Стандартизованный метод для анализа печени Синусоидальная эндотелиальных клеток и их фенестраций по сканирующей электронной микроскопии

Печень синусоидальные эндотелиальные клетки (LSECs) весьма дифференцированные эндотелиальные клетки, которые выстилают стенки печеночной синусоиды. LSECs перфорируют с фенестраций, которые недиафрагмированном, трансцеллюлярного поры 50-250 нм в диаметре. До 20% поверхности LSECs покрыта фенестраций, которые, как правило, в группах от десятков до сотен называемых сито пластины ^1-3 (Рисунок 1). Фенестраций разрешить передачу плазмы и nanosubstrates между кровью и гепатоцитами, создания эффективной системы ультрафильтрации. Фенестраций являются динамические структуры - как их размер и / или номер может быть изменен в ответ на различные физиологических состояниях, наркотиков и болезней. Например, Фенестрации больше в голодном, чем в сытом состоянии ^4; 2-ди-iodoamphetamine увеличивает количество оконных ^5,6 и уменьшение размера и количества фенестраций за клеток происходит в процессе старения, и многие болезненных состояний ^7-13 1.

Изучение фенестраций трудно. Диаметр фенестраций лежит ниже разрешением обычного светового микроскопа, так ранее только наблюдение с помощью электронного микроскопа и в интактных тканей печени или культивированного LSECs удалось. Сканирующий электронный микроскоп (SEM), была наиболее часто используется для изучения размеров оконных, частоту и пористость (процент от LSEC мембраны, перфорированный фенестраций), потому что СЭМ позволяет для наблюдения больших участков поверхности эндотелия и измерения тысяч, если не десятки тысяч фенестраций. Несмотря на полезность, результаты, которые сообщили из SEM на основе исследований дляLSEC параметры, такие как размер оконной, количества, частоты и пористости широко варьировать в литературе (таблица 1).

Фенестраций и сита пластины являются хрупкими структуры, что контракт, разорвать, расширяют или сливаются в ходе подготовки образца, таким образом, осторожны обработка необходима, чтобы сохранить их целостность. Повышенное давление перфузии ^14; неверно осмолярность фиксатора и буферов ^15; недостаточно фиксация или фиксация времени; и скорость после фиксации обезвоживания и сушки все области обработки для SEM, которые могут вызывать артефакты, которые мешают сохранению ультраструктуры (рис 2). Потеря фенестраций ('дефенестрация') и оконных усадки может возникнуть в результате плохой фиксации, в результате уменьшенного диаметра оконных и пористостью. Методы повышения сохранности образцов для анализа СЭМ были описаны ранее ^15-17 и будет обсуждатьсяздесь с дополнительные советы о том, как улучшить сохранение образца. Основными задачами являются сохранение образца, чтобы удалить кровь из синусоид, так что поверхность LSEC могут быть визуализированы и избежать повреждения от LSEC либо высоким давлением или задержки фиксации. Всего перфузии печени фиксатора через воротную вену является предпочтительным методом для фиксации печени. Как описано подробно в другом месте ^16,18 перфузии должны быть предприняты при низком давлении (например, 10 см H ₂ 0), чтобы избежать давления, связанных перфузии артефакты и повреждение LSEC, обычно проявляется в виде больших зазоров в пределах клеточной мембраны. Тем не менее, разумно фиксации часто могут быть получены с помощью иглы перфузию биопсии печени от человека и животных, как описано подробно в другом месте ^19. Этот метод включает в себя непосредственно инъекционных фиксатором в ткани, пока кровь не смывается образца и ткани является твердой и фиксированной. Фиксация образцов для электронной микроскопии должна быть перфорацияormed как можно быстрее после прекращения кровотока для предотвращения ультраструктурным изменения, происходящие в результате печени крайне быстрые процессы автолитических.

