Методическая статья

В Vivo Динамика сетчатки микроглии активации во нейродегенерации: конфокальной офтальмоскопической изображений и клеточной морфометрии в мышь Глаукома

DOI:

10.3791/52731

⸱

11 мая 2015 г.

 ,  ,  , 
1Department of Neurobiology & Anatomy, University of Utah, 2Department of Ophthalmology & Visual Sciences, University of Utah

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Активация микроглии и microgliosis являются ключевыми ответы на хронической нейродегенерации. Здесь мы представляем методы для в естественных условиях долгосрочного визуализации сетчатки CX3CR1-GFP + клеток микроглии по конфокальной офтальмоскопии, и порог и морфометрических анализ для выявления и количественной оценки их активации. Мы следим за микроглии изменения на ранних стадиях возрастного глаукомы.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Микроглия, которые нейроиммунных клетки ЦНС резидентов, превратить их морфологию и размер в ответ на поражения ЦНС, переход на активированном состоянии с различными функциями и профилей экспрессии генов. Роли активации микроглии в области здравоохранения, травмы и заболевания остаются не полностью понял из-за их динамической и сложной регуляции в ответ на изменения в их микросреды. Таким образом, очень важно, чтобы неинвазивно отслеживать и анализировать изменения в микроглии активации в течение долгого времени в здоровом организме. В естественных условиях исследования активации микроглии были задержаны по технических ограничений, отслеживания микроглии поведения без изменения окружающей среды ЦНС. Это было особенно сложным при хронической нейродегенерации, где долгосрочные изменения должны быть отслежены. Сетчатка, орган ЦНС поддается неинвазивной визуализации живого, предлагает мощную систему визуализации и характеризуют динамику активации микроглии во хронических заболеваний.

в естественных сетчатки микроглии, с помощью конфокальной офтальмоскопии (cSLO) и CX3CR1 GFP / + мышей репортер, чтобы визуализировать микроглии с сотовой резолюции. Кроме того, мы опишем методы для количественной оценки ежемесячные изменения в активации клеток и плотности в больших клеток подмножеств (200-300 клеток на сетчатке). Мы подтверждаем использование сомный области в качестве полезного метрики для живого отслеживания активации микроглии в сетчатке с применением автоматизированной порог на основе морфометрического анализа изображений в естественных условиях. Мы используем эти живые приобретение изображения и анализирует стратегии для мониторинга динамических изменений в микроглии активации и microgliosis на ранних стадиях сетчатки нейродегенерацией в мышиной модели хронического глаукомы. Этот подход должен быть полезно исследовать вклад микроглии в нейронной и аксонов снижение хронических расстройств ЦНС, которые влияют на сетчатку и зрительный нерв.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Микроглия являются нейроиммунных клетки, которые исключительно проживают в центральной нервной системе (ЦНС), так как в начале эмбрионального развития и на протяжении взрослой жизни. Оснащен комплексной репертуара рецепторов, микроглии активность и гетерогенности регулируются их двунаправленного взаимодействия с соседними нейронами, глии, гематоэнцефалический барьер и проникающих нейровоспалительных клетки 1,2. Базальные микроглии функции способствуют физиологической технического обслуживания и ремонта, а они пробуют их территорию для возмущений гомеостаза 3,4. Во время травмы или болезни ЦНС, микроглии являются первыми отвечают на нейронных сигналов, которые затем вызывают их перехода к реактивной фенотипа, называется "активированный микроглии 2,5-7. Активация микроглии включает в себя сложную цикл генов белков и выражения, которые связаны с клеточной сомы и процесс изменения размеров и реконструкции 6-9. Активация микроглии, а также перераспределение клеток икластеризации, может сопровождаться местной общее увеличение числа клеток (называемых microgliosis). Это может быть результатом пролиферации клеток и самообновления, с или без набора из крови моноцитов 3,4,7,10-14. В широком диапазоне возрастных хронических заболеваний ЦНС, устойчивый microgliosis и активация микроглии параллельно прогрессирования заболевания 15-19. Как микроглии влияние нейродегенерация остается неясным, в основном потому, что они играют как нейропротекторные и вредные роли, которые могут иметь различные взносы в начале заболевания и прогрессии. Живые исследования отображения, направленных на изучение хронического заболевания ЦНС мониторинг микроглии поведение в поврежденной ЦНС моделей животных и человека, и показали, что микроглии изменения могут быть обнаружены начало на ранних стадиях заболевания 15-17,19,20. Таким образом, важно разработать подходы для выявления и мониторинга микроглии активации в естественных условиях.

