Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

7.9K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/52672

⸱

30 июня 2015 г.

 ,  ,  , 
1Department of Medicine and New Jersey Medical School Cancer Center, Rutgers New Jersey Medical School

В этой статье

Краткое содержание

Мы разработали in vitro модель покоя в костном мозге для чувствительных к эстрогену клеток рака молочной железы. Целью данного протокола является демонстрация использования модели для изучения молекулярной и клеточной биологии покоя и для генерации гипотез для последующей проверки in vivo.

Аннотация

Изучение покоя рака молочной железы в костном мозге является исключительно трудным предприятием из-за сложности взаимодействия спящих клеток с их микроокружением, их редкости и подавляющего избытка гемопоэтических клеток. С этой целью мы разработали in vitro 2D клоногенную модель покоя чувствительных к эстрогену клеток рака молочной железы в костном мозге. Модель состоит из нескольких ключевых элементов, необходимых для покоя. К ним относятся: 1) использование чувствительных к эстрогену клеток рака молочной железы, которые могут оставаться в состоянии покоя в течение длительных периодов времени, 2) инкубация клеток с клоногенной плотностью, где структурное взаимодействие каждой клетки происходит в первую очередь с субстратом, 3) фибронектин, ключевой структурный элемент костного мозга и 4) FGF-2, фактор роста, обильно синтезируемый стромальными клетками костного мозга и в значительной степени откладывающийся во внеклеточном матриксе. Клетки, инкубированные с FGF-2, образуют спящие клоны через 6 дней, которые состоят из 12 или менее клеток, которые имеют отчетливый плоский вид, значительно больше и более разбросаны, чем растущие клетки, и имеют большое соотношение цитоплазмы к ядру. Напротив, клетки, инкубированные без FGF-2, образуют преимущественно растущие колонии, состоящие из >30 относительно небольших клеток. Возмущения системы антителами, ингибиторами, пептидами или нуклеиновыми кислотами на 3-е сутки после инкубации могут существенно влиять на различные фенотипические и молекулярные аспекты спящих клеток на 6-е сутки и могут быть использованы для оценки роли мембранно-локализованных или внутриклеточных молекул, факторов или сигнальных путей в спящем состоянии или выживаемости спящих клеток. Признавая природу анализа in vitro, он может функционировать как очень полезный инструмент для сбора важной информации о молекулярных механизмах, необходимых для создания и выживания спящих клеток. Эти данные могут быть использованы для генерации гипотез для проверки на моделях in vivo.

Введение

Клетки рака груди метастазы в костном мозге до того, как болезнь обнаруживается 1, как только небольшие опухоли развиваются кровеносные сосуды 2,3. Метастатического процесса является быстрое, но неэффективно. Клетки ввести новые кровеносные сосуды быстро, в миллионы за 4 дня, но немногие выживают поездку в отдаленные органы 5. Тем не менее, некоторые микрометастазы выжить в кости и могут быть найдены в виде отдельных клеток или небольших комков клеток в клетках костного мозга от вновь диагностированных пациентов 1. Эти клетки сопротивляться адъювантной химиотерапии, который находится в ведении именно для устранения их 6. Это сопротивление наделен, по существу, путем выживания сигнализации по инициативе взаимодействия с микросреды костного мозга 7,8. Микрометастазы можно найти примерно в одной трети женщин с локализованным раком молочной железы и представляют собой самостоятельную показатель выживания при анализе одномерного анализа 9. Некоторые micrometastases являются рост инициативе, но узоры рецидивов зависит от типа клеток. Пациенты с тройным негативным раком молочной железы, как правило, повторяются от 1 до 4 лет, предполагая, плохой контроль над неактивном состоянии. Другие типы клеток, в том числе ER / PR + клеток, могут оставаться в состоянии покоя до 20 лет, с постоянным, непрерывным скорости рецидива 10. В то время как различия в неактивности подписей экспрессии генов между ER + и ER-клеточных линий и опухолей молочной железы отражают различные потенциалы покоя 11, взаимодействия с стромы костного мозга, вероятно, представляют собой значительный вклад в покое.

