Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Кислород-Глюкоза Лишение и реоксигенации в

19.2K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/52699

⸱

7 мая 2015 г.

 ,  ,  , 
1Department of Surgery, Texas A&M University Health Science Center College of Medicine, 2Department of Surgery, Baylor Scott & White Health

В этой статье

Краткое содержание

Ишемия-реперфузионное повреждение (ИР) связано с высоким уровнем заболеваемости и смертности. Целью описанной здесь модели кислородно-глюкозной депривации и реоксигенации in vitro (OGD-R) является оценка влияния ишемического реперфузионного повреждения на различные клетки, в частности на эндотелиальные клетки гематоэнцефалического барьера (ГЭБ).

Аннотация

Ишемии (ИК) травмы, как известно, в значительной мере способствовать заболеваемости и смертности, связанной с ишемических инсультов. Ишемические нарушения мозгового кровообращения приходится 80% всех инсультов. Распространенной причиной повреждения ИК является быстрое поступление жидкости после проведения острой / хронической окклюзии крови, питательных веществ, кислорода к ткани вызывая образование свободных радикалов.

Ишемический инсульт сопровождается гематоэнцефалический барьер (ГЭБ) дисфункции и вазогенного отека мозга. Конструктивно плотные соединения (ТТ) между эндотелиальными клетками, играют важную роль в поддержании целостности гематоэнцефалического барьера (ГЭБ). ИК травмы рано вторичное повреждение приводит к неспецифической, воспалительной реакции. Окислительный стресс и метаболические следующие воспаления вызывает вторичное повреждение головного мозга в том числе BBB проницаемости и нарушение плотного контакта (TJ) целостности.

Наш протокол представляет в пробирке </ EM> пример кислорода-глюкозы лишения и реоксигенации (OGD-R) на мозг крыс эндотелиальных клеток TJ целостности и формирования стресс волокна. В настоящее время, несколько экспериментальных моделей в естественных условиях, используются для изучения влияния ИК травмы; Однако они имеют ряд ограничений, таких, как технические проблемы при выполнении операций, генные зависимые молекулярные влияния и трудности в изучении механистические отношения. Тем не менее, модели, в пробирке, может помочь в преодолении многих из этих ограничений. Представлены протокол может быть использован для изучения различных молекулярных механизмов и механических связей для обеспечения потенциальных терапевтических стратегий. Тем не менее, результаты исследований в пробирке, может отличаться от стандартных в естественных исследований и их следует интерпретировать с осторожностью.

Введение

Ишемии (ИК) травма оказалась частой причиной различных изнурительных осложнений и смертей, связанных с инсультом, инфарктом миокарда, травмы, заболевания периферических сосудов и черепно-мозговой травмой 1,2. ИК травмы в мозговых сосудах в начале вторичное повреждение приводит к воспалению и отеку 3. Одним из серьезных осложнений, которые происходит в результате окислительной и метаболического стресса следующей воспаления является потеря гомеостаза баланса, ведущего к образованию свободных радикалов, изменения в гематоэнцефалический барьер (ГЭБ) плотные соединения (ТТ) и микрососудов проницаемости 4,5.

В настоящее время в естественных условиях модели, используемые для изучения последствий ИК травмы на BBB включают окклюзии средней мозговой артерии (MCAO), микроэмболии и трансгенных или нокаутом животных. Тем не менее, каждый из них имеет свои недостатки и ограничения, как описано в Hossmann 6. МСАО модель используется для изучения эфТС окислительно-восстановительного стресса, изменения в соединительных коммуникаций BBB и взаимодействия между мозгом и иммунных клеток. Тем не менее, они представляют различные технические проблемы, такие как необходимость точных микрохирургических операций и трудности в нем. Микроэмболии мгновенно разрушает BBB, а использование трансгенных животных или нокаут, чтобы изучить церебральной ишемии может иметь проблемы, как ген-зависимым молекулярных воздействий на формирование инфаркта, изменения в сосудистой анатомии и различных масс тела 6. Следовательно, модели в пробирке ишемии нашли повышенный интерес в последние времена в основном за счет их применимости в выполнении механистические исследования на наркотики. Тем не менее, результаты исследований в пробирке не может в полной мере представляют собой исследование в естественных условиях и должны быть интерпретированы с осторожностью 6.