Неинвазивная Deteие региональных изменений в активации мозга микроглии был создан как важно в естественных условиях показатель прогрессии нейродегенеративных заболеваний, с использованием молекулярного изображений или биолюминесценции и позитронно-эмиссионной томографии или магнитно-резонансную томографию 18,21,22. Эти высоко количественные и неинвазивные методы молекулярной и атомной изображений обнаружить глиоза с региональным разрешением. Кроме того, два фотона конфокальной изображений в CX3CR1 GFP / + мышей позволило наблюдение микроглии мозга с сотовой резолюции 3,4,9,20,23-28. Тем не менее, этот подход ограничивает долгосрочные и повторное наблюдение хронических микроглии изменений, учитывая потенциальный риск нарушения их поведение, даже минимально инвазивных процедур визуализации мозга 29. Кроме того, сетчатка предлагает оптимальные условия для прямого, в естественных условиях визуализации и повторного мониторинга микроглии в их нетронутыми ЦНС нише всей старения, следующие острой травмы, ипотенциально во хронических нейродегенеративных заболеваний. Таким образом, недавние исследования доказали целесообразность изображений с высоким разрешением сетчатки микроглии, экспрессирующих GFP путем адаптации конфокальной лазерного сканирования офтальмоскопия (cSLO) к изображению живой CX3CR1 GFP / + мышей. Это был использован для отслеживания еженедельные изменения в GFP + клеток чисел в отдельных мышей в течение 10 недель после острой травмы или индуцированной глазной гипертензии 30-36.

Мы расширили этот подход для выполнения долгосрочного изображений в течение нескольких месяцев, и количественно отслеживать изменения в активации микроглии на основе размера сома с использованием анализа морфометрического. Размер сомный был определен в качестве полезного метрики активации микроглии в живых визуальных исследований с использованием двух-фотонной конфокальной микроскопии в корковых ломтиками выполнять в естественных изображений в CX3CR1-GFP + 9 микроглии. Эти и другие исследования также продемонстрировали корреляцию между размером сомный и уровни экспрессии белка Iba1, WHIch также увеличивается с 9,37 активации. Таким образом, активируется микроглии может быть идентифицирован в живых мышей, и их количество и распределение наблюдали в течение времени, в течение здоровья и болезни ЦНС.

Этот протокол описывает методы cSLO живой приобретения и анализа изображений для мониторинга количества клеток микроглии, распределение и морфологические активации во сетчатки ганглиозных клеток (РГК) дегенерации (рис 1). Таким образом, это исследование использует: 1) модель мыши наследственной глаукоме (DBA / 2J), который подвергается возрастной зависит зрительный нерв и сетчатку нейродегенерацию и показывает замечательную изменчивость прогрессирования заболевания между 5 и 10 месяцев 38,39, 2) в месяц cSLO в естественных изображений для долгосрочного визуализации GFP + клеток в сетчатке и зрительном нерве немиелинизированные гетерозиготных Cx3cr1 GFP / + DBA / 2J мышей в возрасте 3-5 месяцев, 3) в прямом эфире анализ изображений с помощью сегментации и порога, чтобы изолировать клетки somata и меруИК область. Эти стратегии применяются для оценки кинетики сетчатки микроглии состояниях активации на ранних стадиях хронического глаукомы.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В естественных изображений выполняется в свободных от патогенов объектов, использующих протоколы, утвержденные Комитетом по уходу и использованию животных Институциональная по крайней университета штата Юта.
Примечание: Этот протокол изображения используется для репортерных мышей, у которых сетчатки микроглии и проникают моноциты / макрофаги экспрессируют зеленый-флуоресцентный белок (GFP) под контролем фракталкин рецептора локуса (CX3CR1).

1. В естественных изображений сетчатки GFP + микроглии по конфокальной сканирующей лазерной офтальмоскопии (cSLO)

