Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Использование высокого разрешения ИК термографии (HRIT) для изучения ледовой зарождения и распространения ледникового у растений

9K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/52703

⸱

8 мая 2015 г.

 ,  , 
1U.S Department of Agriculture, Agricultural Research Service (USDA-ARS), Kearneysville, WV, 2Institute of Botany, University of Innsbruck, 3Department of Plant Science, University of Saskatechewan

В этой статье

Краткое содержание

Здесь мы представляем протокол, который позволяет визуализировать места образования льда и пути распространения льда в растениях с помощью инфракрасной термографии высокого разрешения (HRIT).

Аннотация

События замерзания, которые происходят во время активного роста растений, могут быть смертельными, особенно если растение не имеет устойчивости к замерзанию. Такие морозы часто оказывают разрушительное воздействие на сельскохозяйственное производство, а также могут играть важную роль в формировании структуры сообществ в естественных популяциях растений, особенно в альпийских, субарктических и арктических экосистемах. Таким образом, лучшее понимание процесса замораживания растений может сыграть важную роль в разработке методов защиты от заморозков и понимании механизмов предотвращения замерзания. В этой статье мы опишем протокол визуализации процесса замораживания на предприятиях с помощью инфракрасной термографии высокого разрешения (HRIT). Использование данной технологии позволяет определить первичные места образования льда у растений, способы размножения льда и наличие ледовых барьеров. Кроме того, это позволяет изучить роль внешних и внутренних нуклеаторов в определении температуры, при которой растения замерзают, и оценить способность различных соединений либо влиять на процесс замораживания, либо повышать устойчивость к замораживанию. Использование HRIT позволяет визуализировать множество адаптаций, которые развились у растений, которые прямо или косвенно влияют на процесс замораживания и в конечном итоге позволяют растениям пережить морозы.

Введение

Замораживание температур, которые возникают, когда растения активно растут может быть смертельным, особенно если растение имеет мало или вообще не морозостойкость. Такие события часто мороз иметь разрушительные последствия для сельскохозяйственного производства, а также может играть важную роль в формировании структуры сообщества в природных популяциях растений, особенно в альпийских, субарктических и арктических экосистем 1-6. Эпизоды тяжелых весенних заморозков имели серьезные последствия для производства фруктов в США и Южной Америке в последние годы 7-9 и усугубляется ранним началом теплой погоды следует более типичных средних низких температурах. Рано теплая погода вызывает почки сломать, активируя рост новых побегов, листьев, цветов и все из которых имеют очень мало No Frost толерантности 1,3,10-12. Такие неустойчивые погодные сообщалось быть прямым отражением продолжающегося изменения климата и, как ожидается, будет общий шаблон Прогноз погоды на Форесeeable будущее 13. Усилия по обеспечению экономических, эффективных и экологически чистых методов управления или агрохимикатов, которые могут обеспечить повышенную толерантность мороз имели ограниченный успех для целого ряда причин, но это может быть частично связано со сложным характером замораживания терпимости и замораживания механизмы уклонения в растениях. 14

Адаптивные механизмы, связанные с мороза выживания растений традиционно делятся на две категории, морозостойкость и замораживания избежать. Первая категория связана с биохимических механизмов, регулируемых определенного набора генов, которые позволяют растения переносят стрессы, связанные с наличием и дегидратационной эффект льда в его тканях. В то время как последняя категория обычно, но не исключительно, связана со структурными аспектами растения, которые определяют, если, когда и где образуется лед на заводе 14. Несмотря на распространенность замораживания избежания как с объявлениемaptive механизм, мало исследований было посвящено в последнее время к пониманию основных механизмов и регулирование замораживания избегания. Мы отсылаем читателя к недавнему обзору 15 для более подробно по этому вопросу.

