Методическая статья

Недорогой, масштабируемая Поведенческая Анализ для измерения этанола седации Чувствительность и быстрый толерантности в

10K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/52676

⸱

15 апреля 2015 г.

 ,  ,  ,  , 
1Department of Human and Molecular Genetics, Virginia Commonwealth University, 2VCU Alcohol Research Center, Virginia Commonwealth University

В этой статье

Краткое содержание

Простые анализы для измерения чувствительности к этанолу и быстрой толерантности у дрозофил облегчают использование этого модельного организма для исследования этих важных поведенческих свойств, связанных с этанолом. В данной работе описывается относительно простой, масштабируемый анализ для измерения чувствительности к этанолу и быстрой переносимости у мух.

Аннотация

Употребление алкоголя расстройства (AUD) является серьезной проблемой здравоохранения. Несмотря на большое наследственный компонент к AUD, несколько генов были однозначно вовлечены в их этиологии. Плодовая муха, дрозофилы, является мощная модель для изучения молекулярно-генетических механизмов, лежащих в основе поведения, связанных с алкоголем, и поэтому имеет большие перспективы для выявления и понимания функции генов, которые влияют на AUD. Использование модели Drosophila для этих типов исследований зависит от наличия анализов, которые надежно измерить поведенческих ответов на этанол. Этот отчет описывает анализ подходящий для оценки чувствительности этанола и быстрый допуск в мух. Чувствительность Этанол измеряется в данном исследовании зависит от объема и концентрации этанола, используемого, разнообразие сообщалось ранее генетических манипуляций, а также время, в течение мухи размещены без пищи непосредственно перед тестированием. В отличие от этого, этанола сensitivity измеряется в этом анализе не зависит от энергичности обработки зольной, пола мух и добавок в ростовой среде с антибиотиками или живых дрожжей. Три различные методы количественного чувствительности этанола описаны, все это ведет к существенно неразличимые результаты чувствительности этанола. Масштабируемая природа этого анализа, в сочетании с его общей простоты в настройке и относительно низкий расход, сделать его пригодным для малых и крупных генетического анализа чувствительности этанола и быстрого толерантности у дрозофилы.

Введение

Употребление алкоголя расстройства (AUD) является огромной проблемой здравоохранения во всем мире (обзор в 1). Хотя механизмы приводные развитие AUD сложны, эти расстройства имеют большое генетический компонент (например, 2). Большой наследуемость AUD и консервативных поведенческих реакций на этанол во многих видов (рассмотренных в 3,4), породили сильный интерес к использованию генетических модельных организмов проверки причастности конкретных генов в этаноле, связанных с поведением по отношению к лучшему пониманию молекулярных основ AUD. Плодовая муха, дрозофилы, стала ведущей моделью организма для изучения молекулярно-генетических механизмов этанола, связанных с поведением (обзор в 3,4). Исследования, проведенные в мух подчеркнули роль для нескольких сигнальных путей в поведенческих ответов на этаноле (обзор в 5). Интересно, что некоторые из генов и путей, которые влияют на поведенческие RESPONSES в этаноле в мух также вовлечены в грызунов этанола, связанных с поведением и / или человеческого AUD (например, 6-14). Сохранение механизмов вождения этанола, связанных с поведением разных видов, в сочетании с набором генетических инструментов, доступных в модельной системе Drosophila, подчеркивают полезность лету модели с фруктами для исследования генетики поведенческих реакций в этанол.

Чувствительность 15,16 и толерантность (обзор в 17) к этанолу в организме человека связана с развитием AUD. Оба этих поведенческих реакций в этаноле могут быть смоделированы в мух с помощью различных лабораторных анализов (обзор в 3,4). Все лету анализов, известных авторов основаны либо на зависимости от времени этанола, вызванных седации / несогласованность или зависящих от времени восстановления из этанола седации.