  1. Включите в воде контролируется системой отопления, установленного для стабилизации температуры между 35-37 мыши ºC во время процедуры, и соединить два грелки.
    1. Начните конфокальной сканирующей лазерной офтальмоскоп (cSLO) системы (рис 2А). Откройте программу cSLO, введите информацию, которая будет идентифицировать отдельные мышь, и установили кривизну роговицы 2 мм (для пациентов меню данных).
  2. Подготовка к IMAGing. Надежно закрепите чистую 55º широко поле объектива на гнезда. Подготовьте платформу изображений офтальмоскоп, обеспечивая грелку, покрытую чистой бумаги. Используйте зажимы, чтобы сгладить площадку и бумагу и держать их от блокирования движения объектива.
  3. Обезболить мышь посредством внутрибрюшинной инъекции 1,3% 2,2,2-tribromoethanol и 0,8% трет-амиловый спирт (250 мг / кг массы тела; 0,5 мл / 25 г веса тела) с помощью 30½ G иглу, установленной на 1 мл одноразовые шприц. Вернуться мыши клетку, держали над грелку.
    ПРИМЕЧАНИЕ: доставка анестетика путем инъекции против ингаляции позволяет легче позиционирование мыши для визуализации и беспрепятственного доступа к глазам, свободной от головных частей и трубопроводов.
  4. После того, как животное перестает двигаться и не отвечает на хвост крайнем случае, вызывают расширение зрачков с Tropicamide и фенилэфрин (0,5% каждый), путем размещения животное, подверженных и покрытия оба глаза с каплями для 7 мин.
  5. После 5 мин, ркружево мыши склонны в центре офтальмоскоп платформы, и подходят контактные линзы на обоих глазах, применяя минимальное давление.
    Примечание: Контактные линзы маленьким и хрупким, но может быть тщательно обработаны с пальцами, хотя щипцы могут быть использованы вместо 40. Использование контактных линз является обязательным, но рекомендуется, поскольку это сводит к минимуму глаз сухость и сохраняет прозрачность роговицы во время съемки.
  6. После 7 мин, ориентируют мышь с правым глазом, обращенной объектива и орбита параллельно объектива, сохраняя животное безудержного вблизи края платформы (фиг.2В). Собирать изображения сопоставимого насыщения и ориентации, постоянно поддерживать расстояние от глаза до линзы объектива, а также выравнивание глаза на пути света в течение сессий визуализации. Клип длинные усы, мешающие наблюдению глаза.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для следующего 8-10 мин, мышь не будет двигаться или мигают, и будет дыхание с нежным ходуные, которые отслеживаются в cSLO глаз слежения АРТ (автоматическое в режиме реального времени) режиме, который регулирует положение головы сканирования на основе фундус ориентиров с высокой контрастностью. Прошлое это время, мыши начинают задыхаясь и моргая, делая изображения непрактично.
  7. Если изображения выполняется без использования контактных линз, применяются PBS капли в оба глаза через каждые 2-3 мин, чтобы предотвратить их от высыхания.
  8. Сбор изображение глазного дна сетчатки сосудистой и диска зрительного нерва, ориентированных на внутренний сетчатки.
    1. Выберите инфракрасный режим (IR) и настроить параметры до 820 нм возбуждение, 100% мощности лазера, 40-60% чувствительностью (рис 2С).
    2. Работа в высокоскоростной режим (12,6 кадр / сек), найдите глаз с помощью джойстика управлять офтальмоскоп. В малом увеличении, осматривать роговица и хрусталик за травмы или непрозрачности, и исключить из исследования глаза с дефектами или повреждения, которые будут влиять визуализации сетчатки (рис 3а).
    3. Найдите площадь оптического диска (поверхностьзрительного нерва, ONH) путем цели ближе к глазу, то центр изображения на нем и зафиксировать это положение, поворачивая джойстик. Это выравнивание глаза на офтальмоскоп является ключевым, чтобы получить даже сосредоточиться и выбросов по изображению.
