Методическая статья

Синхронизация Caulobacter Crescentus По расследованию бактериального клеточного цикла

DOI:

10.3791/52633

⸱

8 апреля 2015 г.

 , 
1Department of Developmental Biology, Stanford University School of Medicine

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Синхронизация бактериальных клеток имеет важное значение для изучения бактериального клеточного цикла и развития. Caulobacter crescentus синхронизируется с помощью центрифугирования по плотности, что позволяет быстро и эффективно использовать его для изучения клеточного цикла бактерий. Здесь мы приводим подробный протокол синхронизации клеток Caulobacter.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Клеточный цикл важен для роста, репликации и развития генома во всех клетках. У бактерий исследования клеточного цикла были сосредоточены в основном на несинхронизированных клетках, что затрудняет упорядочивание временных событий, необходимых для прогрессирования клеточного цикла, репликации и деления генома. Caulobacter crescentus представляет собой превосходную модельную систему для бактериального клеточного цикла, в которой клетки могут быть быстро синхронизированы в состоянии G0 путем центрифугирования по плотности. Эксперименты по синхронизации клеточных циклов были использованы для установления молекулярных событий, управляющих репликацией и сегрегацией хромосом, для картирования генетической регуляторной сети, контролирующей прогрессию клеточного цикла, и для определения создания полярных сигнальных комплексов, необходимых для асимметричного деления клеток. Здесь мы приводим подробный протокол для быстрой синхронизации клеток Caulobacter NA1000. Синхронизация может быть выполнена в крупномасштабном формате для профилирования экспрессии генов и вестерн-блоттинга, а также в мелкомасштабном формате для микроскопии или FACS-анализов. Быстрая синхронизация и высокий выход клеток Caulobacter делают этот организм мощной модельной системой для изучения бактериального клеточного цикла.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Бактериальный клеточный цикл контролирует как репликация генома и деление дочерних клеток. Важно отметить, что, как устойчивость к антибиотикам является растущей угрозой для здоровья населения, бактериальный клеточный цикл представляет собой нетронутый цель для развития антибиотиков.

В бактерией Caulobacter crescentus, каждый клеточного цикла приводит к асимметричному разделения, получая две дочерние клетки разными судьбами (рис 1А) в 1,2 раза. Один дочерняя клетка наследует жгутик и подвижны, а другая дочь наследует стебель и сидячие. Интегрированный генетический контур регулирует прогрессию клеточного цикла и клеточной судьбы по регуляции транскрипции, фосфо-сигнализации, и регулируемого протеолиза 3. Кроме того, репликация хромосом и одновременно дают сегрегация дочерние клетки, которые содержат ровно одну копию хромосомы 4. Важно, что эти два типа клеток может быть быстро отделен от да КоллоIdal частиц кремнезема плотность центрифугирования в синхронизируемый NA1000 штамма 5-7, позволяющей изоляцию Swarmer клеток от остальной части населения с высокими выходами (рис 1б). Изолированные Swarmer клеток затем приступить синхронно через асимметричных клеточных делений. Здесь мы подробно протокол, используемый для синхронизации Caulobacter деформации NA1000. Мы предоставляем протоколы и общие советы по устранению неполадок для большого и малого масштаба синхронизации. Это экспериментальная процедура представляет собой мощный инструмент допросить пространственно-временной контроль клеточного цикла Caulobacter и судьбы клеток.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Масштабная Synchrony - Оптимальное решение для вестерн-блот, Microarray / РНК-Seq и другие материалы интенсивной Анализы