Противодействующий эффект низких концентраций кислорода на поверхности эндотелиальных клеток монослоя и микрососудов проницаемости былиизучены Огава 7. Крыса мозг микрососудистых эндотелиальных клеток (RBMECs) были использованы для разработки в пробирке BBB. Лишение кислород глюкозы и реоксигенации техника (OGD-R), представленные в этом протоколе была адаптирована из исследований Зулуэта др и Чжу и др 8,9. Мы разоблачили эндотелиальных клеток головного мозга в OGD-R, помещая их в гипоксия / аноксии камеру, содержащую 0% O 2, 5% СО 2 и 95% N 2. Клетки позже оценивали изменения в целостности и стресс формирования волокна с использованием иммунофлюоресценции TJ локализации и родамин фаллоидином маркировку соответственно. Иммунофлуоресценции окрашивание блокатора малой зоны 1 (ZO-1) выполняется для определения целостности TJ, а ZO-1 является важным леса мембраной т белка. Родамин фаллоидином маркировка определяет нитчатые актин (F-актина) в клеточной цитоскелета и четкое указание актина формирования стресс волокна в эндотелиальных клетках.

<р = класс "jove_content"> Цель данного метода является дать представление разработки OGD-R в качестве экстракорпорального ИК модели для изучения ВВВ эндотелиальных клеток целостность TJ и образование Ф-актина стресс волокна. Результаты будут предоставлять информацию о судьбе TJ белка, ZO-1 и формирование стресс волокна следующие OGD-R. Понимание этих отношений даст возможность, чтобы определить основные молекулярные механизмы, которые запускаются следующие OGD-R и развивать потенциальные терапевтические стратегии по повышению нарушения ВВВ после лечения OGD-R.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Посев эндотелиальных клеток

  1. Получить первичных культур RBMEC-х от взрослых Спрэг Dawley крыс (или получить их в коммерческих целях).
  2. Выращивают RBMECs в 100 см фибронектина (50 мкг / мл) покрытые чашки Петри с использованием мозга крысы среду роста эндотелиальных клеток. Изменение среды каждые два дня, до конфлюентности пока не будет достигнута.
  3. По достижении 80-90% слияния, осторожно промыть клетки в 5 мл забуференного фосфатом физиологического раствора (PBS), вращая. Затем клетки отделяют путем воздействия на них 1 мл теплого 0,25% трипсино этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) раствор, уравновешенных до 37 ° С.
  4. Инкубируйте клетки при 37 ° С в течение 2-5 мин, пока клетки не будут отделены и рассеяны.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Нажмите культуры блюдо отделяться клетки. Посмотреть клетки под микроскопом, чтобы подтвердить полное отделение клеток от поверхности тарелки.
  5. Добавить 5 мл полной среды в чашке Петри, чтобы нейтрализовать трипсина.Внесите из среды, содержащей отдельные клетки и собирать его в 15 мл центрифужную пробирку. ,
  6. Центрифуга носитель с эндотелиальные клетки при 220 мкг в течение 5 мин.
  7. Аспирируйте супернатант и сохранить осадок, содержащий cells.Suspend осадок в 3-5 мл свежего мозга крыс среде роста эндотелиальных клеток, мягко смешивая его вверх и вниз с пипетки клеток затем будет считаться использованием автоматизированного счетчика клеток или гемоцитометра.
  8. Передача клеточной суспензии в фибронектина (50 мкг / мл), предварительно покрытый 8 и стерильной системы камера слайд, 0,7 см 2 / а с плотностью посева в диапазоне от 10000-15000 клеток на лунку. Выращивают клетки при 37 ° С до слияния не будет достигнута
    Примечание: Для выполнения вестерн-блоттинга или других экспериментов, клетки могут быть выращены в 10 см чашки для культивирования клеток или специальных блюд в соответствии с требованиями эксперимента.

2. Кислород и глюкоза Лишение-реоксигенации In VitroМодель

ПРИМЕЧАНИЕ: Следующий протокол был адаптирован с Зулуэта др. 1997; Чжу Н и др. 2012 8,9.

