл клеточного раствора в вышеупомянутой конической пробирке объемом 15 мл для получения разведения 1:12.
  5. Далее растирайте клеточные комки на мелкие клеточные фрагменты (лучше всего около 50-200 клеток в каждом фрагменте). Избегайте чрезмерного растирания, так как это снижает выживаемость клеток.
  6. Отсадите ЭКМС из предварительно покрытых пластин и добавьте по 2 мл ресуспендированных клеток в каждую лунку. Примерно 100 000 ячеек на лунку 6-луночного планшета является идеальным вариантом. Стремитесь равномерно распределить ячейки вокруг лунки, чтобы избежать скопления ячеек в центре лунки.
  7. После 24 часов культивирования замените среду на среду E8 без ингибитора ROCK. Меняйте питательную среду каждые 24 часа до тех пор, пока клетки не станут на 80% сливающимися. Затем клетки снова готовы к прохождению. Обычно требуется 3-6 дней между проходами, чтобы достичь 80% слияния.

5. Замораживание hiPSC

ПРИМЕЧАНИЕ: Внимательно следуйте этой процедуре, так как она может привести к оптимальному культивированию и последующей дифференциации ИПСК в ИПСХ-СМ после цикла замораживания/размораживания.

  1. Маркируйте криогенные пробирки с указанием названия клеточной линии, типа клетки, номера пассажа и даты замораживания. В качестве общей рекомендации, используйте один флакон на каждую лунку 6-луночного планшета. Приготовьте коническую пробирку объемом 15 мл, заполненную 9 мл среды Е8 с ингибитором ROCK (10 мкМ). Приготовьте среду для заморозки с 90% FBS и 10% DMSO и держите среду при температуре 4 °C до использования.
  2. Отсадить питательную среду, добавить 500 мкл 0,5 мМ ЭДТА или 1x раствор для отслойки клеток и инкубировать в течение 2-7 мин при ЛТ. Продолжительность воздействия ЭДТА или раствора клеточной отслойки варьируется от клеточной линии к клеточной линии.
  3. Аспират ЭДТА или раствор для отслойки клеток. Добавьте 1 мл среды Е8.
  4. Вытесните колонии HiPSC в лунке с помощью пипетирования вверх и вниз и распыляя колонии с помощью пипетки P1000. Колонии не следует разбивать на группы размером менее 100 клеток. Перенесите взвешенные элементы в подготовленную коническую трубку, содержащую Е8. Центрифугируйте при RT в течение 4 мин при 200 x g.
  5. Отсадите надосадочную жидкость и добавьте в гранулу 500 μл холодного замораживающего средства. Повторно суспендируйте гранулу пипетированием один-два раза. Выживаемость клеток улучшается за счет содержания клеток в больших скоплениях.
  6. Перенесите ресуспендированные клетки в меченую криогенную пробирку. Быстро переместите флаконы в контейнер для заморозки, содержащий изопропанол, который обеспечит постепенное охлаждение. Подержите контейнер с ячейками при температуре -80 °C в течение 24 часов, затем переведите ячейки в жидкий азот для длительного хранения.

6. Сердечная дифференцировка иПСК человека

ПРИМЕЧАНИЕ: Все медиа должны быть по крайней мере в RT при добавлении.

  1. После диссоциации с ЭДТА или 1x раствором для отслоения клеток засейте около 100 000 человеческих ИПСК на 6-луночных культуральных планшетах с покрытием ECMS для дифференцировки (те же этапы, что и процедуры пассирования клеток). Когда клетки достигнут 85% конфлюенции, смените среду на RPMI/B27 без инсулина с 6 мкМ ингибитором GSK3-бета CHIR99021 (CHIR) и поддерживайте в течение 48 часов.
  2. Через 48 ч замените культуральную среду, содержащую CHIR, на RPMI/B27 без инсулиновой среды и оставьте в покое на 24 ч (до 3-го дня).
  3. На 3-й день смените среду на RPMI/B27 без инсулина с 5 μМ ингибитором Wnt IWR1 и поддерживайте в течение 48 часов (до 5-го дня).
    Примечание: Ингибирование Wnt также может быть предпринято с использованием других низкомолекулярных соединений, как описано в болееранних исследованиях. IWR1 был выбран среди других низкомолекулярных ингибиторов Wnt из-за увеличенного диапазона, в котором было показано, что он эффективен в ингибировании передачи сигналов Wnt11.
  4. На 5-й день измените среду обратно на RPMI/B27 без инсулиновой среды и оставьте на 48 часов (до 7-го дня).
  5. На 7-й день замените среду средой RPMI/B27 (с инсулином) и после этого заменяйте среду каждые 3 дня той же средой. Спонтанное биение кардиомиоцитов должно быть впервые заметно примерно на 8-10 день.