    4. Визуализация внутренние плоскости сетчатки, а также ДЗН, используя основные кровеносные сосуды, расположенные на витреальной поверхности сетчатки в фокальной плоскости отсчета (59 и 60), D или более глубокой (55 г) в глазах, показывающие оптические отвала диски. Оптимальная внимание должно решить циркулирующих клеток крови в крупных кровеносных сосудов, с их просвета и стенок четко различающихся.
    5. Оптимизация насыщенность изображения посредством регулировки диск на панели управления с сенсорным экраном, пока белый ореол равномерного освещения не охватывает в большинстве области 55º дна вокруг диска зрительного нерва (используя небольшое передержки). Далее, снизить насыщенность для оптимизации контрастности до клетки крови, движущиеся вдоль магистральных сосудов не может быть четко решены. Если фокусное темнотеучастки сохраняются, не из-за повреждения сетчатки, не перестроить глаза на камеру, пока равномерно яркое изображение получается. Эта настройка является основой для захвата воспроизводимых наборов изображений в положении и качества.
    6. Сбор ИК изображение высокого разрешения центрального сетчатки (1.4-1.7 мм в диаметре, в зависимости от возраста), в среднем 30 кадров в режиме реального времени (4,7 кадров / сек; нормализуется), чтобы улучшить отношение сигнал-шум (рис 2D ).
  9. Сразу же, приобретают флуоресценции изображение GFP + микроглии и / или инфильтрацией моноцитов локализованных на внутренних плоскостях сетчатки и ДЗН.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Оптимизация дна ИК-изображении сетчатки определяет разрешение флуоресценции GFP изображения + клеток, а также степень внутренней сетчатки, натянутый. Неспособность сосредоточиться внутренние плоскости сетчатки, которые могут быть обнаружены с низким разрешением сосудистой, приведет к приглушенным GFP + клеток видом (фигура 3В). Несоблюдение настроить ИК SatuРацион правильно и равномерно влияет на имидж флуоресценции (FA), представляя артефактом изменения в GFP + клеток интенсивности и размера (рис 3C).
    1. Swich флуоресценции режим формирования (FA) на сенсорной панели экрана, используя синий, 488 нм лазерного возбуждения (460-490 нм барьер набор фильтров), и настройки на приобретение (100% мощности лазера и 100-125% чувствительности), которые удерживаются постоянным для всех мышей (рис 2E).
    2. Соберите один XY-точки, двумерный флуоресценции изображение сетчатки, и сразу же захватить изображение глазного дна при одинаковой позиции (100x средней сканирования; 55º угол сканирования для обоих изображений; Рисунок 2F).
    3. Захват многоточечной изображение, выбрав "композитный" в панели управления (рис 2G) и перемещение офтальмоскоп направо и налево, панорамирование сетчатку через носовой-временной оси (рис 2H).
      Примечание: После сканирования одного ху-точечное изображение (100x сможет составить в среднем), программное обеспечение автоматически сканирует новые средние одних и тех же и новые районы (очерченными с зеленым кругом во оптимального сканирования, или красным, когда сканирование невозможным), и стежки все XY-позиции в режиме реального времени. Полученный композит изображение охватывает 1,5-1,7 мм по горизонтальной оси х 3-4 мм в вертикальной оси (55º х 120-124º угол сканирования).
  10. Полное визуализации каждой мыши в течение 15 мин после индукции анестезии, перед тем мигать и возобновляется движение.
  11. Снять контактные линзы, гидрат глаза PBS и вернуть животное его подогретой клетке, не проверяя поведение до полного восстановления подвижности.
  12. Для продольных исследований с использованием прерывистый сессий cSLO-изображений в том же отдельной мыши, повторите изображений не менее 3 дней друг от друга, чтобы избежать кумулятивного токсичности анестезии, а также роговицы раздражение.

