Простой и недорогой метод для определения холодную чувствительность и адаптация в мышах

Summary

Холодный подошвенный анализ (CPA) измеряет чувствительность к холоду в диапазоне от 30 °C до 5 °C, а также может измерять адаптацию к холоду. В этом протоколе описывается, как использовать CPA для измерения гиперчувствительности к холоду, анальгезии и адаптации у мышей.

Abstract

Гиперчувствительность к холоду является серьезной клинической проблемой, затрагивающей широкую подгруппу пациентов и вызывающей значительное снижение качества жизни. Холодовой подошвенный анализ позволяет объективно и недорого оценить чувствительность к холоду у мышей, а также количественно оценить как анальгезию, так и гиперчувствительность. Мышей акклиматизируют на стеклянной пластине, а сжатую гранулу сухого льда прижимают к стеклянной поверхности под задней лапой. Задержка на вывод из охлаждающего стекла используется в качестве меры чувствительности к холоду.

Ощущение холода также важно для выживания в регионах с сезонными температурными сдвигами, и для поддержания чувствительности животные должны иметь возможность регулировать пороги своей тепловой реакции в соответствии с температурой окружающей среды. Холодный подошвенный анализ (CPA) также позволяет изучать адаптацию к изменениям температуры окружающей среды путем тестирования чувствительности мышей к холоду при температурах от 30 °C до 5 °C. Мышей акклиматизируют, как описано выше, но стеклянную пластину охлаждают до желаемой начальной температуры с помощью алюминиевых коробок (или пакетов из алюминиевой фольги), наполненных горячей водой, влажным льдом или сухим льдом. Температура пластины измеряется в центре с помощью щупа термопары Т-типа. Как только пластина достигает желаемой начальной температуры, животных тестируют, как описано выше.

Этот анализ позволяет тестировать мышей при температурах от безобидных до вредных. CPA дает однозначные и последовательные поведенческие реакции у нетравмированных мышей и может быть использован для количественной оценки как гиперчувствительности, так и анальгезии. В этом протоколе описывается, как использовать CPA для измерения гиперчувствительности к холоду, анальгезии и адаптации у мышей.

Introduction

Измерение холодной реагирования на грызунах важно для улучшения понимания потенциальных механизмов холодного чувствительности у человека в нормальных и патологических условиях. Холодная подошвенный анализа (CPA), изначально разработанная несколько лет назад ^1, предназначен для генерации воспроизводимые и однозначные мышиные поведенческих реакций на холодную стимул поставки при комнатной температуре. Более поздние усовершенствования этого анализа позволили воспроизводимое измерение холодной чувствительности в широком диапазоне температур ^2. Обе версии также разработан, чтобы быть относительно высокую пропускную способность и недорогой в использовании.

Значительный прогресс был достигнут в понимании механизмов холодной чувствительности с использованием других поведенческих методов. Один метод испытания испарения ацетона, который включает в себя вытирать или распылением ацетона на лапы мыши и измерения количества времени, которое тратит мыши щелкая лапу ^3,4. К сожалению,ответы на испарения ацетона посрамлены мокрым ощущения и запах ацетона. Кроме того, холодный стимул, который применяется в тесте испарения ацетона может изменяться в зависимости от количества ацетона прикладной, и трудно определить количественно. Наконец, неповрежденной мыши имеют минимальные ответов на ацетона в основании, что делает невозможным измерить обезболивание при отсутствии чувствительности с помощью этого метода.

Другой классический тест для холодных ответов есть хвост щелчок анализа, где задержки к выходу измеряется после того, как хвост погружали в холодную воду ^5,6. В то время как поведенческие реакции в этом тесте являются однозначными и анализ измеряет ответов на определенной температуре, животные должен удерживаться во время тестирования, которое может изменять холодной отклика с помощью хорошо описанных индуцированных стрессом обезболивающих механизмов ^7.

