Методическая статья

Быстрая и надежная Трубопровод Бактериальный Транскриптом Анализ Case Study: серин-зависимой регуляции генов в Пневмококк

DOI:

10.3791/52649

⸱

25 апреля 2015 г.

 ,  , 
1Department of Molecular Genetics, Groningen Biomolecular Sciences and Biotechnology Institute, University of Groningen, 2Department of Bioinformatics and Biotechnology, Government College University Faisalabad

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этой рукописи описывается использование самых современных технологий, предоставляемых ДНК-микрочипами. Микрочипы обеспечивают обзор транскриптомных изменений у бактерий, возникающих в определенных условиях. Кроме того, мы отмечаем простоту анализа больших объемов данных с помощью удобных программных пакетов собственной разработки.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Экспрессия генов и его регулирование очень важно понять поведение клеток в различных условиях. Различные методы используются в настоящее время для изучения экспрессии генов, но большинство из них ограничены в плане предоставления общей картины выражения всей транскриптома. ДНК-микрочипы обеспечивают быстрый и экономическое исследование технологии, которая дает полное представление о глобальной экспрессии генов и имеют огромное количество приложений, включая определение новых генов и сайтов связывания транскрипционных факторов, характеристику транскрипционной активности клеток, а также помочь в анализе тысячи генов (в одном эксперименте). В настоящем исследовании, условия для бактериальной анализа транскриптома от урожая клеток к анализу ДНК микрочипов были оптимизированы. Принимая во внимание время, затраты и точность экспериментов, это технологическая платформа оказывается очень полезным и универсальным applicabale для изучения бактерий transcriptoмес. Здесь мы проводим анализ ДНК микрочипов с Пневмококк как кейс-стади, сравнивая транскрипционные ответы S. пневмонии, выращенные в присутствии различных L-серин концентрации в среде. Общую РНК выделяли с помощью Macaloid метод с использованием набора для выделения РНК и качество РНК была проверена с помощью проверки качества РНК комплект. кДНК получали с использованием обратной транскриптазы и образцы кДНК были помечены с использованием одного из двух аминных реакционноспособных флуоресцентных красителей. Домашние микрочипов слайды ДНК были использованы для гибридизации с мечеными образцов кДНК и данных микрочипов были проанализированы с помощью рамки кДНК микрочипов предварительной обработки данных (Microprep). Наконец, Cyber-T был использован для анализа данных, полученных с помощью Microprep для идентификации статистически значимых дифференциально выраженных генов. Кроме того, в доме, построенные пакеты программного обеспечения (перец, FIVA, раскрывать, прокурора, Genome2D) были использованы для анализаДанные.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Изучение всей совокупности мРНК изобилие (транскриптома) кодируется геном одноклеточного организма или эукариотической клетки в определенное время или при определенном состоянии, включая гена повышенной экспрессией или нокаута, называется транскриптомике. Транскриптомике позволяет наблюдать то, что гены экстентов экспрессируется под определенным состоянием в момент времени X и дает нам информацию о том, как сильно гены выражены относительно эталона.

Микрочипов является двумерный массив на твердом субстрате (как правило, предметное стекло или кремний тонкопленочных клетки), которые могут быть использованы для анализа больших количеств биологического материала с помощью высокопроизводительного скрининга, и миниатюрные, мультиплексируются и параллельной обработки и обнаружение методы. Microarrays прийти в различных типов, в том числе ДНК-микрочипов, белковых микрочипов, пептидные микрочипов, ткани микрочипов антител микрочипов, клеточных микрочипов и других. Микрочипов ДНКосновном сборка микроскопических точек ДНК фиксируют на твердой поверхности, как правило, стекла. ДНК-микрочипы используются для измерения уровня экспрессии гена или набор генов одновременно или к генотипу нескольких регионов генома 2,3. Пикомолях (10 -12 моль) зонда присутствуют в каждой точке ДНК, которая представляет собой определенную последовательность ДНК, также известный как репортер. Меченые молекулы мРНК из образцов называют «цели». Флуорофоры используются для измерения гибридизации зонд-мишень и обнаружение меченного флуорофором целей определяет относительное содержание последовательностей нуклеиновых кислот в мишени. Микрочипов эксперимент может выполнить несколько генетических тестов параллельно, потому что массив может содержать десятки тысяч датчиков. Схема простого микрочипов эксперимента показан на рисунке 1. Недавно было установлено, в нашей и других лабораториях, что эти массивы являются многоразовыми, что делает этот технику довольно затрат effectivе.