Изучение покоя в естественных условиях исключительно трудно, потому что микрометастазы редки и превосходили гемопоэтических клеток более чем на 10-кратно 6. Следовательно, соответствующие модели должны быть созданы, которые обеспечивают в пробирке данных, которые могут предложить механизмы и генерировать проверяемые гипотезы в естественных условиях. Ряд моделей неактивности, в том числе Matheматическое модели 12,13, в пробирке моделей 7,8,14,15, в естественных условиях модели ксенотрансплантатов 16, комбинации в пробирке и модели ксенотрансплантата 17,18 и спонтанные опухоли и метастазирование модели 19, дали некоторое представление раковых клеток покоя 20 , Каждая из этих моделей имеет свои ограничения и сами по себе, прежде всего, полезен для генерации гипотез относительно молекулярной сигнализации и взаимодействий, которые регулируют покоя, чтобы быть проверены в более биологически соответствующих моделей.

С общей цели определения молекулярных механизмов покоя, взаимодействия с микросреды, что приводит к цикла ареста, повторной дифференцировки и терапевтического сопротивления и механизмов, которые приводят к рецидиву в ER + клеток, мы разработали модель в пробирке, что обеспечивает выбранный соответствующие элементы стромальных микросреда 7. Эта модель, в то время как относительно редкие в его компоненты, достаточно прочный, чтобы разрешить следователям, чтобы получить конкретные молекулярные механизмы, которые влияют на важные функции покоя. Эти эксперименты генерации гипотез, которые могут быть проверены непосредственно в живом организме. Модель опирается на несколько ключевых элементов, которые мы продемонстрировали, что отношение в покое. Они включают в себя использование эстроген-зависимых клеток рака молочной железы, культуры клеток на более клоногенном плотности, где их взаимодействие в первую очередь с субстратом и растворимыми компонентами среды, фибронектином субстрат и при наличии основного фактора роста фибробластов (FGF-2) в среде.

Мы охарактеризовали механизмы, которые регулируют систему в пробирке, в том числе индукции ареста клеточного цикла по FGF-2 21, опосредованного TGF-beta 22, выживание сигналов через PI3 киназы 7,8 и 8 Эрк и морфогенного дифференциации в эпителиальной фенотипа, который зависит от RhoA инактивации, интегрину45; 5β1 регуляция и перевязка стромы фибронектина за выживание 7,15 (Рисунок 1). Эффекты в пробирке клеточного цикла FGF-2 на MCF-7 клетки начинают при концентрации, по меньшей мере одно бревно ниже 10 нг / мл 21,23. Обоснованием была основана на временной контроль FGF-2, регулирующего экспрессию молочной протоков морфогенез, циклический расширение и спад в ряде систем млекопитающих 24-27. Мы показали, что FGF-2, индуцирует дифференциацию, в том числе протоковой морфогенеза в 3D культуры 28, и что FGF-2 экспрессии, как правило, теряется со злокачественной трансформации человеческих опухолей 29. Выражение FGR1 остались нетронутыми в раке груди опрошенных 29 и MCF-7 клетки продолжают выражать все 4 FGF рецепторы 30. В контексте покоя, FGF-2 экспортируется и в значительной степени на хранение на стромы костного мозга 31,32, где она функционирует в сохранении гемопоэтических стволовых клеток 33. Мы демonstrated, что FGF-2 индуцирует состояние покоя в ER + клеток рака молочной железы, культивированных на субстратах, фибронектина и обильной в мозге, где он вызывает морфологическую дифференциацию 7. В модели, клетки рака молочной железы являются рост ингибируется, инактивируют Rho A через RhoGAP Граф, чтобы повторно дифференцировать эпителиального фенотипа, и повторно экспресс интегринов α5β1 lost со злокачественной прогрессии. Они связывают фибронектин через интегринового α5β1 и активировать выживание понять, что делает их устойчивыми к цитотоксической терапии 7,8,15 (рис 1). Ингибирование Rho класса GTPases была продемонстрирована ранее, чтобы побудить покоя фенотипа 34.