7. Очищение кардиомиоцитов человека с помощью глюкозного голодания

  1. На 10-й день после дифференцировки смените среду в каждой лунке 6-луночного планшета на 2 мл среды с низким содержанием глюкозы и поддерживайте клетки в этой среде в течение 3 дней (до 13-го дня).
  2. На 13-е сутки верните клетки в среду RPMI/B27 (с инсулином).
  3. По желанию, реплейтируйте кардиомиоциты перед вторым раундом глюкозного голодания, чтобы помочь высвободить некардиомиоциты из культивальной пластины, что позволяет легче диссоциировать некардиомиоциты во время глюкозного голодания.
    1. На 13-й день аспирируйте среду, промойте один раз PBS и диссоциируйте клетки на отдельные клетки с помощью 500 μл фермента диссоциации клеток в течение 5 минут при 37 °C. В частности, после 5 минут обработки ферментами используйте пипетку объемом 1000 μл для ручной диссоциации кардиомиоцитов из 6-луночного планшета, многократно вытягивая фермент диссоциации клеток и распыляя его на монослой кардиомиоцитов. Для диссоциации кардиомиоцитов на отдельные клетки может потребоваться до 30 повторений пипетирования.
    2. После того, как клетки диссоциированы и находятся в одноклеточной форме, соберите все клетки в коническую пробирку объемом 15 мл, заполненную 5 мл среды RPMI/B27 с инсулином, чтобы разбавить фермент диссоциации клеток, и центрифугируйте в течение 4 мин при 200 x g. Аспиратируйте и выбросьте надосадочную жидкость.
    3. Повторно суспензируйте клетки с помощью среды RPMI/B27 объемом 2 мл и поместите ее на новую 6-луночную пластину с покрытием ECMS. Как правило, более высокая конфлюенция кардиомиоцитов помогает выживанию клеток во время реплатинга. Стремитесь к замене 2 миллионов клеток на новую 6-луночную чашку для оптимальной выживаемости во время замены.
  4. На 14-й день измените среду обратно на 2 мл среды с низким содержанием глюкозы для второго цикла депривации глюкозы. Культивируйте клетки в этом состоянии с низким содержанием глюкозы в течение еще 3 дней. Большинство некардиомиоцитов погибнут в этом состоянии культивирования с низким содержанием глюкозы.
  5. На 17-й день замените среду на 2 мл среды RPMI/B27 с инсулином. Остальные клетки будут представлять собой высокоочищенные кардиомиоциты. Эти кардиомиоциты могут быть использованы для анализа экспрессии генов, скрининга лекарств, метаболического анализа и различных других последующих анализов.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Морфологические изменения в процессе дифференцировки hiPSC.

hiPSC, культивируемые на бесклеточных плашках, росли в виде плоских двумерных колоний. При достижении примерно 85% конфлюэнтности hiPSC обрабатывали 6 µM CHIR для индукции дифференцировки (Рисунок 1A). Через 24 часа обработки CHIR наблюдалась значительная гибель клеток, что является нормальным и распространенным явлением. После двух дней обработки CHIR hiPSC продолжали дифференцироваться в направлении...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Получение большого количества высокоочищенных кардиомиоцитов, полученных из ИПСК, имеет решающее значение для фундаментальных кардиологических исследований, а также для клинического и трансляционного применения. Протоколы кардиологической дифференцировки претерпели значительные улучшения в последние годы, перейдя от методов на основе эмбриоидного тела с использованием кардиогенных факторов роста2 к методам матричного сэндвича12 и, наконец, к методам на основе малых молекул и монослоев. Из...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не декларируют конкурирующие интересы.