Различные методы выделения РНК и очистки были разработаны в течение многих лет, включая C-TAB, SDS и методов GT 4 - 8. Кроме того, несколько коммерческих наборов, также доступны. Для экспрессии гена РНК высокого качества очень важно. Таким образом, методы выделения РНК модифицируют, чтобы получить максимальное количество РНК. Кроме того, шаги для подготовки кДНК и маркировки кДНК сведены к минимуму. Нормализация данных после сканирования осуществляется также эффективно, используя в-дом, построенный пакеты и инструменты 9 программного обеспечения.

Пневмококк является грам-положительных человек патогенный микроорганизм, который колонизирует носоглотку и является причиной множества инфекций, таких как пневмония, сепсис, отит и менингит 10. Бактерия может использовать широкий спектр питательных веществ, необходимых для роста и выживания 11,12. Ряд исследований были проведены напневмококковая азотный обмен веществ и регулирование подчеркивая важность аминокислот и их роль в вирулентности 13,14. В этом исследовании, транскриптомных ответ S. пневмонии на изменение концентрации L-серин, аминокислота в изобилии присутствуют в плазме крови человека, сообщается с использованием ДНК-микрочипов. Транскриптомных ответ S. пневмонии выращивают в минимальной концентрации L-серин (150 мкм) по сравнению с выращивали в максимальной концентрации (10 мМ) серина. Химически определенной среде (CDM или минимальной среде) 15 использовали в этом исследовании, чтобы контролировать концентрацию серина. Целью данного исследования является сделать этот метод удобно и обеспечить различные инструменты для нормализации и анализа данных. Таким образом, количество инструментов были разработаны для анализа и интерпретации данных. FIVA (функциональный Information Viewer и Analyzer) предоставляет платформу для обработки информации, содержащейся в кластерах генов, имеющихПохожие паттерны экспрессии генов, а также для построения функциональных профилей 16. Прокурор другой программный пакет, который облегчает идентификацию предполагаемых функций и аннотации генов 17. Благодаря использованию методов кластеризации, раскрывают обеспечивает ДНК-связывающего алгоритм обнаружения сайт. СНГ -regulatory мотивы генов может быть проецируются с помощью этого алгоритма 18. Genome2D предлагает для Windows-платформы для визуализации и анализа данных транскриптом, предлагая различные цветовые диапазоны для характеристики изменений в уровнях экспрессии генов на карту генома 19. Перец веб-сервер предлагает, в дополнение к методу все-в-одном анализе, набор инструментов для добычи для регулоны, промоутеров и связывающий фактор транскрипции сайтов 20. Полное аннотации межгенных в бактериальный геном может быть достигнуто с помощью этого пакета. Биологи могут извлечь большую пользу из перца, как это предлагает им платформу для разработки экспериментс тем чтобы гипотетический информация может быть подтвержден в пробирке 20. Эти программные пакеты вносят существенный вклад в анализ микрочипов, поскольку большинство из них находятся в свободном доступе и сделать нормализация и анализ данных очень надежным.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Подготовка средств массовой информации, и в клеточной культуре

  1. Растут S. пневмонии D39 штамма дикого типа 21, как описано выше 11. Посев клеток хранили при -80 о С в 10% глицерине (с 1/100 соотношении в 50 мл стерильные пробирки) в 50 мл химически определенной среде (CDM) с конечным значением рН 6,4 15, но пропустить L-серин из аминокислоты смесь.
    Примечание: используются два различных СУБКД; один, содержащий минимальную концентрацию L-серин (150 мкм) и другой, содержащей максимальную концентрацию L-серина (10 мм). Это минимальная концентрация в основном концентрация L-серина в плазме крови человека и цель состоит в том, чтобы сравнить экспрессию генов S. пневмонии D39 деформаций при выполнении этих двух условий.