Другой часто используемый инструмент является тест холодная плита, которая измеряет поведенческиеОтветы мышей после их помещают на тарелку Пельтье охлаждением ^8-10. В то время как этот инструмент предоставляет информацию о реакции животных на конкретных температурах, было также противоречиво используются; различные группы измерили различные типы реакций, включая числа скачков ^8,11, задержки в первой реакции ^{8,11- 13,} а количество лапы поднимает ^11,13,14 с очень разными результатами. Холодная плита анализ также относительно низкая пропускная способность, как только у одного животного могут быть проверены одновременно, и это требует дорогих и хрупких Пельтье устройство.

Тест предпочтения Температура 2-пластина обычно используется производное теста холодной пластины, который измеряет относительное количество времени, которое животные проводят на 2 соединенных пластин различных температурах ^{9,15- 17.} Другой подобный тест широко используется в термический градиент анализа, где количество времени, которое мышей проводят в различных температурных зонв диапазоне от 5 ° С до 45 ° С на длительный металлической пластины измеряется ^16. Хотя эти анализы позволяют сравнивать температуры, неясно, является ли поведение температуры отвращение или предпочтениями температуры.

Наконец, динамический холодной пластины анализа была использована, чтобы оценить, насколько мышей реагировать на изменение температуры окружающей среды ^18. Этот метод включает в себя размещение мышей на Пельтье устройства RT и наращивает его до 1 ° С при измерении, сколько мышей прыгать или лизать лапы при различных температурах пластины. Хотя это тесты, как мыши, адаптироваться к охлаждающей среде, не обеспечивают способ, чтобы проверить, насколько мышей реагируют на холодную стимула в установлении более низкой температуре окружающей среды. Кроме того, он требует дорогостоящего оборудования для выполнения и не дает возможность акклиматизироваться мышей испытательного оборудования перед измерением их холодной чувствительность.

В дополнение к этим анализы, CPA проверяет ACCLIMAответы Тед четко определенной холодной стимула в различных температурных интервалах, или в процессе адаптации к низким температурам окружающей среды. Она может испытать до 14 мышей в то время, с нашей нынешней аппарата, с потенциалом, чтобы быть недорого расширены для высокой пропускной испытаний.

Protocol

Все протоколы мыши были в соответствии с национальными институтами принципов здравоохранения и были утверждены Комитетом по исследованиях на животных из Вашингтонского университета медицины (Сент-Луис, штат Миссури) на.

1. Подготовка плиты и корпуса тестирования

1. Очистите поверхность стекла.
2. Безопасный Т-типа, термопарой нити на поверхность в середине стеклянной пластины с лабораторной ленты.
3. Поместите корпуса животного на стеклянную пластину в одну линию вдоль середины пластины.
4. Автор термопары через зонд животных корпуса центральной и вставьте в регистратор данных. Включите регистратор данных на при деактивации функции автоматического выключения и прикрепите регистратор данных к компьютеру с помощью входящего в комплект кабеля.
   1. Если запись температуры пластины в процессе эксперимента, откройте программное обеспечение регистратора данных для записи температуры пластины.
   2. Если необходимо, отрегулируйте программное обеспечение зановошнур температура пластины один раз в секунду.
   3. Начните записи температуры с помощью программного обеспечения, поставляемого с тепловым регистратора данных.
5. Отделите корпус с черными вставками для предотвращения визуального взаимодействия между мышами.
6. Положение зеркала под стекла таким образом, что нижняя сторона корпусов видно из удобной сидячем положении.