2. Живая Обработка изображений и анализ

  1. Последовательное выравнивание изображения:
    1. Выровнятьфундус изображения для временного ряда того же глаза, используя сосудистую и оптический диск в качестве ориентиров. Откройте все изображения в коммерческой программе слайд-шоу презентации, перетаскивая каждое изображение на предыдущей, пока их оптические диски не присоединяются на ху плоскости (верхнее изображение появляется полупрозрачный, а тащат), затем поверните верхнее изображение до его крупных кровеносных сосудов совпадают с сосудистой на изображении ниже (фокус на судах дальнего от диска зрительного нерва). Запишите угол поворота для каждого изображения и сохранить этот временной ряд для дальнейшего использования, отслеживание мыши и глаз идентичности.
    2. Выравнивание соответствующую серию отдельных флуоресцентных изображений ху-точечных применением записанного угол, чтобы исправить вращени ХУ в каждый момент времени, используя программу растрового графического редактора. Кроме того, настроить разрешение до 300 точек на дюйм (без изменения масштаба) и фона (в режиме RGB, выберите Levels и попробовать просвет кровеносного сосуда как черный). Сохраните эти изображенияа TIF файлов, добавление "выровнены" с их именами.
  2. Микроглии сегментации клеток:
    1. Чтобы определить GFP + клеток в центральной сетчатки, открытый в FluoRender "Выровнять" TIF файл, соответствующий первой точке времени / возраста. Увеличить изображение, чтобы соответствовать экран, а затем определить Render, вид (композитный, ортогональной, с интерполяцией) и его свойства (0.58 гамма, 255 точки насыщения, 255 яркости, 195 альфа и 1,00 затенения), выделив оба РГ каналы как видно (скрыть В канал, дважды щелкнув его в рабочей области кадра; 4А).
    2. Для выбора отдельных клеток, пороговые красный канал (должен быть выделен в рабочей области кадра), за счет увеличения низкий порог до большинство клеток не маскируются (белый) с минимальным перекрытием и клеточных процессов (Cyan), сохраняя при этом высокий порог постоянной (255). Низкое пороговое значение варьируется между 100 и 170, в зависимости от интенсивности флуоресценции (фиг.4В </ STRONG>).
    3. Сохранить вид с красного канала видимого только (команда Захват) в качестве нового файла TIF, добавив, "cellsegm" его первоначальное название (рис 4C). Использование общего растрового графического редактора программного обеспечения, инвертировать его в оттенках серого и настроить разрешение 300 точек на дюйм, как указано выше, и сохранить снова, как RGB (рис 4D).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Удалить папки (проектов) автоматически созданные FluoRender, и сохранить применяется порог для использования в будущем.
  3. Микроглии сегментация сома и морфометрия:
    1. Чтобы определить GFP + клеток somata для области количественного использовать программное обеспечение анализа изображений с результатами измерений автоматизированных интенсивности и пороговых возможностей, а также подсчета объектов на основе порогового и измерения. Откройте "cellsegm" TIF файл, и выбрать способ изменения размера (сплайн) и красный канал (нажмите красную вкладку в RGB). Улучшение визуализации, сняв "вид канала в цвете" (щелкните правой кнопкой мыши красный RGВкладка Б), и выбрав "дополнить цвета" (Изображение / Настройка изображения), чтобы инвертировать оттенков серого и увидеть клетки в серый / черный на белом фоне (рис 4E).
    2. Калибровка изображения в 1,4-1,7 мм в зависимости от возраста, рисуя горизонтальную линию по всей изображения (Calibration, Быстрая калибровка).
    3. Сегмент somata отдельная клетка с применением интенсивности порога (рис 4б). Для этого, работа по красному каналу RGB и откройте функцию Порог интенсивности (Объект графа, выбор команды "Обновить" количество) для того, чтобы отслеживать двумерных параметров для каждого пороговой области процентной (ROI), представляющий индивидуальный somata.
    4. Определить порог интенсивности в гистограмме интенсивности, выбрав самый низкий 50-60% 255 уровней и уточнение окончательного пороговое значение визуально оценить перекрытие между порог цвета маски (синий) и клеток сомы периметру (серый) в отдельные клетки (Figure 4E).
    5. Оценить точность клеток сомы масок представлять сомный размеры путем измерения площади до и после сегментации в 10 клеток и принять выбранный пороговый диапазон, если измерения отличаются менее чем на 10% (использовать бинарный Toolbar и Аннотированные измерения).
    6. Вручную определить сомный трансформирования, включающие несколько ячеек и отдельных эти элементы (ликвидации или отдельные трансформирования с помощью элементов управления двоичных панели инструментов или каталога объектов), а переключение / выключение двоичного непосредственно визуализировать клетки (рис 4F).