2. Выделение тотальной РНК

  1. Материалы
    1. Использование кислоты фенол, РНК класс для выделения тотальной РНК.
    2. Macaloid:
      1. Приостановить 2 граммаmacaloid в 100 мл ТЕ и кипятить в течение 5 мин. Охлаждают до комнатной температуры и разрушать ультразвуком до macaloid gels.Centrifuge раствор при 2000 х г в течение 5 мин при комнатной температуре, вновь суспендируют в 50 мл ТЕ рН 8 и хранят при температуре 4 ° С.
    3. Решения:
      1. Лечить все решения диэтиловым пирокарбоната (DEPC). Добавить 100 мкл DEPC / 100 мл раствора, инкубируют O / N при 37 ° С и автоклав в течение 15 мин.
  2. Методология
    1. Вырастить 50 мл S. клеточная культура пневмонии D39 в 50 мл пробирки на 37 о С (не встряхивая) до середины экспоненциальной фазы (OD ~ 0.3). Центрифуга культуры при 4 ° С на 10000 × г в течение 2 мин. Отменить массовой информации и немедленно заморозить ячейки гранул в жидком азоте.
    2. Премикс 300 мкл хлороформ: IAA (24: 1) и 300 мкл фенола (фенол кислоты, РНК класс). Использование 500 мкл органической фазы на этапе 2.2.3.
    3. Подготовьте следующую смесь заранее в РНК-Free завинчивающейся крышкой труб: 00,5 г стеклянных шариков, 50 мкл 10% SDS, 500 мкл фенол / хлороформ: IAA (как полученного на стадии 2.2.2), macaloid слой (150-175 мкл, не точно, поскольку это очень вязкой). Ресуспендируют клеток гранул в 400 мкл ТЕ (DEPC) и добавить Ресуспендированный клеток в завинчивающейся крышкой трубки.
    4. Чтобы разорвать клетки, положите завинчивающейся крышкой трубки в шаровой насадкой в ​​течение 2х 60 "импульсов ('гомогенизации») с 1-минутного интервала на льду. Центрифуга образцы в течение 10 мин при 10000 х г (4 ° C).
    5. Передача верхней фазы в новую пробирку, добавляют 500 мкл хлороформ: IAA (24: 1) и центрифугируют в течение 5 мин при 10000 х г (4 ° C).
    6. Передача 500 мкл верхней фазы в свежие пробирки, добавляют 2 объемов (1 мл) лизиса / буфера для связывания и перемешать с помощью пипетки вверх и вниз. Изолировать общей РНК с использованием набора для выделения РНК и следуйте рекомендуемым изготовителем протокол.

3. РНК Очистка

< ол>
  • Чтобы удалить загрязнения ДНК из общей РНК, добавить 100 мкл DNAseI смесь (90 мкл ДНКазы буфера и 10 мкл DNAseI) и инкубировать в течение 20-30 мин при температуре 15-25 ° С.
  • Вымойте чистить РНК с использованием набора РНКазы. Получение 50 мкл элюированного объема.

    • 4. Анализ РНК

    1. Определить концентрацию РНК на спектрофотометре. Определить качество РНК с использованием анализа следующим образом (рисунок 2).
      1. Развести 1 мкл образца с 50 мкл DEPC воды, чтобы получить концентрацию 20-200 нг / мкл.
      2. Используйте 1 мкл пробы разбавляют РНК, чтобы проверить качество на Bioanalyser в соответствии с инструкциями изготовителя.
    2. Примечание: соотношение 23S: 16S из вокруг 2,0 считается хорошим 1 A260 Блок РНК соответствует 40 мкг / мл.. Рекомендуемое количество для маркировки составляет 10-20 мкг.

    5. кДНК Подготовка и маркировка

    ntent "> Примечание: последовал следующий протокол для подготовки кДНК и маркировки.

    1. Отжиг
      1. Выполните реакцию отжига в 300 мкл ПЦР пробирок, сохраняя общую концентрацию РНК 10-15 мкг для самодельных слайдов или 5 мкг для компании сделал слайдов. Смешайте РНК с 2 мкл случайных nonamers (1,6 мкг / мкл) и добавления нуклеазы без воды, если это необходимо, чтобы конечный объем отжига смеси с 18 мкл.
      2. Хранить отжига смеси при 70 ° С в течение 5 мин. После этого, охладить смесь до комнатной температуры в течение 10 мин (отжига) и, при необходимости, спин вниз реакции на дне пробирки. Поместите реакционные трубы на льду в течение по крайней мере 1 мин.
    2. С обратной транскрипцией
      1. Подготовьте обратной транскриптазы смесь следующим образом: до 18 мкл отжига смеси, добавить 12 мкл основной смеси (состоящий из 6 мкл 5x первых Strand буфер, 3 мкл 0,1 М ДДТ, 1,2 мкл 25х АА-дУТФ / нуклеотидные смеси и 1,8 мкл обратной тranscriptase (1 мкл для компании сделал слайдов). Хранить реакционную смесь в течение 2-16 ч при 42 ° С.