В предыдущей статье из нашей группы по генетике чувствительности этанола и гДопуск APID у дрозофилы, был использован поведенческий тест на основе паров этанола, вызванных седации мух 18. Испытание в этом тесте была инициирована передачей живой взрослых мух без анестезии, чтобы очистить пищевых флаконы, захвата мух в пузырьках с ацетата целлюлозы пробки, добавлением этанола к началу (т.е. не муха сторона) ацетата целлюлозы вилки и уплотнения флакона мух, ацетата целлюлозы вилку и этанола с силиконовой пробкой (см схематический рисунок S3, ссылка 18). Несколько флаконов, представляющих различные группы мух оценивали параллельно, увеличивая пропускную способность этого анализа. Флаконы были даны анонимный код и экспериментаторы не знали о группе лечения, чтобы предотвратить непреднамеренное смещение в оценке седативного эффекта. В стандартном эксперименте, летит в флаконах прослушивались мягко 6-минутными интервалами, и после восстановления 30 сек, количество седативных мух в каждом флаконе подсчитывали и Converted к процентному активных мух. Мухи поглощается парами этанола из ацетата целлюлозы вилкой в зависимости от времени образом, в результате чего прогрессивное увеличение внутреннего этанола 18 и седации (CF задание 18 и Рисунок 1A и 1B в настоящем докладе). Торможение в данном анализе была функционально определяется как мух (I) положении при отсутствии ходьба или (II), лежа на спине с или без хлопая крыльями. Вот это этанол седативный анализ описан в деталях, в дальнейшем Оперативная Оптимизация отношение к его использованию обеспечивается, и анализ используют для решения вклад опций пищевых добавок на чувствительность муха седации.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. День перед анализом

  1. Сбор мух в свежих флаконах продовольствие групп 11 (разового секса) под неглубоким (1-5 мин) CO 2.
  2. Разрешить мух для восстановления O / N в пищевых флаконах экологически контролируемом помещении (обычно 25 ° C, 60% относительной влажности, 12 ч цикл свет / темнота).
  3. Подготовка этанольного раствора (ов) путем разбавления чистого (100%) этилового спирта в очищенной (≥18 МОм) воды до конечной концентрации (ы), подходящей для запланированного эксперимента. Разрешить решение (ы), чтобы вернуться к РТ O / N.
    Примечание: Разбавление этанола является экзотермической.