    7. Оцените микроглии клетки как трансформирования с сомный области больше и меньше, чем 50-60 мкм 2 различать клеток somata соответствующее активированного микроглии и отключается микроглии соответственно, с помощью Area ограничение.
      Примечание: Каждая ячейка сомный подмножество идентифицируется с другим псевдоцветной двоичной слоя, и может быть дополнительно охарактеризованы в других морфологических параметров (perimeтер, округлость и т.п.), а также количественно в дискретных сетчатки секторов (рис 4G). Сохранить анализируемое изображение в виде файла ND2.
    8. Проверьте процесс и разветвления сложности в отдельных активированных клеток микроглии, путем наложения маски сомный и один ху точечное изображение (контраст увеличился на 50%, рис 4H). Вручную рассчитывать процессы непосредственно идущие от клеточной сомы или измерить диаметр многоугольника, охватывающей беседку (использовать бинарный Toolbar и Аннотированные измерения).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Активированный клетки лишены процессы или нести мало (<4) и короткие (<2x диаметр сомный) те, в отличие от процессов неактивированных клеток, которые содержат разветвленную и обширную беседку (> 3-10х Диаметр сомный), окружающих их относительно небольшой сома.
    9. Вручную идентификации клеток с somata меньше, чем <20 мкм 2 и / или GFP выражения ниже предела обнаружения, которые, следовательно, обнаруженного винтенсивность порога. Используйте команду таксономии в аннотации рассчитывать выявленных вручную элементов.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Наши последнее в естественных условиях исследования использовали эти живые приобретение и анализа изображений методы визуализации и отслеживать кинетики и закономерности ДЗН и сетчатки микроглии изменений на ранних стадиях хронического глаукомы и их отношения до конца нейродегенерацией 59. Здесь мы проиллюстрируем протокол получения изображений cSLO визуализировать микроглии клетки по большой площади центральной сетчатки в отдельных молодых гетерозиготных Cx3CR1-GFP DBA / 2J сетчатки (рис 5)....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Живой мониторинг числа клеток микроглии и морфологической активации во время нейродегенеративных заболеваний требует использования неинвазивных методов визуализации, которые позволяют подробную визуализацию функций клеток. После обработки изображений, клетки микроглии должны быть изолированы (сегментирован) для морфометрического анализа путем использования нескольких пороговых шагов, чтобы оценить размер сомный и / или сложность процесса как для считывания микроглии активации. В этом протоколе мы описываем методы получе...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы благодарим Научный институт вычислительной техники и визуализации Университета штата Юта за использование программного обеспечения FluoRender (R01GM09815). Эта работа была поддержана грантами от Фонда исследования глаукомы, Фонда Мелсы М. и Фрэнка Теодора Барр и Национального института здравоохранения США, (R01EY020878 и R01EY023621) M.L.V. и (R01EY017182 и R01EY017950) B.K.A.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Мыши DBA/2J и CX3CR1-GFP/+Мыши Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME000671 и 00582разводятся в домашних условиях, вводя новых селекционеров каждые 3 - 4 поколения, чтобы предотвратить генетический дрейф.
30½ Игла G и 1 мл туберкулиновый шприц со скользящим наконечникомBD, East Rutherford, NJ305106 и 309659
2,2,2-триброметанол, трет-амиловый спирт 99% и фосфатный буфер в солевом раствореSigma-Aldrich, St. Louis, MOT48402, 152463 и P4417раствор авертина (pH 7,3, стерильный фильтрованный) должны быть свежеприготовленным раствором или храниться при температуре 4 °°; C на срок до 1 недели.
Термотерапия T/PumpGaymar Industries, Орчард Парк, Нью-ЙоркTP-650
Аппликаторы с хлопковыми наконечникамиFisher Scientific, Питтсбург, Пенсильвания23-400-100
Тропикамид 1%Bausch & Lomb, Рочестер, Нью-ЙоркNDC 24208-585-64
Контактные линзы из ПММА, кривизна основания 1,70, общий диаметр 3,2 мм, толщина центра 0,40 ммCantor & Nissel Ltd., Нортгемптоншир, ВеликобританияG003709Линзы ополаскивают стерильным PBS и хранят в полипропиленовых коробках.
Конфокальный сканирующий лазерный офтальмоскоп HRA/Spectralis и программное обеспечение Eye ExplorerHeidelberg Engineering GmbH, Карлсбад, КалифорнияВерсия 1.7.1.0
PowerPointMicrosoft, Редмонд, ВашингтонВерсия 14.4.3
Adobe PhotoshopAdobe, Сан-Хосе, КалифорнияВерсия CS3
FluoRenderScientific Computing and Imaging Institute, Университет штата ЮтаВерсия 2.13Бесплатное программное обеспечение. http://www.sci.utah.edu/software/13-software/127-fluorender.html
NIS-Elements CNikon, Мелвилл, Нью-ЙоркВерсия 4.30.01