Здесь мы будем наметить конкретные процедуры, которые позволят следователям установить модель и изучать конкретные молекулярные и клеточные механизмы, регулирующие дремоту ER + клеток рака молочной железы. В экспериментах, представленных здесь, чтобы проиллюстрировать использование моделиМы ориентировались на PI3K пути (рис 1B) с Akt ингибитора и ингибитора PI3K и всех членов семьи Ро (рис 1B) с ингибитором пан-Ро и (ROCK) ингибитора киназы Rho.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. клоногенности

  1. Подготовка одноклеточных суспензий из эстроген-зависимых линий клеток рака молочной железы MCF-7 и T47D клетки, используя шаги, описанные ниже
    1. Аспирируйте культуральную среду (DMEM / 10% тепла инактивированной фетальной телячьей сыворотки / глутамин и ручка / стрептококк) от 10 см культуре ткани блюдо, которое не больше, чем 50% сплошности с MCF-7 или Т-47D клетки. Промыть PBS. Инкубируйте трипсином 0,25% / 2,21 мМ ЭДТА, растворенного в DMEM высокий уровень глюкозы при 37 ° С в течение 1-4 мин.
    2. Проверьте клеток в 1-минутными интервалами под фазово-контрастного микроскопа, чтобы обеспечить единый распределение клеток. Ресуспендируют клеток с 2 мл пипетки с помощью пипетки вверх и вниз несколько раз, чтобы сорвать межклеточных контактов для достижения почти неизменным, состояние одной клетки.
    3. Продолжали инкубировать клеток в трипсина при 37 ° С в течение 4 мин, если соблюдать скопления клеток после только 2-минутной инкубации. Не используйте эти клетки для клоногенных исследований, если они остаются приверженцами электроннойACH друга после 4 мин трипсинизации потому ошибка будет введен в выход номер колонии.
      Примечание: Если клетки слипаются, количество колоний, образованных будет отражать продукт меньше клеток, чем количество инкубируют. Если клетки чрезмерно трипсином, их клоны потенциал может быть уменьшена.
    4. Подготовка суспензии отдельных клеток 1500 клеток / мл культуральной среды в течение 24-луночных планшетах, или меньше, (+ 500 клеток / мл, в зависимости от типа клеток или числа пассажей), с помощью серийных разведений в одной мастер-пробирку, содержащую весь объем, необходимый для все переменные в эксперименте.
      Примечание: Цель состоит в конечной плотности клеток 800 клеток / см 2 (диапазон приблизительно от 500 до 1100 клеток / см 2). Цель состоит в том, чтобы получить примерно 100 + 50 колоний, что позволяет относительно легко подсчета, предотвращает сгущение и позволяет достаточно колонии, чтобы привести к значительным статистических различий, когда колонии увеличивается или уменьшается на экспериментальной perturbaции.
  2. Инкубируйте клетки в клоногенных плотности с использованием шагов, описанных ниже
    1. Инкубируйте клетки в четырех скважин на 24-луночные покрытые фибронектином планшеты при плотности образующих клоны 1500 клеток / лунку с одной мастер-клеточной суспензии трубки 1500 клеток / мл. Растирают среду, содержащую клетки с 5 мл пипетки путем составления 3 мл и дозирования 1 мл среды в каждой из 2 скважин.
      Примечание: фибронектин покрытием пластины должны быть приобретены предварительно покрытых с коммерческой поставщика. Лакокрасочные плиты за пределами качества контролируемой, автоматизированные результаты процесса в неровной поверхности непригодными для данного анализа.
    2. Смешайте подвески с помощью пипетки вверх и вниз с 5 мл пипетки, составить 3 мл клеточной суспензии и заполнить 2 скважины с 1 мл каждого. Заполните только 2 скважины в любой момент времени из одного пипетки. Вернуться оставшийся объем в пипетку к клеточной суспензии в основной трубе, ресуспендирования клеток снова с помощью пипетки вверх и вниз и составить еще 3 мл, чтобы заполнить еще 2 WELLs с 1 мл каждого.
      Примечание: Непрерывное перемешивание основной трубы необходим, потому что клетки непрерывно осаждаются. Составление достаточный объем, чтобы заполнить только 2 скважины необходимо добавить аналогичные количества клеток в каждую лунку, потому что клетки оседают в пипетку, а также.