2. День Пробирной

  1. Для каждого флакона мух должны быть протестированы, подготовить (I) чистый, пустой флакон пищевых продуктов; т.е., тестирование флакон, (II), ацетат целлюлозы новый штекер, (III) силиконовые пробкой и (IV) 1 мл раствора этанола (таблица 3).
  2. Подготовка комнату тестирования, регулируя температуру до 20-25 ° С и относительной влажности воздуха до 55-65%.
  3. Есть еще один работникназначить уникальный код для каждой группы флаконов и записать код для последующего использования. Поместите закодированные флаконы с мухами в комнату тестирования акклиматизироваться в течение нескольких минут.
  4. Этикетка пустые флаконы тестирования, чтобы соответствовать коды на лету флаконах из 2,3.
  5. Построить жесткий журнал тестирования копия, введя коды в столбцах (один столбец / флакон) в таблице, аналогичной таблице 1.
  6. Использование журнал тестирования в качестве руководства, организовать закодированные флаконов пищу с мухами и пустых флаконов тестирования в соответствие массивов в комнату тестирования.
    Примечание: разумный максимум количество флаконов для проверки 24 (то есть, 6 комплектов 4 флаконов в каждой).
  7. Передача летит из пищевых флаконах в согласованных / меченых пустой тестирования флаконов и сразу вставить ацетата целлюлозы пробки в испытательных флаконах до ацетата целлюлозы розетки не 2 см ниже флаконе вершины.
  8. Далее, обрабатывать каждую строку из четырех флаконах в виде набора в шахматном минутные интервалы 1.
  9. Для оценки времени 0, понять каждого флакона индивидуально WIth большим и указательным пальцами, слегка постучите по на столе три раза постучать мух на дне флакона, подождать 30 сек, а затем подсчитать количество мух, которые являются неподвижными / мертв. Запишите число неподвижных / мертвых мух для каждого флакона во время 0 мин в печатном журнале тестирования.
  10. Запуск таймера подсчета до непрерывно в момент времени 0 и сразу же начинают добавлением 1 мл этанола, ацетата целлюлозы пробок в флаконы для первой строки набора / 4 ампулы. Добавить 1 мл этанола, ацетат целлюлозы пробок в флаконы по 5 сек интервалом в порядке они будут испытаны. Добавить этанола с пробками из ацетата целлюлозы в круговом движении, так что этанол поглощается равномерно по всей ацетата целлюлозы пробок. При этанола был добавлен ко всем 4 испытательных пробирок в наборе, вставить пробку силикона в каждую пробирку, чтобы запечатать его.
  11. Иногда 1, 2, 3, 4 и 5 мин, добавить 1 мл этанола, второй, третий, четвертый, пятый и шестой наборы 4 ампулы, соответственно. Продолжайте установку силиконовые пробки последобавления этанола с каждым набором 4 ампулы.
  12. В момент времени 6 мин, проверить первый набор 4 флаконы, держа каждый флакон с большим и указательным пальцами, нажав аккуратно на стол три раза, чтобы сбить мух в нижней части флакона, ожидая 30 сек, а затем подсчета и записи общее количество мухи, которые седация. Оценка летает как успокоительное, если они (я) стоять на полу флакона, но не ходить или (II) лежат на своих спинах с или без хлопая крыльями.
  13. Ручка каждый флакон в наборе в 5-секундными интервалами, используя график в таблице 2.
  14. Порой 7, 8, 9, 10 и 11 мин проверьте второй, третий, четвертый, пятый и шестой наборы флаконов, соответственно, как это сделано в первом сете.
  15. Во время 12 мин, проверить первый набор 4 флаконов снова, как описано в 2,12 и продолжить тестирование во второй, третий, четвертый, пятый и шестой наборы флаконах по 13, 14, 15, 16 и 17 мин, соответственно.
  16. Продолжить тестирование мух, как описано в 2,12, пока все мухи не сedated.
  17. Введите общее количество мух в каждом флаконе в жесткого журнале тестирования копирования. Цензор неподвижные / мертвых мух в момент времени 0 из общего количества мух.
  18. Рассчитать процент активных летит на каждой оценки временной точке и данные графика в виде% активных мух (Y-ось) в зависимости от времени (ось х). Количественного этанола седативный эффект путем интерполяции седации часам 50 значений (ST50, время до 50% седации) с третьего порядка полинома или сигмовидной кривой соответствует или вычисления площади под кривой.
  19. Компиляция данных из расшифрованных флаконах и выполнять статистический анализ (например, в одну сторону ANOVA с Bonferroni теста множественного сравнения) по мере необходимости для экспериментального дизайна.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Необработанные данные из этого анализа этанола седации являются количество мух, которые седатированы в зависимости от времени экспозиции паров этанола. Необработанные данные преобразуются в процент активных мух, как функции времени (первичных данных, 1А, В, D - F). Чувствительность к этанолу седативного из первичных данных может быть количественно, как Торможение времени 50 (ST50), время, необходимое для 50% от мух, чтобы стать седативные или AEA под кривой (AUC), с помощью интерполяции...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Прямые анализы, что воспроизводимо количественно значимых фенотипов имеют большое значение для анализа поведения. Работа, описанная здесь рассматривается ряд практических аспектов в анализе для измерения чувствительности этанол седации и быстрый допуск у дрозофилы. Хотя это и не цель этой работы, поведенческие анализы способствует поддержанию окружающей среды и генетический фон константу для испытуемых в исследовании. Кроме того, сравнение, как правило, следует проводить различие между группами мух, выращенных ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Эти исследования были поддержаны грантами от Национального института здравоохранения, Национального института алкоголизма и злоупотребления алкоголем для M.G. (P20AA017828, R01AA020634, P50 AA022537). Авторы благодарят Джилл Беттингер за полезные обсуждения и Жаклин Делойт за техническую помощь.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
флаконы для пищевых продуктовVWR89092-772узкие
флугиGenesee/flystuff.com49-102узкая
силиконовая пробкаFisher Scientific09-704-1l#4
этанолPharmaco-Aaper111000200200 proof