    6. Деградация мРНК и очистка кДНК

    1. Деградировать мРНК из реакционной смеси, добавить 3 мкл 2,5 М NaOH и место при 37 ° С в течение примерно 15 мин. Затем добавляют 15 мкл 2М ​​HEPES свободной кислоты для нейтрализации NaOH.
    2. Очищают кДНК смесь с помощью ПЦР колонки по очистке и следовал протоколу производителя.

    7. Измерение кДНК концентрации

    1. Измерения концентрации кДНК на спектрофотометре. Чтобы продолжить маркировки, убедитесь, что концентрация кДНК, по крайней мере 60 нг / мкл (домашние горки) или 20 нг / мкл (компания-сделано слайды).

    8. Маркировка кДНК с амин-реактивных красителей и очистки

    1. Использование аминного-реактивный краситель для обозначения кДНК. Непосредственно смешать кДНК с одной аликвоты (5 мкл)амин-реактивных красителей.
    2. Выдержите смесь при комнатной температуре, в темноте, в течение от 60 до 90 мин и приступить непосредственно к очистке красителя меченного кДНК. Очищают кДНК красителя помечены с помощью ПЦР колонки по очистке и в соответствии с протоколом производителя. Элюции кДНК в 50 мкл буфера для элюции.

    9. Измерение Меченые кДНК

    1. Использование спектрофотометра для измерения включения аминов активных красителей в кДНК. Убедитесь, что концентраци амина активных красителей, по меньшей мере 0,5 пмоль / мкл в общем объеме 50 мкл.

    10. Смешивание образцов маркировкой кДНК

    1. Для домашней слайдов, использовать все меченого кДНК для гибридизации с разницей в концентрации кДНК не более 30%. Для компании сделал слайды, использовать кДНК с не более чем 2-кратное различие в концентрации кДНК.
      Примечание: как правило, около 300 нг кДНК необходим для производства компании слайдов, которые очень мало по сравнению с REQuired количество кДНК для самодельных слайдов.