  1. Используйте систему культивирования клеток гипоксия изучить эффекты от OGD-R на RBMECs в (рисунок 1). Настройка и калибровка системы для культивирования клеток гипоксия до начала эксперимента, в соответствии с инструкциями изготовителя.
  2. Снимите сливной камеры слайды (шаг 1.8) от 37 ° C инкубатора. Заменить полную среду в камере слайд с дезоксигенированную, не глюкоза, модифицированной среде Дульбекко Игла (DMEM), и помещают в гипоксии камеру с 95%, N 2 и 5% CO 2 в течение 2 ч при 37 ° С, не представляют OGD состояние.
  3. Перемещение клеток обратно в инкубаторе с 95% O 2, 5% СО 2 при 37 ° С и при условии, со свежими мозга крыс эндотелиальных клеток полной среде и инкубируют в течение еще ​​1 часа при 37 ° С.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг представляет собой реоксигенации ситуацию.
  4. Используйте камеры слайды для иммунофлуоресценции локализации и родамин фаллоидином маркировки (раздел 3).

3. Иммунофлуоресценции Локализация ZO-1 и ф-актина маркировки Использование родамин фаллоидином

  1. Expose камеры слайды, содержащие RBMEC монослоев 100 мкл Opti-MEM / пониженной сыворотки СМИ / а в течение 1 часа. Промыть камере слайды 3 раза в 100 мкл фосфатно-солевого буфера (PBS, рН 7,0-7,2).
  2. Фиксации клеток с использованием 100 мкл 4% параформальдегида в PBS (рН 7,0-7,2) в течение 15 мин и мыть камере слайды в течение еще 3 раза в PBS (рН 7,0-7,2).
  3. Клетки проницаемыми с использованием 100 мкл 0,5% Тритона Х-100 в PBS, рН (7,0-7,2) еще в течение 15 мин. Блок 100 мкл 2% бычьего сывороточного альбумина (BSA) в PBS в течение часа. После этого шага либо клеток пятно / этикетки либо для ZO-1 или f-актина.
    1. Для иммунофлюоресценции ГНАоцен- ками инкубировать клетки с первичным антителом против кролика против ZO-1 в соотношении 1: 150, который был подготовлен в 2% BSA-PBS в течение O / N при 4 ° С. Вымойте клетки 3 раза в PBS (рН 7,0-7,2). Инкубируют 100 мкл флуоресцеин изотиоцианат (FITC) -tagged анти-кролик вторичного антитела в течение 1 часа при комнатной температуре.
    2. Для родамина фаллоидином маркировки, после блокировки, подвергать клетки в 100 мкл родамина фаллоидином в разведение 1:50, получают 2% BSA-PBS, в течение 20 мин.
    3. Вымойте клетки от иммунофлюоресценции окрашивания и родамина фаллоидином маркировки в PBS, рН 7,0-7,2 (). Установите камер, используя крепежные средства массовой информации, содержащие анти-выцветанию реагента с DAPI.
  4. Визуализация клеток с использованием 60 х погружения в воду линзы и клетки сканируются в одном оптическом плоскости под конфокальной микроскопии.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Клетки, культивируемые на фибронектина с предварительно нанесенным покрытием камеры слайдов Nunc II подвергались OGD-R, помещая в Biospherix ProOx модели 110 камеры. После подвергая клетки к OGD-R, они были обработаны для ZO-1 соединительного окрашивания с использованием техники иммунофлюоресценции, как показано на рисунке 2 и цитоскелета сборки указывает образование F-актина стресс волокна использованием родамин-фаллоидином пятна этикетку, как показано на рисунке 3. Контрольными клетка...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

OGD-R как модель в пробирке для ишемии реперфузии была хорошо известна для изучения нейроны 10,11. Есть также исследования, показывающие влияние OGD на эндотелиальных клетках головного мозга и изменения в проницаемости и целостности TJ 9. Тем не менее, наше исследование показывает эффект OGD а также реоксигенация, который ближе представление ишемического реперфузионного повреждения в условиях в естественных условиях, которые возникают следующие ишемический инсульт.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Мы признаем, Скотт и Белый больницы программу исследовательских грантов для финансовой поддержки и Техас & M Научного центра здоровья Медицинского колледжа интегрированной лаборатории изображений для использования конфокальной лазерной микроскопии. Мы признаем, г-н Глен Крайер за помощь в рукописи редактирования.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Proox model 110BiospherixModel 110
DMEM, без глюкозыGibco, Life technologies11966-025
Rhodamine PhalloidinLife technologiesR415
ZO-1 Rabbit Polyclonal АнтителаLife technologies617300
Nunc Lab Tek II-CC 8  хорошо стерильный, стеклянный  Слайды Термонаучный177402
Вторичное антитело против кроликов с мечкой FITC Santa cruzsc-2090
DPBS 1XThermo scientificSH 30028.03Можно использовать любые другие доступные PBS