Ссылки

  1. Rehm, J., et al. Global burden of disease and injury and economic cost attributable to alcohol use and alcohol-use disorders. Lancet. 373, 2223-2233 (2009).
  2. Prescott, C. A., Kendler, K. S. Genetic and environmental contributions to alcohol abuse and dependence in a population-based sample of male twins. The American journal of psychiatry. 156, 34-40 (1999).
  3. Devineni, A. V., Heberlein, U. The evolution of Drosophila melanogaster as a model for alcohol research. Annual review of neuroscience. 36, 121-138 (2013).
  4. Scholz, H., Mustard, J. A. Invertebrate Models of Alcoholism. Current topics in behavioral neurosciences. 13, 433-457 (2011).
  5. Rodan, A. R., Rothenfluh, A. Functional Plasticity and Genetic Variation: Insights into the Neurobiology of Alcoholism. Reilly, M. T., Lovinger, D. M. 91, Elsevier. (2010).
  6. Schumann, G., et al. Genome-wide association and genetic functional studies identify autism susceptibility candidate 2 gene (AUTS2) in the regulation of alcohol consumption. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 7119-7124 (2011).
  7. Corl, A. B., et al. Happyhour, a Ste20 family kinase, implicates EGFR signaling in ethanol-induced behaviors. Cell. 137, 949-960 (2009).
  8. Moore, M. S., et al. Ethanol intoxication in Drosophila: Genetic and pharmacological evidence for regulation by the cAMP signaling pathway. Cell. 93, 997-1007 (1998).
  9. Scholz, H., Franz, M., Heberlein, U. The hangover gene defines a stress pathway required for ethanol tolerance development. Nature. 436, 845-847 (2005).
  10. Riley, B. P., et al. Alcohol dependence is associated with the ZNF699 gene, a human locus related to Drosophila hangover, in the Irish affected sib pair study of alcohol dependence (IASPSAD) sample. Molecular psychiatry. 11, 1025-1031 (2006).
  11. Morozova, T. V., et al. Alcohol sensitivity in Drosophila: translational potential of systems genetics. Genetics. 183, 733-745 (2009).
  12. Ogueta, M., Cibik, O., Eltrop, R., Schneider, A., Scholz, H. The influence of Adh function on ethanol preference and tolerance in adult Drosophila melanogaster. Chemical senses. 35, 813-822 (2010).
  13. Han, S., et al. Integrating GWASs and human protein interaction networks identifies a gene subnetwork underlying alcohol dependence. American journal of human genetics. 93, 1027-1034 (2013).
  14. Lind, P. A., et al. A genomewide association study of nicotine and alcohol dependence in Australian and Dutch populations. Twin Res Hum Genet. 13, 10-29 (2010).
  15. Schuckit, M. A. Low level of response to alcohol as a predictor of future alcoholism. The American journal of psychiatry. 151, 184-189 (1994).
  16. Schuckit, M. A., Smith, T. L. An 8-year follow-up of 450 sons of alcoholic and control subjects. Archives of general psychiatry. 53, 202-210 (1996).
  17. Tabakoff, B., Cornell, N., Hoffman, P. L. Alcohol tolerance. Ann Emerg Med. 15, 1005-1012 (1986).
  18. Chan, R. F., et al. Contrasting Influences of Drosophila white/mini-white on Ethanol Sensitivity in Two Different Behavioral Assays. Alcohol Clin Exp Res. 38, 1582-1593 (2014).
  19. Eddison, M., et al. arouser reveals a role for synapse number in the regulation of ethanol sensitivity. Neuron. 70, 979-990 (2011).
  20. Wen, T., Parrish, C. A., Xu, D., Wu, Q., Shen, P. Drosophila neuropeptide F and its receptor, NPFR1, define a signaling pathway that acutely modulates alcohol sensitivity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 2141-2146 (2005).
  21. Bhandari, P., Kendler, K. S., Bettinger, J. C., Davies, A. G., Grotewiel, M. An assay for evoked locomotor behavior in Drosophila reveals a role for integrins in ethanol sensitivity and rapid ethanol tolerance. Alcohol Clin Exp Res. 33, 1794-1805 (2009).
  22. Bhandari, P., et al. Chloride intracellular channels modulate acute ethanol behaviors in Drosophila, Caenorhabditis elegans and mice. Genes, brain, and behavior. 11, 387-397 (2012).
  23. Gargano, J. W., Martin, I., Bhandari, P., Grotewiel, M. S. Rapid iterative negative geotaxis (RING): a new method for assessing age-related locomotor decline in Drosophila. Experimental gerontology. 40, 386-395 (2005).
  24. Chen, J., Wang, Y., Zhang, Y., Shen, P. Mutations in Bacchus reveal a tyramine-dependent nuclear regulator for acute ethanol sensitivity in Drosophila. Neuropharmacology. 67, 25-31 (2013).
  25. Lasek, A. W., Giorgetti, F., Berger, K. H., Tayor, S., Heberlein, U. Lmo genes regulate behavioral responses to ethanol in Drosophila melanogaster and the mouse. Alcohol Clin Exp Res. 35, 1600-1606 (2011).
  26. Maples, T., Rothenfluh, A. A simple way to measure ethanol sensitivity in flies. J Vis Exp. , e2541(2011).
  27. Rothenfluh, A., et al. Distinct behavioral responses to ethanol are regulated by alternate RhoGAP18B isoforms. Cell. 127, 199-211 (2006).
  28. Nohronha, A. Ch. 23. Neurobiology of Alcohol Dependence. 23, Elsevier. 467-495 (2014).
  29. Jones, M. A., Grotewiel, M. Drosophila as a model for age-related impairment in locomotor and other behaviors. Experimental gerontology. 46, 320-325 (2010).
  30. Martin, I., Grotewiel, M. S. Oxidative damage and age-related functional declines. Mechanisms of ageing and development. 127, 411-413 (2006).
  31. Devineni, A. V., Heberlein, U. Acute ethanol responses in Drosophila are sexually dimorphic. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 21087-21092 (2012).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Drosophila melanogaster50

Похожие статьи