Мы также представляем метод анализа изображений, что сводит к минимуму включение артефактов, и стандартизирует измерение фенестраций. Изменение в выборе синусоиды для микрофотографии, анализ изображений артефактов и измерение площади ячейки для пористости и оконных частоты привели к существенному расхождений в опубликованных результатах. Стандартизированный подход для оценки и измерения фенестраций и минимальных требований для представления данных не были четко рассмотрены в литературе ранее ^4,10,20-31.

ПРИМЕЧАНИЕ: Все процедуры, связанные с использованием животных осуществляется в соответствии с местным законодательством. Наша работа была утверждена Комитетом по Сидней местного здравоохранения районного защиты животных от. Допустимые процедуры описаны в документации проекта и лицензии следовать рекомендациям, которые обеспечивают благосостояние животного на все времена. Обеспечить соблюдение законодательства о животном экспериментов страны, где проводится работа.

1. Протокол Подготовка EM Fixative

1. Для 100 мл фиксатора, подготовки параформальдегида путем добавления 2 г параформальдегида порошка к 25 мл дистиллированной воды в конической колбе, тепло до 65 ° С, постоянно перемешивании магнитной мешалкой.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Глутаральдегид, параформальдегидную буфер какодилат натрия все опасные вещества и должны всегда быть обработаны в fumehood.
2. Тепло в 65 ° С в течение 2 минут, затем дать остыть. При необходимости добавить dropw раствор гидроксида натрияISE при перемешивании, чтобы полностью прозрачный раствор.
   ПРИМЕЧАНИЕ: гидроксид натрия является опасным, обращаться с осторожностью.
3. Добавьте 10 мл ЭМ класса фондовой глутарового альдегида 50 мл буфера 0,2 М какодилата натрия и 2 г сахарозы и перемешать с магнитной мешалкой. Добавить 2 мл 1,0 М CaCl _2.
4. Доведения рН до 7,4 до принятия решения до 100 мл дистиллированной водой. Конечный фиксатор содержит 2,5% глутарового альдегида, 2% параформальдегида, 2 ммоль CaCl _2, 2% сахарозы в 0,1 М какодилатный буфер. Убедитесь, что общая осмолярность 440 мОсм / л. Использовать в течение 24 часов подготовки.

2. перфузии Фиксация печени

1. Теплый буфер перфузии и фиксатор 35 - 37 ° C. Правильная температура буфера обескровливания и фиксатором помогает обеспечить целостность тканей.
2. Анестезировать животное с одной внутрибрюшинной инъекции 50 мг / кг кетамина и 5 мг / кг ксилазина.
3. После того, как животное находится подглубокого наркоза, оценивается путем изъятия задних конечностей и хвоста крайнем случае, Y надрез с тупыми ножницами в животе животного, чтобы разоблачить печени и воротной вены.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что оборудование в чистоте, чтобы избежать загрязнения образцов с микроорганизмами и общего мусора, который будет легко увидеть на SEM.
4. Tie два очень свободно швов вокруг воротной вены проксимальнее один печени, а другой более дистально в печень.
5. Иглу в портальную вену с соответствующего размера IV канюли (18 г для крыс, 22 г для мышей) .Tighten швы, чтобы обеспечить канюли.
6. Начать перфузии забуференным фосфатом физиологическим раствором нагревают до 37 ° С, и при давлении 10 см H ₂ 0. От 5 до 20 мл PBS, как правило, требуется, чтобы обескровить печень.
   Примечание: Не чтобы пузырьки воздуха, чтобы войти в печень через трубы, соединенных с канюлей, как они вызывают артефакты вторичные эмболизации и давления; Повреждение гепатоцитов, сиnusoids и LSEC Фенестрации происходит, если перфузионное давление слишком высоко.
7. Север брюшной и грудной полой вены, чтобы буфер свободно выйти из печени. Это предотвращает повреждение высокой спинкой давления на LSECs.
8. После того, как печень бесплатно крови, заменить PBS с Е.М. фиксатором и заливать в течение примерно 5 минут, пока печень не закаленные и очень бледный.
9. Прекратите перфузии и сократить фиксированную печень в 1 - 2 мм ³ блоков, используя острый скальпель.
10. После исправления ткани в EM фиксатором для 24 - 72 ч при 4 ° С.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В общем, underfixation вызывает больше артефактов, чем overfixation.
11. Изменить фиксатор Следующий пост-Fix период до 0,1 буфера какодилатном М натрия для хранения при 4 ° С.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы, хранящиеся на этом пути будут сохранены в течение значительного периода времени (до 12 месяцев), однако своевременное вторичной фиксации и экспертиза рекомендуется для лучших результатов.