    3. Работать быстро, чтобы распространять большие объемы клеток, потому что позволяет клеткам сидят в суспензии при комнатной температуре и концентрации СО 2 будет модулировать их клоны (потенциальных неопубликованные наблюдения).
    4. Оптимизация пространственного распределения клеток во время акта пипетки их в лунки для колонии анализов. У так медленно пипетки суспензии, содержащей конечную концентрацию клеток в середине скважины. Не подвергайте пластины для дальнейшего движения, прежде чем клетки оседают на дно. Не водоворот пластины, потому что круглая смешивание эффективно центрифуги клетки по периметру хорошо, создающих высокой плотности клеток и бесчисленных сливающихся колоний на 6 дней.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не смешивать, если необходимо, так как это менее желательно, чем без перемешивания вообще после введения объем с клетками в суспензии. Если это необходимо смешать клетки, сделать так, перемещая пластину назад и вперед в перпендикулярных направлениях, пока он опирается на плоской поверхности.
    5. Инкубируйте клетки при 37 ° C 5% CO 2 без изменения медиа в течение 6 дней. Небольшое количество клеток в хорошо после 6 дней не будет существенно влиять на состав питательных веществ или цитокинов, ни рН исходной среды.
    6. Конструкция временной ход анализа следующим образом: Инкубируют клетки на фибронектина покрытием субстратов на день 1. Заменить существующий среду с 1 мл свежей среды или свежую среду, содержащую FGF-2 10 нг / мл в день 0. Stain клеток, как показано ниже на 6-й день в 1.4). Провести никаких экспериментальных возмущения на 3 день, как показано ниже в 1.3).
  3. Настройка Экспериментальные Возмущения молекулярной сигнализации или адгезионной молекул
    1. На 3-й день, добавить 10056; л раствора, содержащего 10 раз конечного предполагаемого концентрации возмущающего агента в среде 1 мл в лунки. Не смешивать. Продолжали инкубировать клетки при 37 ° С, 5% СО 2 в течение дополнительных 3 дней.
      Примечание: возмущенные агентов могут включать в себя различные ингибиторы и блокирующие агенты молекул адгезии, рецепторы или других поверхностных белков, ингибиторов внутриклеточных сигнальных путей, молекул факторов, кофакторов или структурных белков, которые могут играть роль в поддержании состояния покоя.
    2. Пятно колонии на 6 день, как следует.
  4. Пятно Колонии
    1. Пятно клетки через 6 дней в культуре с свежеприготовленного 0,1% кристаллическим фиолетовым в 2% этанола / 10 мМ бората натрия (рН 9,0) раствора. Аспирируйте информации и добавить один мл раствора кристаллическим фиолетовым в каждую лунку в течение 20 мин.
    2. Вымойте тарелки, погружая их отверстия также вниз под острым углом в ведерке со льдом переполнены постоянно работающего кранавода в раковине. Наклоните плиту к горизонтальным углом раз водой, а открытие вниз, а затем наклонить назад, чтобы острым углом при удалении в одной нежной плавного движения.
    3. Повторите погружения 2 или 3 раза, пока вода на дне лунок уже не синий. Энергичные смывки может удалить клетки или колонии, которые являются менее прилипший-за экспериментальной вмешательства, добавляя значительный вклад в ошибку в подсчете и данных.
    4. Сухие пластины на ночь, размещая их с ног на голову на полотенцах на скамейке верхней, прилегающей к их соответствующих меченых крышками.
  5. Граф колонии
    1. Подсчитайте количество растущих и спящих колоний в каждой лунке после 6 дней инкубации, окрашивания и сушки. Количество колоний оптимально при 40-кратном увеличении в перевернутом фазово-контрастного микроскопа. Граф колонии> 30 клеток, растет и колоний 12 или меньше ячеек, с морфологической появления очень большого размера по сравнению с ростом клеток, большой EXPanded цитоплазма с большим цитоплазме к ядру отношения, показанные на рисунке 1 7,15.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Кластеры 13-29 клеток обычно не учитываются, поскольку они не очень часто в простых неактивности анализов. Они могут быть подсчитаны, если возмущения переложить потенциал роста либо растущих или спящих клеток. Эти результаты будут затем должны быть соотнесены с биологической значимости.