В то время как образование льда при низких температурах может показаться простой процесс, многие факторы способствуют определения температуры, при которой лед зарождается в растительных тканях и как он распространяется внутри растения. Такие параметры, как наличие внешней и внутренней льда Структурообразователи, гетерогенных против однородных событий зародышей, тепловой гистерезиса (антифриз) белков, наличием специфических сахаров и других осмолитов, и множество структурных аспектов завода все могут играть значительную роль в процессе замораживания в растениях. В совокупности эти параметры влияют на температуру, при которой растение замерзает, где лед образуется и как он растет. Они также могут влиять на структуру полученных кристаллов льда.Различные методы были использованы для изучения процесса замерзания в растениях в лабораторных условиях, в том числе ядерного магнитного резонанса (ЯМР) 16, магнитно-резонансная томография (МРТ), 17 крио-микроскопии 18-19 и низкотемпературной сканирующей электронной микроскопии (LTSEM ). 20 Замораживание целых растений в лабораторных и полевых условиях, однако, в основном, были проверены с термопар. Использование термопар для изучения замораживание основан на выделении тепла (энтальпии плавления), когда вода претерпевает фазовый переход из жидкого состояния в твердое. Замораживание затем записывается в случае экзотермической. 21-23 Даже если термопары типичным методом выбора в изучении замораживания в растениях, их использование имеет много ограничений, которые ограничивают количество информации, полученной в ходе замораживания случае. Например, с помощью термопар трудно почти невозможно определить, где лед инициируется в растениях, как он распространяется,если она распространяется на равномерной скоростью, и если некоторые ткани остаются свободными от льда.

Достижения в инфракрасной термографии с высоким разрешением (HRIT) 24-27, однако, существенно увеличили возможность получения информации о процессе замораживания в целые растения, особенно при использовании в режиме дифференциального изображения. 28-33 В настоящем докладе мы описывают использование этой технологии для изучения различных аспектов процесса замораживания и различные параметры, которые влияют на том, где и и на то, что температура льда, начатые в растениях. Протокол будет представлен, которые демонстрируют способность льда зарождение активных (ИНА) бактерии Pseudomonas syringae, (CIT-7) выступать в качестве внешнего зародышей инициирующего замораживания в травянистых растений на высоком, отрицательной температуры.

Высокое разрешение Инфракрасная камера

Протокол и примеры в настоящем докладе использовать высокое разрешение инфракрасныевидео радиометр. Радиометр (Рисунок 1) обеспечивает сочетание инфракрасного и видимого изображений спектра и температурных данных. Спектральный отклик камеры находится в диапазоне от 7,5 до 13,5 мкм и обеспечивает 640 х 480 пикселей резолюции. Видимые изображения спектра, порождаемые встроенной камеры могут быть слиты с ИК-изображений в реальном времени, что облегчает интерпретацию сложных тепловых изображений. Диапазон линз для камеры можно использовать, чтобы сделать крупный план и микроскопические наблюдения. Камера может быть использована в автономном режиме, или сопряжено и контролируется с ноутбуком, используя программное обеспечение propietary. Программное обеспечение может быть использовано для получения различных тепловых данных, внедренных в записанных видео. Важно отметить, что широкое разнообразие инфракрасных радиометров являются коммерчески доступными. Таким образом, важно, что исследователь обсудить их предполагаемого применения со знающим инженером продукции и исследователь проверить способность любого УдельныйС радиометр, чтобы обеспечить необходимую информацию. Радиометр изображений в описанном протоколе находится в акриловой коробке (рисунок 2) изолированный пенополистиролом I N порядка, чтобы удержать воздействие конденсата во время потепления и охлаждения протоколов. Эта защита не требуется для всех камер или приложений.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Подготовка растительных материалов

  1. Используйте либо листья или целые растения материала подлежит растений (Хоста SPP., Или Phaseolus обыкновенная).