3. Игла Рerfusion

ПРИМЕЧАНИЕ: Игла фиксация вариант перфузии фиксации, который включает введение фиксатора непосредственно в биопсии ткани печени. Цель состоит в том, чтобы фиксатор промыть через кровеносные сосуды, чтобы обескровить их и выставить все блока ткани для фиксаж. Уход должны быть приняты, чтобы сохранить давление инъекционным низко, чтобы избежать травм давления ^18,19.

1. Удалить маленький кусочек печени от животного или предмета и промыть в солевом растворе, чтобы удалить кровь и грязь.
2. Draw в физиологический раствор в шприц, снабженный тонкой иглой (как правило, инсулиновый шприц).
3. Вводите раствор медленно в печени, пока кровь не вымываются из ткани. Множественные инъекции могут потребоваться.
4. Draw фиксатором EM в другой шприц, снабженный тонкой иглой (как правило, инсулиновый шприц).
5. Внедрить закрепитель очень медленно в печени, пока не станет трудно, и загар в цвете. Несколько инъекцийс может потребоваться.
6. Вырезать фиксированный печень в 1 - 2 мм ³ блоки, используя острый скальпель. Инкубируют в EM фиксатором для 24 - 72 ч 4 ° С. Промыть 3 раза в 0,1 буфера какодилатном М натрий перед началом вторичного фиксацию.

4. Подготовка к сканирующей электронной микроскопии

1. Промыть образец 3 раза в буфере 0,1 М какодилата натрия. Чтобы исправить липидов, после зафиксировать образец в 2% осмия в буфер какодилатном 0,1 М натрия в течение 2 ч.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Полный стиральная очень важно, так как крест глютаральдегид и осмий осмия реагировать и создавать артефакты на SEM.
2. Промыть образцов в возрастающих концентрациях этанола, чтобы начать обезвоживание. Вначале промыть в 50% этаноле в течение 5 минут; затем 3 раза в течение 5 мин с 70% -ным этанолом; промойте 3 раза в течение 5 мин с 90% этанола; промойте 2 раза в течение 5 мин в 100% этаноле; и, наконец, ополоснуть 2 раза в течение 10 мин в 100% этаноле (молекулярное сито).
3. Удалить все этанола из образцов и заменить гексаметилдисилазаном (HMDS) в fumehood и оставить на 10 мин. Удалить из HMDS образцов тканей и позволяют испаряться.
   ПРИМЕЧАНИЕ: ГМДС обладает высокой гигроскопичностью, когда холодно, поэтому позволяют достичь RT перед использованием для конечной стадии дегидратации.
4. При желании, установить образцы немедленно или не поместить их в эксикаторе до готовности крепление для SEM.

5. Монтаж

ПРИМЕЧАНИЕ: Правильный образец монтаж будет максимизировать количество четко определенных синусоиды, доступных для анализа под РЭМ.

1. Этикетка базу металлических SEM заглушки и применять двухстороннюю проводящую ленту углерода в верхней части заглушки.
2. Визуализация образцы с использованием рассекает микроскопом, чтобы определить поверхность с лучшими синусоид для последующего SEM. Поместите эту поверхность вверх на углеродную ленту поверхности заглушки.
3. Придерживайтесь образцы твердо заглушки, образцы готовы к распыления покрытия.

ПРИМЕЧАНИЕ: Покрытие образца с тонкой пленкой проводящего металла (золота или платины) в напыления для нанесения покрытий оснований образца и защищает его от повреждений от электронного пучка. Если покрытие слишком толстый структуры интереса может быть скрыта.