2. Потепление / охлаждения стеклянной пластины

1. Заполните алюминиевые коробки с подогретой водой, мокрого льда или сухого льда и расположить их соответствующим образом на стеклянную пластину (пакеты из алюминиевой фольги, заполненные сухим льдом также могут быть использованы для охлаждения стекла; Рисунок 1) ^2.
   1. Для испытаний при 30 ° С, положение алюминиевых окон примерно 0,25 '' от корпусов животных (фиг.2В) ^2.
      1. Набор с подогревом воды циркуляционного насоса по обе стороны от стеклянной пластины. Установите циркуляционный насос в 45 - 60 ° С, и насе его для заполнения алюминиевые ящики с постоянным потоком горячей воды (рис 1в) ^2.
      2. Расположите циркуляционные таким образом, что горячая вода из алюминиевых коробок стоков непосредственно в резервуар циркулятора с каждой стороны (рис 1в) ^2.
   2. Для тестирования при комнатной температуре, оставьте поля пустыми (рис 2) ^2.
   3. Для тестирования в 17 ° C, установите флажки около 0,25 '' от корпусов животных по обе стороны и залейте льду (рис 2) ^2.
   4. Для тестирования в 12 ° C, установите флажки около 1,25 '' от корпусов по обе стороны и заполнить с помощью сухого льда (рис 2) ^2.
   5. Для испытаний на 5 ° С, положение коробки примерно 0,25 '' в сторону от корпуса по обе стороны и заполнить сухим льдом (рисунок 2) ^2.
      1. При охлаждении стекла с сухим льдом, убедитесь, что вентиляция для предотвращения CO ₂ накопления в комнате.
2. Подождите, пока стекло, чтобы достичь требуемого температурного диапазона.
3. Добавить мышей корпусов на тарелку.
   Примечание: Генератор белого шума может быть использован, чтобы уменьшить помехи шума.
4. Подождите мыши, чтобы акклиматизироваться.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В нашем учреждении это происходит примерно 2,5 ч, но это может значительно меняться в зависимости от содержания животных и условий обращения.
5. Поддержание стекла в желаемом диапазоне температур, гарантируя, что блоки хранятся полна подогретой водой, мокрого льда или сухого льда.
   ПРИМЕЧАНИЕ: С нашей аппарата коробки должны быть пополнен со льдом примерно каждые 90 мин.
   Примечание: Для C 17 ° условии, что это полезно, чтобы очистить большую часть воды из алюминиевых коробок через дренажные отверстия перед заправкой его со льдом. Это стабилизирует температуру лучше, и прПереполнение событие
   ПРИМЕЧАНИЕ: Точное количество сухого льда сезонным колебаниям, но в целом сохранности урн больше, чем ¼ полные по всей длине коробки будет поддерживать постоянную температуру.

3. Тестирование Мыши при фиксированных температурах

1. Вне поведения комнату, заполнить ведро льда примерно половину полной сухого льда.
2. Используя молоток или молоток, раздавить сухой лед в мелкий порошок.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Переполнение ведро будет трудно в полной мере подавить сухой лед в порошок.
3. Использование прямой лезвия бритвы или ножницы, вырезать довершение 3 мл шприц.
4. С помощью иглы 21 G, совать 3 отверстия на противоположных сторонах шприца (всего 6 отверстий).
   Примечание: Эти отверстия уменьшает давление, создаваемое путем сублимации при сжатии сухой лед. Отсечения шприц можно повторно использовать для нескольких экспериментов.
5. Возьмите шприц, сухой порошок лед, и ручной секундомер в поведенческой комнате.
6. Заполните шприц камеру наполовину полон сухого порошка льда. Удерживая отрезанного конца шприца против плоского объекта, и плотно сжимают порошок с помощью плунжера. Будь осторожен; пластик поршень может погнуться или сломаться от давления или. Если это произошло, замените поршень с новой шприц.
7. Расширение кончик сжатого сухого льда гранулы за край шприца.
8. Тестовые мышей, которые полностью в покое.
   1. При 30 ° С, 23 ° С и 17 ° С, тест мышей, которые имеют все четыре лапы на стекле и не движется, но не в полной мере спит ^19.
   2. В 12 ° С и 5 ° С, тест мышей, которые находятся на 2 лапах или 4 лапы, не двигаясь и прыжки.
9. Использование зеркал для прицеливания, мягко, но твердо нажать плоскую гранул вплотную к поверхности стекла под мышью задней лапы (1А) ^2. Начните ручной таймер.
10. Остановить таймер и удалить осадок, когда мышь перемещается от охлажденного стекла.
    ПРИМЕЧАНИЕ: движение изъятие может быть вертикальным или горизонтальным.
    1. Если очень коротко мыши перемещает лапу, а затем возвращает его на охлаждаемой поверхности, по-прежнему времени и стимулирование, пока мышь не имеет постоянный отход.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Наша лаборатория использует максимальное время Стимул 20 сек для мышей в большинстве случаев.
11. Повторите эту процедуру тестирования по крайней мере до 3 значения на каждой лапе каждого животного не собираются. Отдельные пробы тестирования противоположные лапы на одной и той же мыши, по крайней мере, 7 мин и отдельных последовательных испытаний на какой-либо одной лапкой по крайней мере 15 мин.
12. Если необходимо, используйте различную толщину стекла для создания различных скорости охлаждения (рис 3) ^1.
    ПРИМЕЧАНИЕ: скорость охлаждения обратно коррелирует с толщиной стекла.