  1. Из морозильной наличии или пластины, вырастить 5 мл O / N культуру штамма NA1000 встряхиванием при 28 ° С в среде PYE.
  2. Посев 0,5 мл клеток со стадии 1 в 25 мл M2G (табл 1-2) и встряхивают при 28 ° С до тех пор, пока культура достигает OD 600 между 0,5 и 0,6.
  3. Привить клеток в 1 л M2G и встряхнуть при 28 ° С.
  4. После того, как OD 600 достигает 0,5 до 0,6, подтверждают наличие Swarmer клеток с использованием жидкого установлен фазового микроскопа. Пятно 1 мкл клеток на предметное стекло, покрывают покровным и изображения на фазовой микроскопии. Подтвердите наличие Swarmer клеток, визуализируя быстро плавающих клеток в популяции.
  5. Спин клетки в течение 15 мин при 7 kxg при 4 ° С в JA-10 роторе.
  6. Удалите супернатант и добавить 180 мл холодной М2 (табл 1-2) и аккуратно ресuspend все клетки с помощью серологических пипетки. Отменить свободно осажденные клетки; они predivisional и пошел клетки.
  7. Добавить 60 мл холодной раствор коллоидного кремнезема (не забудьте смешать коллоидной суспензии диоксида кремния перед добавлением к клеткам) и смешать клеточной суспензии хорошо.
  8. Налейте клеточной суспензии на восемь 30 мл пробирки и вращаться в течение 30 мин в 6,4 kxg при 4 ° С в JA-20 роторе.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Надо было видеть две отдельные полосы; Swarmer полоса нижняя полоса, а стебельчатые / predivisional клетки находятся в верхней полосе (рис 1б).
  9. Тщательно аспирата верхнюю полосу и снимите жидкость ~ 1 см выше Swarmer диапазона (нижняя зона).
  10. (Критический) С помощью пипетки Пастера, осторожно снимите Swarmer группу и поместить в чистую пробирку. Для смыть коллоидный диоксид кремния, топ трубку с холодной М2 и спина в течение 10 мин при 6,4 kxg при 4 ° С в JA-20 ротора.
  11. Осторожно удалите супернатант и ресуспендируютклетки в 20 мл холодной М2 и спина в течение 10 мин при 6,4 kxg при 4 ° С в JA-20 ротора.
  12. Ресуспендируют все гранулы в 30 мл холодного М2 и измерить OD 600, используя спектрофотометр и заготовки с использованием холодного M2 среды. Сохранить 1 мкл для отображения фазы, чтобы проверить на Swarmer клеток; 90-95% клеток должны быть Молодые паразиты.
  13. Спин вниз клетки в течение 5 мин при 6,4 kxg при 4 ° С в JA-20 роторе. Ресуспендируют клеток в 28 ° С M2G среды таким образом, чтобы 600 ~ 0,3-0,4 и начинают встряхивании при 28 ° С.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Типичные выходы находятся между 30 и 60 мл Swarmer культуре клеток из 1 л асинхронных клеток.
  14. Начните принимать временные точки (дикий тип культуры займет около 135-140 минут, чтобы разделить) 8,9. В каждый момент времени, измерьте наружный диаметр 600. Убедитесь, что OD 600 после разделения примерно 2X начальная OD 600.
  15. Для вестерн-блот или экспрессии генов анализов, удалите 1 мл аликвоты кубlture в желаемых временных точках, спин вниз на максимальной скорости в настольной центрифуге в течение 30 секунд, быстро декантируют и аспирации среды, и флэш заморозить осадок клеток в жидком азоте. Хранить клеток при -80 ° С до анализа вниз по течению.

2. Малый Synchrony - Оптимальное решение для микроскопии

  1. Из морозильной наличии или пластины, растут 5 мл O / N культуры встряхивании при 28 ° С в M2G.
  2. Развести в 15 мл M2G (табл 1-2) и не растут до середины логарифмической (OD 600 = 0,5-0,6).
  3. Спин 6,4 kxg в течение 10 мин при 4 ° С в JA-20 ротором, и ресуспендируют в 1 мл холодного М2 (табл 1-2) и переноса в 2 мл микроцентрифужных трубки.
  4. Спин на 15 kxg в течение 3 мин в микроцентрифуге трубки для осаждения клеток, аспирация надосадочную, положить таблетку на льду и ресуспендируют в 900 мкл холодного М2.
  5. Добавить 900 мкл холодного ПВП покрытием коллоидный диоксид кремния и спина в течение 20 мин при 15 kxg при 4 ° С в микрофонrocentrifuge трубки.
  6. (Критический) Аспирируйте или пипетки с верхней скитался / predivisional Band сотовый и собирать дно Swarmer группы в новую пробирку микроцентрифужных.
  7. Промыть Swarmer клеткам два раза в 1 мл холодного М2 в то время центрифугирования при 15 kxg в течение 3 мин.
  8. До конечного отжима, перемещения клеток в предварительно охлажденный 1 мл стеклянную пробирку и измерить OD 600 клеток по сравнению с заготовкой М2.
  9. Ресуспендируют осадок клеток окончательного в 28 ° C M2G на OD между 0,3 - 0,4 и встряхивают / рулон клетки при 28 ° С.
    Примечание: Типичные выходы от 2 до 4 мл Swarmer клеточной культуре.
  10. Для микроскопии экспериментов, в нужное моменты времени место 1 мкл клеток на агарозном площадку M2G для работы с изображениями.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Синхронизация обычно дает две полосы клеток (рис 1б): Swarmer группа, которая имеет более высокую плотность, и преследовал / predivisional Band сотовый низкой плотности. Для обеспечения эффективной синхронизации общие элементы управления включают мониторинг OD 600 и измерения уровней CTRA белка вестерн-блоттинга на различных клеточного цикла временных точках. OD 600 следует увеличить примерно на 2 раза в течение клеточного цикла (рисунок 2). Вестерн-блот для клеточ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Бактериальный клеточный цикл является фундаментальным процессом в жизни и важен для изучения роста и в качестве мишени для антибиотиков следующего поколения. В этой статье мы подробно описали процедуры быстрой синхронизации для C. crescentus NA1000, модельного организма для изучения бактериального клеточного цикла и асимметричного деления клеток. Этот метод совместим с вестерн-блоттингом, профилированием экспрессии генов и флуоресцентной микроскопией для исследования пространственно-временной регуляции бактериа...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы благодарят членов лаборатории Шапиро и Эрин Шрадер за комментарии к рукописи. Авторы выражают признательность за финансовую поддержку: постдокторской стипендии NIH F32 GM100732 JMS и грантов NIH R01 GM51426 и R01 GM32506 LS.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Коллоидный диоксид кремния с покрытием PVP (Percoll)Sigma-AldrichP4937
Коллоидный диоксид кремния (Ludox AS-40)Sigma-Aldrich420840
JA10 РоторBeckman-Coulter369687
JA20 РоторBeckman-Coulter334831
раствор хелата сульфата железаSigma-AldrichF0518
Центрифужные пробирки 30 млCorning8445
Na2HPO4EMDSX0720-1
KH2PO4VWRBDH9268-500G
NH4ClAmresco0621-500g