    11. гибридизации и промывки

    1. Используйте следующие реагенты: деми воде, этаноле 99%, застенчивая буфера (домашнее; с 40 мкл РНК дрожжей). Подготовка максимум 1 мл застенчивый.
    2. Приборы и приготовления растворов
      1. Включите вакуумных концентраторов и нагревателя, по крайней мере 1 час перед сушкой. Включение гибридизации печи, с заданным значением скорректированной до нужной температуры гибридизации (для S.pneumoniae, ДНК-микрочипов, использовать 45 ° C). Точно так же, разогрейте гибридизации кассету и печь в течение 30-60 мин.
      2. Разогреть Shy буфер на 68 ° С в течение по крайней мере 30 мин.
    3. Подготовка образцов (помечены кДНК)
      1. Зерноуборочный равные количества меченых кДНК (макс разностных 30%). Сушат образец с использованием вакуумных концентраторов при высокой температуре (прибл. 40 мин), пока объем не меньше, чем 7 мкл.
    4. Lifter скольжения
      1. Используйте чистые поводковые-слипы.Примечание: ± 30 мкл может быть загружена на слайде.
      2. Очистите атлет-слипы с мылом, большим количеством водопроводной воды и 100% этанола. Примечание: Грязные скользит подъемник дать высокий фон.
      3. Воздух сухой атлет-слипы с пневматического пистолета, чтобы сдуть пылинки. Поместите чистую подъемника скольжения на слайде с белым тефлоном по бокам вниз.
    5. Добавление гибридизации буфер (с меченым кДНК)
      1. Растворите образцы высушенных красителя в 7 мкл H 2 O и инкубировать при 94 ° С в течение 2 мин.
      2. Сразу же, добавить 35 мкл предварительно нагретой Shy буфер (68 ° C), мягко и спин смешать с максимальной скоростью в течение 1 мин, чтобы избавиться от выделений. Разогреть зонд на 68 ° С в течение примерно 5 мин до нагрузки.
    6. Слайд-подъемник-Slip сборки и прогрева.
      1. Поместите держатель гибридизации скользить по тепловой блок на 50 ° C. Поместите микрочипов ДНК слайды с подъемника скольжения на раскаленной держателя гибридизации слайд и рразогреть слайд с подъемника скольжения на минуту. Выполните следующие шаги как можно быстрее.
      2. Добавить 40 мкл образца мишени в конце ползуна. Дайте текучей среды между стеклянными поверхностей капиллярных сил. Выполните все пипеткой медленно и осторожно.
      3. Держите слайды с ручка Нескользящая горизонтали во все времена и двигаться медленно, чтобы убедиться, что ручка скользит не двигаться.
      4. Возьмем предварительно нагревают кассету гибридизации из гибридизации печи и закрыть машину. Место фильтр-бумага пропитывается 3 мл 2х SSC (стандартный раствор хлорида цитрат) в гибридизации кассеты.
      5. Аккуратно поместите держатель слайдов гибридизации с горками в гибридизации кассеты. Закройте гибридизации кассету и положите в гибридизации печь снова (около 16-18 часов).
    7. Презентация стиральная
      1. Подготовка свежие мыть-буферов I, II и III (750 мл на стадию промывки). Для 500 мл мыть-буфер ввода, используйте 2 х SSC / 0,5% SDS. Для 500 мл моющего-любителяэ II, использовать 1 х SSC / 0,25% SDS. Для 500 мл мыть-буфер III, используйте 1 х SSC / 0,1% SDS (по желанию)
      2. Поместите Вымойте буферов при 30 ° C (правда SDS растворяли).
      3. Погрузите слайды как можно быстрее, но очень осторожно, в сокола трубки, заполненной 50 мл буфера мыть я пока стекло не опирается на конической нижней части трубы.
      4. Через несколько секунд, когда атлет-скольжения опускается на дно пробирки, вынуть слайд с помощью пинцета, не царапая массив и поставить в стойку для стирки станции. Продолжить с промывкой без временного промежутка.
      5. Промыть слайды в течение 5 мин в 500 мл буфера мыть-I (в стиральной станции). Дайте ему второй промывки в течение 20-30 мин в 500 мл моющего буфера II (в стиральной станции). Кроме того, мыть слайды в течение 5 мин в 500 мл буфера мыть-III (по желанию) (в стиральной станции).
      6. Высушите слайды течение 2 мин при 2000 оборотах в минуту.

    12. микрочипов анализ

    1. Сканирование изображенийс соответствующими длинами волн в сканер и сохранить в папке "Юпитер проекта".
    2. Используйте программное обеспечение для анализа отсканированных файлов, изначально, как описано выше 22. После выполнения этой программы, выберите вкладку "Открыть изображение", чтобы загрузить файл красный изображения (-.550), как «красные» и зеленой файл изображения (-.635) в качестве "Зеленый". Загрузить файл Gal (.gal), имеющий S.pneumoniae, список массивов по файлу изображения, выбрав "Load массива List" вкладку 22.
      Примечание: этот список массив состоял из 48 сеток, на каждой сетке было 16 строк и 15 столбцов. Каждое пятно на сетке представляет собой один ген, и местом информацию, включая имя гена добавляют через описание местом файл. Цифры местная приведены слева направо и сверху вниз.
    3. После тщательного кровянистые выделения сетки, выберите вкладку "Найти массива, Найти блоков, Выровнять Особенности", чтобы выровнять пятна. После выравнивания все возможности, проанализировать изображение, выбрав «Анализируя" тAB. Создайте новый файл, имеющий результаты, гистограммы и точечный график. Сохраните этот файл на вкладке «сохранять результаты в виде" как .gpr файл для дальнейшего анализа.
    4. Выполните дальнейшей нормализации и обработки данных с собственной разработки программного пакета Microprep, как описано 9.
    5. Используйте независимых биологических повторяет для ДНК микрочипов данные, которые красителя местами. Выполнение реализации CyberT варианта трет-test1 и цену ложные обнаружения (FDRs), как описано 9.
    6. Для дифференциально выраженных генов, взять р <0,001 и FDR <0,05 в качестве стандарта.
    7. Загрузить микрочипов данные ДНК на странице подачи NCBI, чтобы получить GEO (Gene Expression Omnibus) инвентарный номер.

    Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

    Результаты

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    РНК, кДНК изоляция и анализ

    L-серин является одним из незаменимых аминокислот, и его концентрация в плазме крови человека составляет от 60-150 мкМ у детей и взрослых. Его роль в биосинтезе пуринов и пиримидинов подчеркивает его значение в метаболизме и является предшественником нескольких аминокислот (глицин, цистеин и триптофан). Для изучения влияния L-серин на весь транскриптома из S. пневмонии D39 штамма дикого типа, микрочипов анализ D39 штамма, выращенного в МЧ...

    Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

    Обсуждение

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    Опишем протокол удобный, которые могут быть применены, чтобы выполнить всю транскриптом анализ бактерий. Ключевым моментом об этом конкретном методе является то, что условие, при котором собирают клетки будет меняться. После сбора клеток и выделение РНК, эта методика становится равным для всех типов бактериальных образцов и следует точно одинаковые шаги, и, следовательно, могут быть применены к любому типу бактериальной культуры. Протокол очень простой и удобный и начинается с выделения РНК. Наш протокол выделения РНК (...

    Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

    Раскрытие информации

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    Авторы заявляют, что они не имеют конкурирующие финансовые интересы.

    Благодарности

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    Мы благодарим Анну де Йонг и Сигер Holsappel за помощь в ДНК-микрочипов производства слайдов. Поддержка Энн де Йонг для анализа биоинформатики также оценены. Мы также благодарим Йелле Slager для рассмотрения этого документа. Мухаммад Афзал и Ирфан Мансур поддерживаются GC университета, Файсалабаде, Пакистан в рамках программы развития факультета ГЭЦ Пакистане.

    Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

    Материалы

    Список материалов, использованных в этой статье
    ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
    Кислотный фенолSigmaAldrichP4682
    Набор для выделения РНК RocheПрикладная наука11828665001
    Стеклянные шарики105015
    хлороформомBoom92013505.1000.
    IAA106630
    NanodropNanodropND-100
    Agilent BioAnalyserAgilentG2940CA
    Superscript IIILife technologies Invitrogen18080044
    AA-dUTPLife technologies InvitrogenAM8439
    DDTLife technologies Invitrogen
    First Strand BufferLife technologies Invitrogen18080044
    NaOHSigmaAldrichS8045-1KG
    HEPESSigmaAldrichH4034-500G
    DyLight-550Thermoscientiffic62262
    DyLight-650Thermoscientiffic62265
    SHY BufferSigmaAldrichH7033-125ML
    Охладитель SpeedvacEppendorfRUGNE3140концентратор Speedvac плюс
    гибридизационная печьGrant BoekelIso-20
    Lifter-slipsErie Scientific25x60I-M-5439
    СалфеткаKIMTECH
    SDSSigmaAldrichL3771-100g
    SSCSigmaAldrichW302600-1KG-K Автозагрузчик
    Genpix 4200A1MSD аналитические технологииМикрочип сканер
    Бикарбонат натрияSigmaAldrich104766
    18080044