2. клоногенных Инкубационный для иммунофлюоресценции

  1. Отрегулируйте число клеток примерно 7,500-8,000 клеток / лунку в 6-луночные планшеты, чтобы соответствовать клеток число / площадь поверхности, аналогичный 24 а экспериментов.
  2. Поставьте раунд, стерильный, фибронектина покрытием покровное в каждую лунку базе 6-луночные планшеты для обработки изображений исследования до того клеток. Внесите клетки в 3 мл объемах в каждую лунку 2 скважины за один раз при концентрации описано, как описано для экспериментов клоногенные выше в 1.2).
  3. Инкубируйте клеткив течение 6 дней, как указано выше, в 1.2.4 и 1.2.5. Добавить возмущающих факторов на 3 день в 10х концентрации в 300 мкл объемы, как описано в процедурах анализа колоний в 1.3).
  4. Пятно клетки на 6-й день с антителами к клеточным молекул адгезии, таких как интегрины α4, α5, α6, β1, β3, например, фокусное адгезии сложных молекул, FAK и паксиллина винкулина, например, белки, участвующие в подвижности, такие как α-тубулина, Например, члены сигнализации Pathway такие как фосфо-Akt, фосфо-ERK, фосфо-р38, фосфо-JNK, например, или любой другой белок, который является объектом исследования для его роли в покое, с использованием стандартных методик для прямого или косвенного иммунофлюоресценции окрашивание.
    1. Удалить слайды с пинцетом день 6. Fix в ацетоне / метанол 1: 1 при температуре -20 ° C в течение 20 мин и сухой воздух. Альтернативный фиксатор, такой как параформальдегид, могут быть использованы, если это необходимо. Проницаемыми клетки с 0,1% тритона Х-100, 0,1% цитрата натрия в течение 2 мин Fили определение внутриклеточных антигенов. Промыть клетки с PBS.
    2. Для непрямого окрашивания immunofluorecence, блок слайдов в течение 1 часа при комнатной температуре с 5% BSA или с 10% сыворотки преиммунной видов, в которых сформировался вторичное антитело.
    3. Выдержите в течение ночи при 4 ° С с первичными антителами к клеточным молекул адгезии, координационные сложные молекулы, сигнализируя членов пути или любой другой белок, который мишенью следствия по своей роли в покое, разбавленного до конкретных разведения рекомендованные производителем в PBS 0,1% Тритон Х -100.
    4. Промыть 3 раза ЗФР. Инкубируйте покровные стекла с флуорофор-конъюгированного антитела при комнатной температуре в течение 2 часов. В качестве примера, Alexa Fluor 488 осел анти-мышь IgG антител может быть использован для обнаружения мышиного моноклонального первичного антитела. Гора покровные сторону клеток вниз на стеклах использованием antifade агента с Dapi. Печать периметров с лаком для ногтей.
    5. Для прямой иммунофлюоресценции, проводить BSAблокирования, как описано выше в разделе 2.4.2), инкубируют с конъюгированным с флуорофор первичного антитела в течение ночи при 4 ° С. Промыть 3 раза ЗФР. Инкубируйте слайды с antifade агента и Dapi и печатью с маникюром.
    6. Лотки крышка слайд с алюминиевой фольгой и хранят при температуре 4 ° C для визуализации и фотографии в любое время до нескольких недель. Посмотреть и сфотографировать клетки, используя любые флуоресценции микроскопических систем визуализации оснащен камерой на 1,000x увеличением.
    7. Для фибриллярного актина окрашивания, блок скользит в 1% бычьего сывороточного альбумина (BSA) в течение 30 мин и инкубируют в BODIPY FL-Phallacidin (зеленый) или родамин-фаллоидином (красный) при комнатной температуре в течение 20 мин. Добавить antifade агента и герметизации, как описано выше.