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. McAdams, H. H., Shapiro, L. System-level design of bacterial cell cycle control. FEBS Lett. 583, 3984-3991 (2009).
  2. McAdams, H. H., Shapiro, L. The architecture and conservation pattern of whole-cell control circuitry. J. Mol. Biol. 409, 28-35 (2011).
  3. McAdams, H. H., Shapiro, L. A bacterial cell-cycle regulatory network operating in time and space. Science. 301, 1874-1877 (2003).
  4. Ptacin, J. L., Shapiro, L. Initiating bacterial mitosis: understanding the mechanism of ParA-mediated chromosome segregation. Cell Cycle. 9, 4033-4034 (2010).
  5. Evinger, M., Agabian, N. Envelope-associated nucleoid from Caulobacter crescentus stalked and swarmer cells. J. Bacteriol. 132, 294-301 (1977).
  6. Tsai, J. W., Alley, M. R. Proteolysis of the Caulobacter McpA chemoreceptor is cell cycle regulated by a ClpX-dependent pathway. J. Bacteriol. 183, 5001-5007 (2001).
  7. Marks, M. E., et al. The genetic basis of laboratory adaptation in Caulobacter crescentus. J. Bacteriol. 192, 3678-3688 (2010).
  8. Ely, B. Genetics of Caulobacter crescentus. Methods Enzymol. 204, 372-384 (1991).
  9. Williams, B., Bhat, N., Chien, P., Shapiro, L. ClpXP and ClpAP proteolytic activity on divisome substrates is differentially regulated following the Caulobacter asymmetric cell division. Mol. Microbiol. 93, 853-866 (2014).
  10. Quon, K. C., Yang, B., Domian, I. J., Shapiro, L., Marczynski, G. T. Negative control of bacterial DNA replication by a cell cycle regulatory protein that binds at the chromosome origin. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 95, 120-125 (1998).
  11. Laub, M. T., Chen, S. L., Shapiro, L., McAdams, H. H. Genes directly controlled by CtrA, a master regulator of the Caulobacter cell cycle. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 99, 4632-4637 (2002).
  12. Quon, K. C., Marczynski, G. T., Shapiro, L. Cell cycle control by an essential bacterial two-component signal transduction protein. Cell. 84, 83-93 (1996).
  13. Ferullo, D. J., Cooper, D. L., Moore, H. R., Lovett, S. T. Cell cycle synchronization of Escherichia coli using the stringent response, with fluorescence labeling assays for DNA content and replication. Methods. 48, 8-13 (2009).
  14. Degnen, S. T., Newton, A. Chromosome replication during development in Caulobacter crescentus. J. Mol. Biol. 64, 671-680 (1972).
  15. Bates, D., et al. The Escherichia coli baby cell column: a novel cell synchronization method provides new insight into the bacterial cell cycle. Mol. Microbiol. 57, 380-391 (2005).
  16. Abel, S., et al. Bi-modal distribution of the second messenger c-di-GMP controls cell fate and asymmetry during the caulobacter cell cycle. PLoS Genet. 9, e1003744(2013).
  17. Johnson, R. C., Ely, B. Isolation of spontaneously derived mutants of Caulobacter crescentus. Genetics. 86, 25-32 (1977).
  18. Britos, L., et al. Regulatory response to carbon starvation in Caulobacter crescentus. PLoS One. 6, e18179(2011).
  19. Boutte, C. C., Crosson, S. The complex logic of stringent response regulation in Caulobacter crescentus: starvation signalling in an oligotrophic environment. Mol. Microbiol. 80, 695-714 (2011).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

CTRA

Похожие статьи