    Ссылки

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
    1. Kayala, M. A., Baldi, P. Cyber-T web server: differential analysis of high-throughput data. Nucleic Acids Res. 40, W553-W559 (2012).
    2. Chang, T. W. Binding of cells to matrixes of distinct antibodies coated on solid surface. J. Immunol. Methods. 65, 217-223 (1983).
    3. Schena, M., Shalon, D., Davis, R. W., Brown, P. O. Quantitative monitoring of gene expression patterns with a complementary DNA microarray. Science. 270, 467-470 (1995).
    4. Galau Levi, A., A, G., Wetzstein, H. Y. A rapid procedure for the isolation of RNA from high-phenolic-containing tissues of pecan. 27 (12), 1316-1318 (1992).
    5. Lopez-Gomez, R., Gomez-Lim, M. A. A method for extraction of intact RNA from fruits rich in polysaccharides using ripe mango mesocarp. (5), 440-442 (1992).
    6. Salzman, R. A., Fujita, T., Salzman, Z., Hasegawa, P. M., Bressan, R. A improved RNA isolation method for plant tissues containing high levels of phenolic compounds or carbohydrates. Plant Molecular Biology Report. 17, 11-17 (1999).
    7. Kiefer, E., Heller, W., Ernst, D. A simple and efficient protocol for isolation of functional RNA from plant tissues rich in secondary metabolites. Plant Mol. Biol. Report. 18, 33-39 (2000).
    8. Tattersall, E. A. R., Ergul, A., Alkayal, F., Deluc, L., Cushman, J. C., Cramer, G. R. Comparison of methods for isolating high-quality RNA from leaves of grapevine. Am. J. Enol. Vitic. 56, 400-406 (2005).
    9. Van Hijum, S. A. F. T., Garcia de la Nava, J., Trelles, O., Kok, J., Kuipers, O. P. MicroPreP: a cDNA microarray data pre-processing framework. Appl.Bioinformatics. 2, 241-244 (2003).
    10. Kadioglu, A., Weiser, J. N., Paton, J. C., Andrew, P. W. The role of Streptococcus pneumoniae virulence factors in host respiratory colonization and disease. Nat.Rev.Microbiol. 6, 288-301 (2008).
    11. Afzal, M., Shafeeq, S., Kuipers, O. P. LacR is a repressor of lacABCD and LacT is an activator of lacTFEG, constituting the lac gene cluster in Streptococcus pneumoniae. Appl. Environ. Microbiol. 80, 5349-5358 (2014).
    12. Afzal, M., Shafeeq, S., Henriques-Normark, B., Kuipers, O. P. UlaR activates the expression of the ula operon in Streptococcus pneumoniae in the presence of ascorbic acid. Microbiol. Read. Engl. , (2014).
    13. Hendriksen, W. T., et al. Site-specific contributions of glutamine-dependent regulator GlnR and GlnR-regulated genes to virulence of Streptococcus pneumoniae. Infect. Immun. 76, 1230-1238 (2008).
    14. Kloosterman, T. G., Kuipers, O. P. Regulation of arginine acquisition and virulence gene expression in the human pathogen Streptococcus pneumoniae by transcription regulators ArgR1 and AhrC. J. Biol. Chem. 286, 44594-44605 (2011).
    15. Kloosterman, T. G., Bijlsma, J. J. E., Kok, J., Kuipers, O. P. To have neighbour's fare: extending the molecular toolbox for Streptococcus pneumoniae. Microbiol. Read. Engl. 152, 351-359 (2006).
    16. Blom, E. J., et al. FIVA: Functional Information Viewer and Analyzer extracting biological knowledge from transcriptome data of prokaryotes. Bioinforma. Oxf. Engl. 23, 1161-1163 (2007).
    17. Blom, E. J., et al. Prosecutor: parameter-free inference of gene function for prokaryotes using DNA microarray data, genomic context and multiple gene annotation sources. BMC Genomics. 9, 495(2008).
    18. Blom, E. J., et al. DISCLOSE : DISsection of CLusters Obtained by SEries of transcriptome data using functional annotations and putative transcription factor binding sites. BMC Bioinformatics. 9, 535(2008).
    19. Baerends, R. J. S., et al. Genome2D: a visualization tool for the rapid analysis of bacterial transcriptome data. Genome Biol. 5 (5), R37(2004).
    20. De Jong, A., Pietersma, H., Cordes, M., Kuipers, O. P., Kok, J. PePPER, a webserver for prediction of prokaryote promoter elements and regulons. BMC Genomics. 13, 229(2012).
    21. Lanie, J. A., et al. Genome sequence of Avery's virulent serotype 2 strain D39 of Streptococcus pneumoniae and comparison with that of unencapsulated laboratory strain R6. J. Bacteriol. 189, 38-51 (2007).
    22. Molecular Devices, Corp. GenePix Pro 6.0 Microarray Acquisition and Analysis Software for GenePix Microarray Scanners-Use's Guide and Tutorial. , Molecular Devices, Corp. (2005).

    Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

    Перепечатки и разрешения

    Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

    Запросить разрешение

    Теги

    MicroprepCyber T

    Похожие статьи