3. клоногенных Инкубационный для молекулярных исследований

  1. Вестернблоты
    1. Выдержите ER + клеток рака молочной железы MCF-7 или T47D на клоногенных плотности 20000 клеток / 60 мм пластины и 50000 клеток / 100 мм пластины на fibronecлуженые пластин при 37 ° С в 5% СО 2.
    2. Инкубируйте клетки при слегка более высокой плотности клеток 75000/100 мм пластины для молекулярных исследований, требующих мг суммы для белка из лизатов. Используйте до десяти пластин в экспериментальной точки для сбора достаточно белка для молекулярных исследований с использованием западных помарки или для выделения РНК для северных пятнами.
    3. Число клеток на основе геля нагрузка необходимым дополнением для сравнения экспрессии белка в совершенно разных размеров растет и спящих клеток. Собирают клетки trypsinizing и аликвоту рассчитывать с помощью гемоцитометра в 0,2% трипановым синим для приготовления лизатов для вестерн-блоттинга вместо соскабливания клеток с одной режущей кромкой.
    4. Центрифуга клетки при 10000 х г в течение 2 мин, удалить носитель путем аспирации, добавл ют 200 мкл буфера для лизиса, разрушать ультразвуком клеток в буфере для лизиса и определения концентрации белка.
    5. Рассчитать количество белка в клетке путем деления выход белка на число клетокчто генерируется эту сумму. Загрузка лизата в каждую лунку отдельных полиакриламидном геле, который представляет собой и) эквивалентных количеств белка и б) белка количествах, представляющих эквивалентные количества клеток. По крайней мере, 25 мкг белка должны быть загружены в каждую лунку.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это позволит сравнивать между растущими и спящих клеток, которые значительно отличаются по размеру и содержанию белка (рис 1).
  2. Проточной Цитометрии
    1. Сбор клеток из 100 мм пластин трипсинизацией, как в 3.1 и анализировать с помощью стандартного флуоресценции активированного сортировки клеток (FACS), используя протоколы первичную или вторичную иммунофлуоресцентного либо для внутриклеточных или внеклеточных антигенов, как указано в 2.4.
      Примечание: Отсоединение клеток из тканевой культуры пластин обработкой трипсином, не влияет на концентрацию мембранных белков, как определено маркировки антител.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Эксперименты проводились резюмировать анализа. Временной ход эксперимента показан на рисунке 2А. Клетки инкубировали при плотности образующих клоны в день -1, FGF-2 в свежей среде добавляют в день 0 и клетки культивируют до 6-й день, когда они окрашивают и колонии подсчитывают. Любые возмущения в системе вводят в день 3 в 100 мкл объемы в 10х конечных концентраций желании. 2В демонстрирует типичный вид растущих колоний и неактивных. Растущие колонии содержат> 30 клеток и спящие...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Наша модель состоит из нескольких ключевых элементов покоя в костном мозге. Он состоит из эстрогена чувствительные клетки, которые являются тип вероятно, будет оставаться в состоянии покоя в мозге в течение длительных периодов 10, она состоит из фибронектина, ключевой структурный элемент мозга, FGF-2, фактор роста обильно синтезированного стромы костного мозга и в значительной степени на хранение во внеклеточном матриксе костного мозга и 31,32 инкубации клеток в клоногенном плотности, где их взаимо...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Поддерживаемые Департаментом обороны Гранты DAMD17-01-C-0343 и DAMD17-03-1-0524, Государственная комиссия Нью-Джерси по исследованиям рака 02-1140-CCR-E0 и Рут Гольдберг Эстрин Мемориал по исследованию рака (RW)

Благодарности

Авторы не имеют ничего раскрывать.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Ячейки MCF-7ATCCHTB-22
T47D ячейки ATCCHTB-123
BD BioCoat Fibronectin 24 Well Clear Flat Flat TC-Handled Multiwell PlateCorning 354411
BD BioCoat Fibronectin 60 мм Тарелки для культивированияCorning354403
BD BioCoat Fibronectin 100 мм Тарелки для культивированияCorning354451
BD BioCoat 22x22mm #1 Glass Coverslip с равномерным нанесением человеческого фибронектинаCorning354088
6 лунок тканевая культуральная пластинаCellTreat229106
Dulbecco Modified Eagle Medium High Glucose 10X PowderCorning Life Sciences50-013-PB
Термоинактивированный, фетальная бычья сывороткаИсточник сыворотки InternationalFB02-500HI
0,25% трипсин/2,21 мМ ЭДТАCorning25-053-CI
Раствор пенициллин-стрептомицина, 100XCorning30-002-CI
L-глутамина, 100x, жидкийCorning25-005-CI
рекомбинантный человеческий FGF  базовыеR&; D Systems234-FSE-025
Ингибитор Akt (1L6-гидроксиметил-хиро-инозитол-2-(R)-2-O-метил-3-O-октадецил-sn-глицерокарбонат)CalBiochem124005
LY294002 CalBiochem19-142Chenical PI3K ингибитор
C3-трансферазы ЦитоскелетCTO3ингибирует RhoA, RhoB и RhoC, но не родственные ГТФазы, такие как Cdc42 или Rac1
Y-27632 дигидрохлорид Санта Круз Биотехнология129830-28-2
BODIPY FL-Фаллацидин (зеленый) Молекулярные зондыB607Флуорохром для окрашивания фибриллярного актина
BODIPY FL-Родамин фаллоидин (красный)  Молекулярные зондыR415Флуорохром для окрашивания фибриллярного актина
Alexa Fluor 488 Donkey anti-Mouse IgG антитела, реагент ReadyProbes Молекулярные зондыR37114
ProLong Gold Antifade Mountant с DAPI Молекулярные зондыP-36931