2. Подготовка водных растворов, содержащих лед зарождения активных (INA) бактерий

  1. Культура бактерия INA, синегнойная syringae (штамм чит-7) в чашках Петри при 25 ° С на Pseudomonas Agar F подготовлен с 10 г / л 100% глицерина в направлении производителя.
  2. После культуры выросли достаточно, место на 4 ° С до необходимости, но сохранить при 4 ° С в течение двух дней до обеспечения высокого уровня льда зарождения деятельности.
  3. Собрать бактерии из одной пластины с поверхности агара с пластика, одноразовые или повторного использования металлического шпателя во время использования и место в 10-15 мл деионизированной воды в 25 мл одноразовой кювете. Концентрация должна быть в диапазоне от 1 х 10 7 до 1 · 10 9 · Мл -1. Решение появится облачность. Там нет необходимости, чтобы подтвердить концентрацию с помощью гемоцитометра или спектрофотометр, а концентрация должна быть только приблизительным.
  4. Vortex кювету в течение как минимум 10 секунд, чтобы распределить бактерии.
    Примечание: удельная концентрация полученного INA смеси не важно и протокол, описанный будут обеспечивать более адекватный уровень льда зарождения деятельности. Эта смесь INA бактерий и воды будут использованы в дальнейшем в нуклеации экспериментов.

3. Настройка Холодильные эксперимент

  1. Поместите инфракрасную камеру высокого разрешения (SC-660) внутри защитной акриловой коробки так, что проекты объектив через отверстие в передней панели и провода, соединяющие камеру к выходу ноутбук или записи устройства через заднее отверстие в коробке , Закрепите крышку коробки, и поставьте флажок в окружающей камере или морозильной камере в таком месте, что будет всевл материал, подлежащий завод будет видно.
    1. Обеспечить темный фон вокруг растительного материала футеровки стенок камеры с черной плотной бумаги, чтобы предотвратить помехи от отраженного инфракрасного излучения.
    2. Установите камеру со светодиодной подсветкой, чтобы свести к минимуму нагрев от источника света при записи изображения в видимом диапазоне требуется. Только минимум освещения, как с батарейным питанием шкаф света или другого небольшого светодиодного устройства, требуется для растения, чтобы быть видимыми камерой.
      1. После того, как видимые изображения материала при условии установки будут приняты, выключите светодиодное освещение. Вы распространяете все внешние проводные соединения (FireWire подключения к компьютеру, кабель питания и т.д.) к камере через порт или другое отверстие в камере.
    3. Заполните все дополнительное пространство в порту или открытия с изолирующей пены материал, чтобы избежать или уменьшить температурные градиенты в камере. Установить начальную температуру в камере на 1 ° C.
  2. Совместите растений или частей растений, так что растительный материал в поле-обзора камеры и растительный материал виден на экране пульта наблюдения или в выбранном программном обеспечении.
  3. Разрешить растения для уравновешивания при 1 ° С в течение 30 мин до 1 ч, в зависимости от размера растительного материала, до начала контролируемого эксперимента замерзания. Это гарантирует, что температура на заводе не будет отставать от температуры воздуха с большим числом степеней когда замораживание эксперимент инициирован. Уравновешивание достигается, когда температура растительного материала находится в пределах 0,5 ° C от температуры воздуха.
    1. Поместите слой пенополистирола изоляции в верхней части почвы в горшках при использовании растения в горшках. После того, как заводы, уравновешенную, начать охлаждение камеры.
      Примечание: слой изоляции на поверхности почвы в горшке уменьшает количество продолжает потери тепла из горшка в воздухе вокруг завода, и предотвращает корни от Freezing, а это не будет, как правило, происходят во время события замерзания в природе в связи с массовым резервуар остаточного тепла, присутствующего в почве.
  4. Установите желаемые параметры камеры (цветовая палитра, диапазон температур, конкретных областях интереса, и т.д.), как описано в 3.4.1-3.4.4.
    1. Выберите радуги палитру для отображения изменения температуры во время просмотра живого изображения.
    2. Установите интервал температур до 5 ° С, регулируя температуру бар, расположенный непосредственно под изображением в программном обеспечении.
    3. Выберите линейную шкалу (алгоритм) для преобразования данных в инфракрасный ложного цветного изображения, как определено выбранной палитры (радужной) и установить диапазон температуры до 5 ° С и автоматически отслеживать на основе изображения. Также можно настроить множество диапазон вручную при проведении эксперимента.
      1. Используйте температуру в конкретной точке или средней температуры в определенной области интереса, предоставленной менаходятся. Извлечение данных о температуре всех пикселей с записанной видеопоследовательности или из информации, встроенной в файле изображения. 3 показан типичный снимок изнутри программного обеспечения ResearchIR.
    4. Поместите курсор на месте на растительной ткани, что представляет определенную точку интереса. Определите область интереса как точки (1 -3 пикселов), коробки, линии, эллипсы, или кругов. Разнообразные комбинации точек или формы могут быть расположены на изображение.
  5. Запись видеопоследовательности
    1. Установите камеру записывать при 60 Гц и для записи будет остановлен вручную.
    2. Укажите место на компьютере или внешнем диске, где будут размещены видео файл.
    3. Начать запись.
      Примечание: Запись на внешнем жестком диске, настоятельно рекомендуется, так как большие видео файлы будут генерироваться. Записанные видео файлы могут быть позже отредактирован, чтобы содержать только часть, содержащую пеобходимости информация. Это позволит значительно уменьшить размер файла.
    4. Чем ниже температура в камере постепенно на 0,5 -1.0 ° C. Подождите, пока температура не уравновешивается завода с температурой воздуха, а затем опустите снова температуры на 0,5-1,0 ° С. В зависимости от массы ткани растений соблюдаться и его морфологии, уравновешивание можно принять от 10 до 15 мин. Таким образом, давая скорость охлаждения примерно 4 ° С / ч.
    5. Продолжайте в том же порядке, пока растение не замерзает и наблюдения будут завершены. Конец записи при процесс замораживания был завершен.
      Примечание: растительные ткани имеет уравновешенную температуры воздуха, когда растительный материал и фон того же цвета, так как они при той же температуре. Поскольку температура фона и температура растительной ткани такие же, это может быть трудно представить себе растительный материал до тех пор, пока снова понизить температуру и существует разность температур между растительной ткани и АИК температуры.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Лед-Нуклеирующий деятельность Ice + бактерии, синегнойная syringae (штамм чит-7)