1. Место заглушки в вакуумной камере автоматической тонкой распыления для нанесения покрытия, установить режим вращения и автоматической распылением покрытие в течение 45 сек. Используйте платины покрытие для тоньше подробно, однако золото подходит.
2. Нанесите тонкий слой углерода краски наружных поверхностей смонтированных образцов печени, заботясь, чтобы не покрыть синусоидальные поверхности.
3. После того, как образцы с покрытием платиной и углерод краска высохла они готовы к Анализ на СЭМ. Образцы могут храниться в эксикаторе.

7. Использование сканирующего электронного микроскопа

1. Место образцов в сканирующем электронном микроскопе и возврата микроскопа вакууме. </ LI>
2. Используя стандартные операционные процедуры микроскоп для визуализации образцов, начав в малом увеличении, постепенно увеличивая масштаб.
3. Убедитесь, микроскоп регулируется соответствующим образом для работы расстояние, размер пятна и астигматизм.
4. Проверьте целостность фиксации. Если LSEC в основном свободен от пробелов и содержит фенестраций измерения 30 - 250 нм диаметр этого, как правило, указывают, что подготовка образца была успешной.
5. Если синусоиды полны пробелов или лишены фенестраций подготовка образца не была успешной, или существует значительный патологии. В этом случае, нарезать образца с очень тонкой бритвой, и разрезанные поверхности перекрываться и анализировали на фиксированных успешно синусоид.
6. Примерно 15,000-20,000 кратном увеличении выбора плоских поверхностей LSEC, которые свободны от мусора с хорошей фиксацией и где Фенестрации четко видны (как правило, содержащего по меньшей мере 10 фенестраций).
7. Сохранение изображений не менее 10 синусоид в печени, из разных областей блоков, с использованием по меньшей мере двух блоков в печени. Отбор проб 10 микрофотографии при 15000 - 20000-кратном увеличении на животное, как правило, достаточно для количественное фенестраций быть представителем всей печени.

8. Анализ

ПРИМЕЧАНИЕ: ImageJ программное обеспечение, которое можно загрузить с НИЗ бесплатно используется для количественного диаметр Fenestration и частоты ( www.imagej.nih.gov/ij ).

1. Открыть изображение J и установите шкалу с помощью масштабной линейки, внедренный в изображения (Снимок экрана 1).
2. Используя инструмент многоугольник в ImageJ, след вокруг всей плоской области LSEC в том числе и Фенестрированные defenestrated областях. Не просто проследить сетчатыми тарелками, как это будет ложно завышать пористость. Исключить любые крупные куски мусора, которые находятся на поверхности клеток, которые могут быть Obscuriнг Фенестрации.
3. Для измерения диаметра Fenestration, проследить линию через самый большой диаметр каждого оконных, выбрав инструмент линии, и нажать кнопку «М» для измерения линии, и "d" (ничья) постоянно рисовать линии на рисунке. Эта линия определяется как диаметр оконных. Длина линии теперь будут доступны в окне результатов в ImageJ (Снимок экрана 2).
4. Измерьте все пробелы, которые крупные отверстия в цитоплазме LSEC более 250 нм, а также Фенестрации. Пробелы часто артефакты, отражающие плохой перфузии или фиксацию, однако пробелы могут также возникнуть в результате болезни и токсичности. Данные пробелы будут исключены из расчета параметров светопрозрачных позже в анализе.
5. Площадь пробелы, которые не круглую должна быть рассчитана путем отслеживания вокруг пробелов и расчета их площади на ImageJ.
6. Вставить данные из коробки результатов в ImageJ в таблицу EXCEL для furtheг анализ.