Ссылки

  1. Braun, S., et al. Cytokeratin-positive cells in the bone marrow and survival of patients with stage I, II, or III breast cancer. N Engl J Med. 342 (8), 525-533 (2000).
  2. Benoy, I. H., et al. Relative microvessel area of the primary tumour, and not lymph node status, predicts the presence of bone marrow micrometastases detected by reverse transcriptase polymerase chain reaction in patients with clinically non-metastatic breast cancer. Breast Cancer Res. 7 (2), R210-R219 (1186).
  3. Wapnir, I. L., Barnard, N., Wartenberg, D., Greco, R. S. The inverse relationship between microvessel counts and tumor volume in breast cancer. Breast J. 7 (3), 184-188 (2001).
  4. Wyckoff, J. B., et al. A critical step in metastasis: in vivo analysis of intravasation at the primary tumor. Cancer Res. 60 (9), 2504-2511 (2000).
  5. Phadke, P. A., et al. Kinetics of metastatic breast cancer cell trafficking in bone. Clin Cancer Res. 12 (5), 1431-1440 (2006).
  6. Braun, S., et al. Lack of an effect of adjuvant chemotherapy on the elimination of single dormant tumor cells in bone marrow of high risk breast cancer patients. J Clin Onc. 18 (1), 80-86 (2000).
  7. Korah, R., Boots, M., Wieder, R. Integrin α5β1 promotes survival of growth-arrested breast cancer cells: an in vitro paradigm for breast cancer dormancy in bone marrow. Cancer Res. 64 (13), 4514-4522 (2004).
  8. Najmi, S., Korah, R., Chandra, R., Abdellatif, M., Wieder, R. Flavopiridol blocks integrin-mediated survival in dormant breast cancer cells. Clin Cancer Res. 11 (5), 2038-2046 (2005).
  9. Braun, S., et al. A pooled analysis of bone marrow micrometastasis in breast cancer. N England J Med. 353 (8), 793-802 (2005).
  10. Dent, R., et al. Triple-negative breast cancer: clinical features and patterns of recurrence. Clin Cancer Res. 13 (15 Part 1), 4429-4434 (2007).
  11. Kim, R. S., et al. Dormancy signatures and metastasis in estrogen receptor positive and negative breast cancer. PLoS One. 7 (4), e35569(2012).
  12. Hanin, L. Seeing the invisible: how mathematical models uncover tumor dormancy, reconstruct the natural history of cancer, and assess the effects of treatment. Adv in Exp Med & Biol. 734, 261-282 (2013).
  13. Wilkie, K. P. A review of mathematical models of cancer-immune interactions in the context of tumor dormancy. Adv in Exp Med & Biol. 734, 201-234 (2013).
  14. Barkan, D., Green, J. E. An in vitro system to study tumor dormancy and the switch to metastatic growth. J Vis Exp. (54), e2914(2011).
  15. Barrios, J., Wieder, R. Dual FGF-2 and intergrin α5β1 signaling mediate GRAF-induced RhoA inactivation in a model of breast cancer dormancy. Cancer Microenvironment. 2 (1), 33-47 (2009).
  16. Ganapathy, V., et al. Luminal breast cancer metastasis is dependent on estrogen signaling. Clin & Exp Metastasis. 29 (5), 493-509 (2012).
  17. Barkan, D., et al. Inhibition of metastatic outgrowth from single dormant tumor cells by targeting the cytoskeleton. Cancer Res. 68 (15), 6241-6250 (2008).
  18. Ghajar, C. M., et al. The perivascular niche regulates breast tumour dormancy. Nat Cell Biology. 15 (7), 807-817 (2013).
  19. Marshall, J. C., et al. Effect of inhibition of the lysophosphatidic acid receptor 1 on metastasis and metastatic dormancy in breast cancer. J Nat Cancer Inst. 104 (17), 1306-1319 (2012).
  20. Almog, N. Genes and regulatory pathways involved in persistence of dormant micro-tumors. Adv in Exp Med & Biol. 734, 3-17 (2013).
  21. Wang, H., et al. Basic FGF causes growth arrest in MCF-7 human breast cancer cells while inducing both mitogenic and inhibitory G1 events. Cancer Res. 57 (9), 1750-1757 (1997).