Падение 10 мкл воды и 10 мкл воды, содержащие P. syringae (Соч-7) были размещены на абаксиальной поверхности листа (Хоста Хоста SPP.) (Рисунок 4). Как показано, капля воды, содержащей бактерии INA замер первый и был ответственным за индукции лист заморозить, а капли воды на поверхности листьев остается незамерзшей.

Замораживание и льда Расп...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Вода обладает способностью к Supercool температуре ниже 0 ° С, а температура, при которой вода замерзнет может быть весьма переменной. 36 предел температуры переохлаждения чистой воды составляет около -40 ° С и определяется как однородной точки образования ядра. Когда вода замерзает при температуре теплее, чем -40 ° C, что вызвано присутствием гетерогенным структурообразователи, что дает небольшим эмбрионов льда с образованием, которые затем служат в качестве катализатора для образования льда и роста. 37...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не имеют конкурирующие финансовые интересы или конфликта интересов.

Благодарности

Это исследование было профинансировано австрийской Фонд науки (FWF): P23681-B16.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Инфракрасная камераFLIRSC-660Доступно множество моделей в зависимости от области
применения Инфракрасное аналитическое программное обеспечениеFLIRResearchIR 4.10.2.5$3,500
Pseudomonas syringae (штамм Cit-7)Любезно предоставлено доктором Стивеном Линдоу, Калифорнийский университет  Berkeley icelab@berkeley.edu
Pseudomonas Agar FFisher ScientificDF0448-17-1