9. Расчеты

1. Средняя фенестрация диаметр = средний всех диаметров светопрозрачных (не включая пробелы, где пробелы являются ≥ 250 нм).
2. Fenestration площадь = πr ^2, где г, радиус, рассчитывается исходя из индивидуального диаметром фенестраций (R = D / 2), не включая пробелы.
3. Пористость (%) = (Σ (πr ²⁾ / общая площадь анализировали - Σ (площадь зазоров =)) (мкм ²⁾⁾ × 100.
4. Частота Fenestration = общее количество фенестраций / (общая площадь проанализированы-Σ (площадь зазоров) (мкм ^2).

10. Представление данных Fenestration

ПРИМЕЧАНИЕ: Каждый раз, когда это возможно, в том числе публикации количественного данных светопрозрачных должны включать следующую информацию

1. Диаметр Fenestration, с заявлением, подтверждающие, что граничные диаметры, где используются, чтобы определить фенестраций (как правило,от 50 - 250 нм), Fenestration частоты (число / мкм ²⁾ и пористость (%).
2. Документ, подтверждающий, были ли пробелы были включены в анализ, распределение частот граф диаметра оконных и количества печени, блоков, изображений и фенестраций должны быть включены в анализ.

Начальное визуализации при малом увеличении с помощью сканирующего электронного микроскопа показывает плоскую поверхность образца печени с открытой площади, достаточно большой, чтобы наблюдать много крупных сосудов печени и синусоиды (рис 1а). Обеспечение правильного размещения блока печени на монтажной заглушкой имеет важное значение для получения четких изображений синусоиды и капсулой Глиссон в печени, следует избегать по этой причине (рис 1B). Увеличение увеличение позволяет более внимательном рассмотрении плотной сосудистой печени и раскрывает одноклеточные пластины гепатоцитов, которые разделяют сосуды (рис 1в). Плохо фиксация результатов печени в плохом качестве изображения, клеток крови и мусора закрывают вид из печени (рис 1D).

Дальнейшее увеличение увеличение позволяет наблюдать LSEC фенестраций (2А). Очень важно, чтобы синусоиды корр ectly определены - пластины гепатоцитов может, при некоторых обстоятельствах выглядеть кровеносных сосудов, но таких функций, как желчные канальцы помочь с ориентацией (рис 2B). Высокое давление перфузии может привести к артефактов, таких как большие пробелы в эндотелия, как полагают, быть вызвано слиянию сетчатыми тарелками LSEC. Это можно легко определить в соответствии с SEM (фиг.2с). Уход клеточную мембрану непосредственно над ядер поможет с точностью плотности оконных и пористости расчетов (рис 2D).

Анализ LSEC с ImageJ позволяет количественно LSEC диаметром фенестрация, плотности и частоты (рис 3а). Эти размеры обеспечивают эмпирическое измерение фенестраций и позволяют измерения изменений, вызванных старением, болезнью, токсинами или лечения (рис 3b).

Файлы / ftp_upload / 52698 / 52698fig1.jpg "/>
Рисунок 1. Визуализация печени с SEM. () Первоначальный осмотр под SEM показывает синусоиды печени и более крупные суда в том числе портала тракта и центральной венулы (б) Капсула Глиссон охватывает все детали синусоиды (C) плотного сосудистую печени и одноклеточные пластины гепатоцитов, которые лежат между судами;. (D) Плохие результаты фиксации в сжатом синусоиды и развитие ультраструктурным артефактов Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 2. Ультраструктура печени. () LSEC Фенестрации легко увидеть н в хорошо фиксированной ткани; (б) поверхности гепатоцитов с хорошо сохранившегося желчные канальцы; (С) Большие зазоры в эндотелии, вызванных высоким давлением перфузии, (D) LSEC ядра показано стрелками выпуклость под поверхностью тонкий LSEC и не должны быть включены в районе для анализа пористости. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 3. Анализ LSEC с ImageJ. () Многоугольной инструмент позволяет измерять общей площади для измерения и инструмент линия используется для измерения диаметра Fenestration; (б) частоты гистограмма порожденную данных, полученных от изображения J анализа.2698fig3large.jpg "цель =" _ пустое "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Таблица 1.

Таблица 2. Советы по устранению неполадок для бедных образца и качества изображения.

Авторам нечего раскрывать.