Благодарности

Эта работа была частично поддержана NIH/NHBI (U01 HL099776-5), премией директора NIH New Innovator Award (DP2 OD004411-2), Калифорнийским институтом регенеративной медицины (RB3-05129), Американской кардиологической ассоциацией (14GRNT18630016) и премией Endowed Faculty Scholar Award от Фонда Люсиль Паккард для детей и Научно-исследовательского института детского здоровья в Стэнфорде (для SMW). Мы также выражаем признательность за финансовую поддержку со стороны Американской кардиологической ассоциации Predoctoral Fellowship 13PRE15770000 и Программы стипендий для аспирантов Национального научного фонда DGE-114747 (AS).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Матригель (9-12 мг/мл)BD Biosciences354277
RPMI mediaInvitrogen11835055
Глюкоза без глюкозы RPMI mediaInvitrogen11879-020
B27 Minus InsulinInvitrogenA1895601
B27 Supplement (с инсулином)Invitrogen17504-044
Pen-strepping антибиотикInvitrogen15140122
Фетальная бычья сывороткаBenchMark100-106
DMSOSigmaD-2650
ROCK ингибитор Y-27632EMD Millipore688000
CHIR99021Thermo Fisher508306
IWR1SigmaI0161
EDTAInvitrogen15575-020
AccutaseMilliporeSCR005
Клеточный лифтерFisher08-100-240
КриовиальныйФишер (трубки NUNC)375418
Фермент TrypLE SelectInvitrogen12563-011

Ссылки

  1. Sharma, A., Wu, J. C., Wu, S. M. Induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for cardiovascular disease modeling and drug screening. Stem Cell Research & Therapy. 4 (6), 150(2013).
  2. Kehat, I., et al. Human embryonic stem cells can differentiate into myocytes with structural and functional properties of cardiomyocytes. The Journal of Clinical Investigation. 108 (3), 407-414 (2001).
  3. Zhang, J., et al. Functional cardiomyocytes derived from human induced pluripotent stem cells. Circulation Research. 104 (4), e30-e41 (2009).
  4. Kattman, S. J., et al. Stage-specific optimization of activin/nodal and BMP signaling promotes cardiac differentiation of mouse and human pluripotent stem cell lines. Cell Stem Cell. 8 (2), 228-240 (2011).
  5. Lian, X., et al. Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (27), E1848-E1857 (2012).
  6. Sharma, A., et al. Human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes as an in vitro model for coxsackievirus B3-induced myocarditis and antiviral drug screening platform. Circulation Research. 115 (6), 556-566 (2014).
  7. Lian, X., et al. Directed cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells by modulating Wnt/beta-catenin signaling under fully defined conditions. Nature Protocols. 8 (1), 162-175 (2013).
  8. Tohyama, S., et al. Distinct metabolic flow enables large-scale purification of mouse and human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Cell Stem Cell. 12 (12), 127-137 (2013).
  9. Rodin, S., et al. Long-term self-renewal of human pluripotent stem cells on human recombinant laminin-511. Nature Biotechnology. 28 (6), 611-615 (2010).
  10. Li, X., Meng, G., Krawetz, R., Liu, S., Rancourt, D. E. The ROCK inhibitor Y-27632 enhances the survival rate of human embryonic stem cells following cryopreservation. Stem Cells And Development. 17 (6), 1079-1085 (2008).
  11. Burridge, P. W., et al. Chemically defined generation of human cardiomyocytes. Nature Methods. 11 (8), 855-860 (2014).
  12. Zhang, J., et al. Extracellular matrix promotes highly efficient cardiac differentiation of human pluripotent stem cells: the matrix sandwich method. Circulation Research. 111 (9), 1125-1136 (2012).
  13. Burridge, P. W., Keller, G., Gold, J. D., Wu, J. C. Production of de novo cardiomyocytes: human pluripotent stem cell differentiation and direct reprogramming. Cell Stem Cell. 10 (1), 16-28 (2012).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

WntT
Вывод из высокоочищенных кардиомиоцитов из человеческих индуцированных плюрипотентных стволовых клеток с использованием малой молекулы-модулированный Дифференциация и последующих глюкозы Голод
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.