Ссылки

  1. Eltzschig, H. K., Eckle, T. Ischemia and reperfusion--from mechanism to translation. Nat Med. 17 (11), 1391-1401 (2011).
  2. Kalogeris, T., Baines, C. P., Krenz, M., Korthuis, R. J. Cell biology of ischemia/reperfusion injury. Int Rev Cell Mol Biol. 298, 229-317 (2012).
  3. Yang, X., et al. Lycium barbarum polysaccharides reduce intestinal ischemia/reperfusion injuries in rats. Chem Biol Interact. 204 (3), 166-172 (2013).
  4. Kaur, C., Ling, E. A. Blood brain barrier in hypoxic-ischemic conditions. Curr Neurovasc Res. 5 (1), 71-81 (2008).
  5. Khatri, R., McKinney, A. M., Swenson, B., Janardhan, V. Blood-brain barrier, reperfusion injury, and hemorrhagic transformation in acute ischemic stroke. Neurology. 79 Suppl 1. (13), S52-S57 (2012).
  6. Hossmann, K. A. Experimental models for the investigation of brain ischemia. Cardiovasc Res. 39, 106-120 (1998).
  7. Ogawa, S., Gerlach, H., Esposito, C., Pasagian-Macaulay, A., Brett, J., Stern, D. Hypoxia modulates the barrier and coagulant function of cultured bovineendothelium. Increased monolayer permeability and induction of procoagulant properties. J Clin Invest. 85 (4), 1090-108 (1990).
  8. Zulueta, J. J., Sawhney, R., Yu, F. S., Cote, C. C., Hassoun, P. M. Intracellular generation of reactive oxygen species in endothelial cellsexposed to anoxia-reoxygenation. Am J Physiol. 272 (5 Pt 1), L897-L902 (1997).
  9. Zhu, H., et al. Baicalin reduces the permeability of the blood-brain barrier during hypoxia in vitro by increasing the expression of tight junction proteins in brain microvascular endothelial cells. J Ethnopharmacol. 141 (2), 714-720 (2012).
  10. Abramov, A. Y., Scorziello, A., Duchen, M. R. Three distinct mechanisms generate oxygen free radicals in neurons and contribute to cell death during anoxia and reoxygenation. J Neurosci. 27 (5), 1129-1138 (2007).
  11. Gundimeda, U., et al. Green tea polyphenols precondition against cell death induced by oxygen-glucose deprivation via stimulation of laminin receptor, generation of reactive oxygen species, and activation of protein kinase Cepsilon. J Biol Chem. 287 (41), 34694-34708 (2012).
  12. Mehta, S. L., Manhas, N., Raghubir, R. Molecular targets in cerebral ischemia for developing novel therapeutics. Brain Res Rev. 54 (1), 34-66 (2007).
  13. Alluri, H., et al. Reactive Oxygen Species-Caspase-3 Relationship in Mediating Blood-Brain Barrier Endothelial Cell Hyperpermeability Following Oxygen-Glucose Deprivation and Reoxygenation. Microcirculation. 21 (2), 187-195 (1111).
  14. Sun, H., Breslin, J. W., Zhu, J., Yuan, S. Y., Wu, M. H. Rho and ROCK signaling in VEGF-induced microvascular endothelial hyperpermeability. Microcirculation. 13 (3), 237-247 (2006).
  15. Doggett, T. M., Breslin, J. W. Study of the actin cytoskeleton in live endothelial cells expressing GFP actin. J Vis Exp. (57), (2011).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Модель реоксигенациицелостность плотных контактовформирование стрессовых фибриллконфокальная микроскопияиммунофлуоресцентное окрашиваниегипоксическая камераэндотелиальные клетки головного мозга крысы
Кислород-Глюкоза Лишение и реоксигенации в
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.