  22. Fenig, E., et al. Role of transforming growth factor beta in the growth inhibition of human breast cancer cells by basic fibroblast growth factor. Breast Cancer Res Treat. 70 (1), 27-37 (2001).
  23. Fenig, E., et al. Basic fibroblast growth factor confers growth inhibition and Mitogen-activated Protein Kinase activation in human breast cancer cells. Clinical Cancer Research. 3 (1), 135-142 (1997).
  24. Coleman-Krnacik, S., Rosen, J. M. Differential temporal and spatial gene expression of fibroblast growth factor family members during mouse mammary gland development. Molecular Endocrinology. 8 (2), 218-229 (1994).
  25. Plath, A., et al. Expression and localization of members of the fibroblast growth factor family in the bovine mammary gland. J Dairy Science. 81 (10), 2604-2613 (1998).
  26. Lavandero, S., Chappuzeau, A., Sapag-Hagar, M., Oka, T. In vivo and in vitro evidence of basic fibroblast growth factor action in mouse mammary gland development. FEBS letters. 439 (3), 351-356 (1998).
  27. Sinowatz, F., Schams, D., Plath, A., Kolle, S. Expression and localization of growth factors during mammary gland development. Adv in Exp Med & Biol. 480, 19-27 (2000).
  28. Korah, R., Sysounthone, V., Scheff, E., Wieder, R. Intracellular FGF-2 promotes differentiation in T47-D breast cancer cells. Biochem Biophys Res Comm. 277 (1), 255-260 (2000).
  29. Korah, R., Das, K., Lindy, M. E., Hameed, M., Wieder, R. Co-ordinate loss of FGF-2 and laminin 5 expression during neoplastic progression of mammary duct epithelium. Human Pathology. 38 (1), 154-160 (2007).
  30. Wieder, R., et al. Overexpression of basic fibroblast growth factor in MCF-7 human breast cancer cells: lack of correlation between inhibition of cell growth and MAP kinase activation. J. Cellular Physiology. 177, 411-425 (1998).
  31. Brunner, G., Gabrilove, J., Rifkin, D. B., Wilson, E. L. Phospholipase C release of basic fibroblast growth factor from human bone marrow cultures as a biologically active complex with a phosphatidylinositol-anchored heparan sulfate proteoglycan. J Cell Biol. 114 (6), 1275-1283 (1991).
  32. Wilson, E. L., Rifkin, D. B., Kelly, F., Hannocks, M. J., Gabrilove, J. L. Basic fibroblast growth factor stimulates myelopoiesis in long-term human bone marrow cultures. Blood. 77 (5), 954-960 (1991).
  33. Gupta, P., McCarthy, J. B., Verfaillie, C. M. Stromal fibroblast heparan sulfate is required for cytokine-mediated ex vivo maintenance of human long-term culture-initiating cells. Blood. 87 (8), 3229-3236 (1996).
  34. Chatterjee, M., van Golen, K. L. Farnesyl transferase inhibitor treatment of breast cancer cells leads to altered RhoA and RhoC GTPase activity and induces a dormant phenotype. Int J Cancer. 129 (1), 61-69 (2011).
  35. Korah, R., Sysounthone, V., Golowa, Y., Wieder, R. Basic fibroblast growth factor confers a more differentiated phenotype in MDA-MB-231 human breast cancer cells. Cancer Res. 60 (3), 733-740 (2000).
  36. Dontu, G., et al. In vitro propagation and transcriptional profiling of human mammary stem/progenitor cells. Genes & Dev. 17 (10), 1253-1270 (2003).
  37. Tivari, S., Lu, H., Dasgupta, T., Wieder, R. Reactivation of dormant estrogen-dependent breast cancer micrometastases by bone marrow stromal injury in an in vitro model of dormancy. Proceedings of the 105th Annual Meeting of the American Association for Cancer Research. , AACR. San Diego, CA. Philadelphia (PA). (2014).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

FGF 2PI3K
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.