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hanisch, U. K. Functional diversity of microglia - how heterogeneous are they to begin with. Front. Cell. Neurosci. 7 (65), 1-18 (2013).
  2. Kettenmann, H., Hanisch, U. K., Noda, M., Verkhratsky, A. Physiology of microglia. Physiol. Rev. 91 (2), 461-553 (2011).
  3. Davalos, D., et al. ATP mediates rapid microglial response to local brain injury in vivo. Nat. Neurosci. 8 (6), 752-758 (2005).
  4. Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Helmchen, F. Resting microglial cells are highly dynamic surveillants of brain parenchyma in vivo. Science. 308 (5726), 1314-1318 (2005).
  5. Ransohoff, R. M., Perry, V. H. Microglial physiology: unique stimuli, specialized responses. Annu. Rev. Immunol. 27, 119-145 (2009).
  6. Stence, N., Waite, M., Dailey, M. E. Dynamics of microglial activation: a confocal time-lapse analysis in hippocampal slices. Glia. 33 (3), 256-266 (2001).
  7. Streit, W. J., Walter, S. A., Pennell, N. A. Reactive microgliosis. Prog. Neurobiol. 57 (6), 563-581 (1999).
  8. Jonas, R. A., et al. The spider effect: morphological and orienting classification of microglia in response to stimuli in vivo. PloS One. 7 (2), e30763(2012).
  9. Kozlowski, C., Weimer, R. M. An automated method to quantify microglia morphology and application to monitor activation state longitudinally in vivo. PloS One. 7 (2), 1-9 (2012).
  10. Ajami, B., Bennett, J. L., Krieger, C., Tetzlaff, W., Rossi, F. M. Local self-renewal can sustain CNS microglia maintenance and function throughout adult life. Nat. Neurosci. 10 (12), 1538-1543 (2007).
  11. Elmore, M. R., et al. Colony-stimulating factor 1 receptor signaling is necessary for microglia viability, unmasking a microglia progenitor cell in the adult brain. Neuron. 82 (2), 380-397 (2014).
  12. Lawson, L. J., Perry, V. H., Dri, P., Gordon, S. Heterogeneity in the distribution and morphology of microglia in the normal adult mouse brain. Neuroscience. 39 (1), 151-170 (1990).
  13. Ransohoff, R. M., Cardona, A. E. The myeloid cells of the central nervous system parenchyma. Nature. 468, 253-262 (2010).
  14. Solomon, J. N., et al. Origin and distribution of bone marrow-derived cells in the central nervous system in a mouse model of amyotrophic lateral sclerosis. Glia. 53, 744-753 (2006).
  15. Ajami, B., Bennett, J. L., Krieger, C., McNagny, K. M., Rossi, F. M. Infiltrating monocytes trigger EAE progression, but do not contribute to the resident microglia pool. Nat. Neurosc. 14 (9), 1142-1149 (2011).
  16. Sapp, E., et al. Early and progressive accumulation of reactive microglia in the Huntington disease brain. J. Neuropathol. Exp. Neurol. 60 (2), 161-172 (2001).
  17. Maeda, J., et al. In vivo positron emission tomographic imaging of glial responses to amyloid-beta and tau pathologies in mouse models of Alzheimer's disease and related disorders. J. Neurosc. 31 (12), 4720-4730 (2011).
  18. Jacobs, A. H., Tavitian, B. Noninvasive molecular imaging of neuroinflammation. J. Cereb. Blood Flow Metab. 32 (7), 1393-1415 (2012).
  19. Ouchi, Y., et al. Microglial activation and dopamine terminal loss in early Parkinson's disease. Ann. Neurol. 57 (2), 168-175 (2005).
  20. Fuhrmann, M., et al. Microglial Cx3cr1 knockout prevents neuron loss in a mouse model of Alzheimer's disease. Nat. Neurosci. 13 (4), 411-413 (2010).
  21. Trapani, A., Palazzo, C., de Candia, M., Lasorsa, F. M., Trapani, G. Targeting of the translocator protein 18 kDa (TSPO): a valuable approach for nuclear and optical imaging of activated microglia. Bioconjug. Chem. 24 (9), 1415-1428 (2013).
  22. Venneti, S., Lopresti, B. J., Wiley, C. A. Molecular imaging of microglia/macrophages in the brain. Glia. 61 (1), 10-23 (2013).
  23. Davalos, D., et al. Fibrinogen-induced perivascular microglial clustering is required for the development of axonal damage in neuroinflammation. Nat. Comm. 3 (1227), 1-15 (2012).
  24. Dibaj, P., et al. In Vivo imaging reveals distinct inflammatory activity of CNS microglia versus PNS macrophages in a mouse model for ALS. PloS One. 6 (3), e17910(2011).
  25. Evans, T. A., et al. High-resolution intravital imaging reveals that blood-derived macrophages but not resident microglia facilitate secondary axonal dieback in traumatic spinal cord injury. Exp. Neurol. 254 (214), 109-120 (2014).
  26. Nayak, D., Zinselmeyer, B. H., Corps, K. N., McGavern, D. B. In vivo dynamics of innate immune sentinels in the CNS. Intravital. 1 (2), 95-106 (2012).
  27. Tremblay, M. E., Lowery, R. L., Majewska, A. K. Microglial interactions with synapses are modulated by visual experience. PLoS Biol. 8 (11), 1-16 (2010).
  28. Wake, H., Moorhouse, A. J., Jinno, S., Kohsaka, S., Nabekura, J. Resting microglia directly monitor the functional state of synapses in vivo and determine the fate of ischemic terminals. J. Neurosci. 29 (13), 3974-3980 (2009).
  29. Marker, D. F., Tremblay, M. E., Lu, S. M., Majewska, A. K., Gelbard, H. A. A thin-skull window technique for chronic two-photon in vivo imaging of murine microglia in models of neuroinflammation. J. Vis. Exp. 19 (43), (2010).
  30. Alt, C., Runnels, J. M., L, T. G. S., P, L. C. In vivo tracking of hematopoietic cells in the retina of chimeric mice with a scanning laser ophthalmoscope. Intravital. 1 (2), 132-140 (2012).