Ссылки

  1. Taschler, D., Beikircher, B., Neuner, G. Frost resistance and ice nucleation in leaves of five woody timberline species measured in situ during shoot expansion. Tree Physiol. 24, 331-337 (2004).
  2. Neuner, G., Hacker, J. Ice formation and propagation in alpine plants. Plants in alpine regions: Cell Physiology of adaptation and survival strategies. Lütz, C. , Springer. 163-174 (2012).
  3. Ladinig, U., Hacker, J., Neuner, G., Wagner, J. How endangered is sexual reproduction of high-mountain plants by summer frosts? - Frost resistance, frequency of frost events and risk assessment. Oecologia. 171, 743-760 (2013).
  4. Wisniewski, M. E., Gusta, L. V., Fuller, M. P., Karlson, D. Ice nucleation, propagation and deep supercooling: the lost tribes of freezing studies. Plant Cold Hardiness: from the laboratory to the field. Gusta, L. V., Wisniewski, M. E., Tanino, K. K. , CAB International. 1-11 (2009).
  5. Bokhurst, S., Bjerke, J. W., Davey, M. P., Taulavuori, K., Taulavuori, E., Laine, K., Callaghan, T. V., Phoenix, G. K. Impacts of extreme winter warming events on plant physiology in a sub-Arctic heath community. Physiol. Plant. 140, 128-140 (2010).
  6. Taulavuori, K., Laine, K., Taulavuori, E. Experimental studies on Vaccinium myrtillus.and Vaccinium vits-idea.in relation to air pollution and global change at northern high latitudes: A review. Env. Exp. Bot. 87, 191-196 (2013).
  7. Wisniewski, M., Glenn, D. M., Gusta, L., Fuller, M. Using infrared thermography to study freezing in plants. HortScience. 43, 1648-1651 (2008).
  8. Gu, L., et al. The 2007 eastern US spring freeze: increased cold damage in a warming world. BioScience. 58, 253-262 (2008).
  9. Augspurger, C. K. Spring warmth and frost: phenology, damage, and refoliation in a temperate deciduous forest. Func. Ecol. 23, Spring. 1031-1039 (2007).
  10. Neuner, G., Erler, A., Hacker, J., Ladinig, U., Wagner, J. Frost resistance of reproductive tissues in various reproductive stages of high alpine plant species. Physiol. Plant. 147, 88-100 (2013).
  11. Skre, O., Taulavuori, K., Taulavuori, E., Nilsne, J., Igeland, B., Laine, K. The importance of hardening and winter temperature for growth in mountain birch populations. Env. Exp. Bot. 62, 254-266 (2008).
  12. Hänninen, H., Tanino, K. Tree seasonality in a warming climate. Trends in Plant Science. 16, 412-416 (2011).
  13. Katz, R. W., Brown, B. G. Extreme events in a changing climate: variability is more important than averages. Climate Change. 21, 289-302 (1992).
  14. Wisniewski, M., Gusta, L. Understanding plant cold hardiness: an opinion. Physiol. Plant. 147, 4-14 (2013).
  15. Wisniewski, M., Gusta, L., Neuner, G. Adaptive mechanisms of freeze avoidance in plants. A brief update. Env. Exp. Bot. 99, 133-140 (2014).
  16. Burke, M. J., Gusta, L. V., Quamme, H. A., Weiser, C. J., Li, P. H. Freezing and injury in plants. Annu. Rev. Plant Physiol. 27, 507-528 (1976).
  17. Ishikawa, M., Price, W. S., Ide, H., Arata, Y. Visualization of freezing behaviors in leaf and flower buds of full-moon maple by nuclear magnetic resonance microscopy. Plant Physiol. 115 (4), 1515-1524 (1997).
  18. Ishikawa, M., Sakai, A. Characteristics of freezing avoidance in comparison with freezing tolerance: a demonstration of extra-organ freezing. Plant cold hardiness and freezing stress. Li, P. H., Sakai, A. , Academic Press. 325-340 (1982).
  19. Buchner, O., Neuner, G. Freezing cytorrhysis and critical temperature thresholds for photosystem II in the peat moss Sphagnum capillifolium. Protoplasma. 243 (1), 63-71 (2010).