4. Тестирование мышей в холодное время адаптации

ПРИМЕЧАНИЕ: Это альтернативный протокол, который позволяет тестировать как стекло Плате охлаждает, а не после того, как пластина стабилизированного и мышей полностью адаптирована к холодной окружающей среде.

1. Следуйте инструкциям, приведенным в разделе 1 для настройки аппарата.
2. Следуйте инструкциям, приведенным в разделе 3, чтобы принять базовые измерения при комнатной температуре (7А) ^2.
3. Предварительного охлаждения алюминиевые ящики с сухим льдом.
4. После того, как исходные задержки вывода были измерены, поместите предварительно охлажденный коробки на пластине примерно 1,25 '' от корпусов по обе стороны (7А, стрелка с надписью "Сухой лед добавил, что") ^2.
5. Следуйте инструкциям, приведенным в разделе 3 для измерений как стеклянная пластина охлаждается, замеры как можно чаще.

Results

Поведенческие реакции, индуцированные у мышей, начиная с 30 ° C, 23 ° C, 17 ° C, и 12 ° C высокой воспроизводимостью (4А) ^20. Для того чтобы измерить холодной стимул быть создан под задней лапы мышей анестезировали смесью кетамина / ксилазина / ацепромазина коктейль и их лапы были закреплены на стекло в верхней части Т-типа нитей термопары (фиг.4В) ^20. Стекло охлаждают или нагревают до желаемой полигоне. Хотя пластина охлаждается равномерно по длине пластины

Discussion

CPA может быть использован для оценки чувствительности к холоду и адаптации к холоду у мышей. Он обеспечивает доступный и эффективный способ измерения реакции на холод у неограниченных, акклиматизированных животных в широком диапазоне температур. Он также обеспечивает однозначную поведенческую реакцию с легко количественно определяемой и анализируемой выходной переменной. Он уже использовался для оценки изменений чувствительности к холоду, вызванных воспалением¹, нейропатической травмой¹, анальг...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Термопарный зонд Т-типа	Physitemp	IT-24p	Используется для измерения температуры поверхности стекла (http://www.physitemp.com/products/probesandwire/)
Стеклянная пластина	Местная стекольная компания (в Сент-Луисе, Stemmerich Inc)		Мы используем стекло pyrex (боросиликатный поплавок). В нашей лаборатории обычно используется 1/4 дюйма, но 3/16 дюйма и 1/8 дюйма также полезны
Терморегистратор данных	Extech	EA15	Термологгер для отслеживания температуры стекла (http://www.extech.com/instruments/product.asp?catid=64&prodid=408)
3 мл Шприц	BD	309657	Верхняя часть срезается, а сухой лед сжимается в шприце для создания холодного зонда
Компьютер	При использовании логгера Extech любой компьютер будет работать
Алюминиевые коробки	Вашингтонский университет в Сент-Луисе Коробки механического цеха		имеют длину 3 фута, ширину 4,5 фута и высоту 3 фута с герметичной крышкой. В одной короткой стороне каждого ящика, недалеко от дна, просверлено отверстие в 1/2 дюйма. Эти отверстия заполняются резиновыми запорными кранами, когда ящики заполнены влажным льдом или горячей водой.
Циркуляционный насос с подогревом VWR			Подойдет любая модель циркуляционного насоса с насосом
Игла 21 G	BD	305165	Точный размер иглы не важен
Ручной таймер			Подойдет любой ручной таймер
Зеркало			Подойдет любое плоское зеркало