  31. Eter, N., et al. In vivo visualization of dendritic cells, macrophages, and microglial cells responding to laser-induced damage in the fundus of the eye. Invest. Ophthalmol., & Vis. Sci. 49 (8), 3649-3658 (2008).
  32. Liu, S., et al. Tracking retinal microgliosis in models of retinal ganglion cell damage. Investigative ophthalmology & visual science. 53, 6254-6262 (2012).
  33. Maeda, A., et al. Two-photon microscopy reveals early rod photoreceptor cell damage in light-exposed mutant mice. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 111 (14), E1428-E1437 (2014).
  34. Paques, M., et al. High resolution fundus imaging by confocal scanning laser ophthalmoscopy in the mouse. Vision Res. 46 (8-9), 1336-1345 (2006).
  35. Seeliger, M. W., et al. In vivo confocal imaging of the retina in animal models using scanning laser ophthalmoscopy. Vision Res. 45 (28), 3512-3519 (2005).
  36. Alt, C., Runnels, J. M., Mortensen, L. J., Zaher, W., Lin, C. P. In vivo imaging of microglia turnover in the mouse retina after ionizing radiation and dexamethasone treatment. Invest. Ophthalmol., & Vis. Sci. 55 (8), 5314-5319 (2014).
  37. Bosco, A., et al. Reduced retina microglial activation and improved optic nerve integrity with minocycline treatment in the DBA/2J mouse model of glaucoma. Invest. Ophthalmol., & Vis. Sci. 49 (4), 1437-1446 (2008).
  38. Anderson, M. G., et al. Mutations in genes encoding melanosomal proteins cause pigmentary glaucoma in DBA/2J mice. Nat. Genet. 30 (1), 81-85 (2002).
  39. Chang, B., et al. Interacting loci cause severe iris atrophy and glaucoma in DBA/2J mice. Nat. Genet. 21 (4), 405-409 (1999).
  40. Smith, R. S., Korb, D., John, S. W. A goniolens for clinical monitoring of the mouse iridocorneal angle and optic nerve. Mol. Vis. 8, 26-31 (2002).
  41. Buckingham, B. P., et al. Progressive ganglion cell degeneration precedes neuronal loss in a mouse model of glaucoma. J. Neurosci. 28 (11), 2735-2744 (2008).
  42. Howell, G. R., et al. Axons of retinal ganglion cells are insulted in the optic nerve early in DBA/2J glaucoma. J. Cell Biol. 179 (7), 1523-1537 (2007).
  43. Jakobs, T. C., Libby, R. T., Ben, Y., John, S. W., Masland, R. H. Retinal ganglion cell degeneration is topological but not cell type specific in DBA/2J mice. J. Cell Biol. 171 (2), 313-325 (2005).
  44. Soto, I., et al. Retinal ganglion cells downregulate gene expression and lose their axons within the optic nerve head in a mouse glaucoma model. J. Neurosci. 28 (2), 548-561 (2008).
  45. Bosco, A., Steele, M. R., Vetter, M. L. Early microglia activation in a mouse model of chronic glaucoma. J. Comp. Neurol. 519 (4), 599-620 (2011).
  46. Jung, S., et al. Analysis of fractalkine receptor CX(3)CR1 function by targeted deletion and green fluorescent protein reporter gene insertion. Mol. Cell. Biol. 20 (11), 4106-4114 (2000).
  47. Broux, B., et al. CX(3)CR1 drives cytotoxic CD4(+)CD28(-) T cells into the brain of multiple sclerosis patients. J. Autoimmun. 38 (1), 10-19 (2012).
  48. Paques, M., et al. In vivo observation of the locomotion of microglial cells in the retina. Glia. 58 (14), 1663-1668 (2010).
  49. Charbel Issa, P., et al. Optimization of in vivo confocal autofluorescence imaging of the ocular fundus in mice and its application to models of human retinal degeneration. Invest. Ophthalmol., & Vis. Sci. 53 (2), 1066-1075 (2012).
  50. Beynon, S. B., Walker, F. R. Microglial activation in the injured and healthy brain: what are we really talking about? Practical and theoretical issues associated with the measurement of changes in microglial morphology. Neuroscience. 225 (2012), 162-171 (2012).
  51. Chan, J. W. Recent advances in optic neuritis related to multiple sclerosis. Acta Ophthalmol. 90 (3), 203-209 (2012).
  52. Frost, S., Martins, R. N., Kanagasingam, Y. Ocular biomarkers for early detection of Alzheimer's disease. J. Alzheimer's Dis. 22 (1), 1-16 (2010).
  53. Guo, L., Duggan, J., Cordeiro, M. F. Alzheimer's disease and retinal neurodegeneration. Curr. Alzheimer Res. 7 (1), 3-14 (2010).
  54. Ikram, M. K., Cheung, C. Y., Wong, T. Y., Chen, C. P. Retinal pathology as biomarker for cognitive impairment and Alzheimer's disease. J. Neurol. Neurosurg. Psychiatry. 83 (9), 917-922 (2012).
  55. Kersten, H. M., Roxburgh, R. H., Danesh-Meyer, H. V. Ophthalmic manifestations of inherited neurodegenerative disorders. Nat. Rev. Neurol. 10 (6), 349-362 (2014).
  56. Kesler, A., Vakhapova, V., Korczyn, A. D., Naftaliev, E., Neudorfer, M. Retinal thickness in patients with mild cognitive impairment and Alzheimer's disease. Clin. Neurol. Neurosurg. 113 (7), 523-526 (2011).
  57. Petzold, A., et al. Optical coherence tomography in multiple sclerosis: a systematic review and meta-analysis. Lancet Neurol. 9 (9), 921-932 (2010).
  58. Satue, M., et al. Retinal thinning and correlation with functional disability in patients with Parkinson's disease. Br. J. Ophthalmol. 98 (3), 350-355 (2014).
  59. Bosco, A., Romero, C. O., Breen, K. T., Chagovetz, A. A., Steele, M. R., Ambati, B. K., Vetter, M. L. Neurodegeneration severity can be predicted from early microglia alterations monitored in vivo in a mouse model of chronic glaucoma. Dis Model Mech. , (2015).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

CX3CR1 GFPin vivo

Похожие статьи