  20. Pearce, R. S. Extracellular ice and cell shape in frost-stressed cereal leaves: A low temperature scanning electron microscopy study. Planta. 175, 313-324 (1988).
  21. Ashworth, E. N., Anderson, J. A., Davis, G. A., Lightner, G. W. Ice formation in Prunus persica. under field conditions. J. Am. Soc. Hort. Sci. 110 (3), 322-324 (1985).
  22. Ashworth, E. N., Davis, G. A. Ice formation in woody plants under field conditions. HortSci. 21, 1233-1234 (1986).
  23. Pramsohler, M., Hacker, J., Neuner, G. Freezing pattern and frost killing temperature of apple (Malus domestica.) wood under controlled conditions and in nature. Tree Physiol. 32 (7), 819-828 (2012).
  24. Wisniewski, M., Lindow, S. E., Ashworth, E. N. Observations of ice nucleation and propagation in plants using infrared video thermography. Plant Physiol. 113 (2), 327-334 (1997).
  25. Lutze, J. L., et al. Elevated atmospheric [CO2] promotes frost damage in evergreen tree seedlings. Plant Cell Environ. (6), 631-635 (1998).
  26. Ball, M. C., et al. Space and time dependence of temperature and freezing in evergreen leaves). Func. Plant Biol. 29 (11), 1259-1272 (2002).
  27. Sekozawa, Y., Sugaya, S., Gemma, H. Observations of ice nucleation and propagation in flowers of Japanese Pear (Pyrus Pyrifolia). Nakai) using infrared video. 73 (1), 1-6 (2004).
  28. Hacker, J., Neuner, G. Ice propagation in plants visualized at the tissue level by IDTA (infrared differential thermal analysis). Tree Physiol. 27, 1661-1670 (2007).
  29. Hacker, J., Neuner, G. Ice propagation in dehardened alpine plant species studied by infrared differential thermal analysis (IDTA). Arc. Antarc. Alp. Res. 40 (4), 660-670 (2008).
  30. Hacker, J., Spindelböck, J., Neuner, G. Mesophyll freezing and effects of freeze dehydration visualized by simultaneous measurement of IDTA and differential imaging chlorophyll fluorescence. Plant Cell Environ. 31, 1725-1733 (2008).
  31. Neuner, G., XU, B., Hacker, J. Velocity and pattern of ice propagation and deep supercooling in woody stems of Castanea sativa., Morus nigra. and Quercus robur. measured by IDTA. Tree Physiol. 30, 1037-1045 (2010).
  32. Hacker, J., Ladinig, U., Wagner, J., Neuner, G. Inflorescences of alpine cushion plants freeze autonomously and may survive subzero temperatures by supercooling. Plant Sci. 180, 149-156 (2011).
  33. Kuprian, E., Briceno, V., Wagner, J., Neuner, G. Ice barriers promote supercooling and prevent frost injury in reproductive buds, flowers and fruits of alpine dwarf shrubs throughout the summer. Env. Exp. Bot. 106, 4-12 (2014).
  34. Wisniewski, M., Glenn, D. M., Fuller, M. Use of a hydrophobic particle film as a barrier to extrinsic ice nucleation in tomato plants. HortScience. 127, 358-364 (2002).
  35. Aryal, B., &Neuner, G. Leaf wettability decreases along an extreme altitudinal gradient. Oecologia. 162, 1-9 (2010).
  36. Wisniewski, M., Fuller, M. P. Ice nucleation and deep supercooling in plants: new insights using infrared thermography. In: Cold adapted organisms. Ecology, physiology, enzymologyandmolecularbiology. Margesin, R., Schinner, F. , Springer. 105-118 (1999).
  37. Franks, F. Biophysics and biochemistry at low temperatures. , Cambridge University Press. (1985).
  38. Neuner, G., Kuprian, E. Infrared thermal analysis of plant freezing processes. Methods in Molecular Biology: Plant Cold Acclimation. Hincha, D., Zuther, E. , Springer. 91-98 (2014).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Использование высокого разрешения ИК термографии (HRIT) для изучения ледовой зарождения и распространения ледникового у растений
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.