Активация микроглии и microgliosis являются ключевыми ответы на хронической нейродегенерации. Здесь мы представляем методы для в естественных условиях долгосрочного визуализации сетчатки CX3CR1-GFP + клеток микроглии по конфокальной офтальмоскопии, и порог и морфометрических анализ для выявления и количественной оценки их активации. Мы следим за микроглии изменения на ранних стадиях возрастного глаукомы.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
В Vivo Динамика сетчатки микроглии активации во нейродегенерации: конфокальной офтальмоскопической изображений и клеточной морфометрии в мышь Глаукома
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Микроглия, которые нейроиммунных клетки ЦНС резидентов, превратить их морфологию и размер в ответ на поражения ЦНС, переход на активированном состоянии с различными функциями и профилей экспрессии генов. Роли активации микроглии в области здравоохранения, травмы и заболевания остаются не полностью понял из-за их динамической и сложной регуляции в ответ на изменения в их микросреды. Таким образом, очень важно, чтобы неинвазивно отслеживать и анализировать изменения в микроглии активации в течение долгого времени в здоровом организме. В естественных условиях исследования активации микроглии были задержаны по технических ограничений, отслеживания микроглии поведения без изменения окружающей среды ЦНС. Это было особенно сложным при хронической нейродегенерации, где долгосрочные изменения должны быть отслежены. Сетчатка, орган ЦНС поддается неинвазивной визуализации живого, предлагает мощную систему визуализации и характеризуют динамику активации микроглии во хронических заболеваний.
в естественных сетчатки микроглии, с помощью конфокальной офтальмоскопии (cSLO) и CX3CR1 GFP / + мышей репортер, чтобы визуализировать микроглии с сотовой резолюции. Кроме того, мы опишем методы для количественной оценки ежемесячные изменения в активации клеток и плотности в больших клеток подмножеств (200-300 клеток на сетчатке). Мы подтверждаем использование сомный области в качестве полезного метрики для живого отслеживания активации микроглии в сетчатке с применением автоматизированной порог на основе морфометрического анализа изображений в естественных условиях. Мы используем эти живые приобретение изображения и анализирует стратегии для мониторинга динамических изменений в микроглии активации и microgliosis на ранних стадиях сетчатки нейродегенерацией в мышиной модели хронического глаукомы. Этот подход должен быть полезно исследовать вклад микроглии в нейронной и аксонов снижение хронических расстройств ЦНС, которые влияют на сетчатку и зрительный нерв.
Введение
Микроглия являются нейроиммунных клетки, которые исключительно проживают в центральной нервной системе (ЦНС), так как в начале эмбрионального развития и на протяжении взрослой жизни. Оснащен комплексной репертуара рецепторов, микроглии активность и гетерогенности регулируются их двунаправленного взаимодействия с соседними нейронами, глии, гематоэнцефалический барьер и проникающих нейровоспалительных клетки 1,2. Базальные микроглии функции способствуют физиологической технического обслуживания и ремонта, а они пробуют их территорию для возмущений гомеостаза 3,4. Во время травмы или болезни ЦНС, микроглии являются первыми отвечают на нейронных сиг....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
В естественных изображений выполняется в свободных от патогенов объектов, использующих протоколы, утвержденные Комитетом по уходу и использованию животных Институциональная по крайней университета штата Юта.
Примечание: Этот протокол изображения используется для репортерных мышей, у которых сетчатки микроглии и проникают моноциты / макрофаги экспрессируют зеленый-флуоресцентный белок (GFP) под контролем фракталкин рецептора локуса (CX3CR1).
1. В естественных изображений сетчатки GFP + микроглии по конфокальной сканирующей лазерной офтальмоскопии (cSLO)
- Включите в воде контролируется системой отопления, ....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Наши последнее в естественных условиях исследования использовали эти живые приобретение и анализа изображений методы визуализации и отслеживать кинетики и закономерности ДЗН и сетчатки микроглии изменений на ранних стадиях хронического глаукомы и их отношения до конца нейродегенерацией 59. Здесь мы проиллюстрируем протокол получения изображений cSLO визуализировать микроглии клетки по большой площади центральной сетчатки в отдельных молодых гетерозиготных Cx3CR1-GFP DBA / 2J сетчатки (рис 5)........
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Живой мониторинг числа клеток микроглии и морфологической активации во время нейродегенеративных заболеваний требует использования неинвазивных методов визуализации, которые позволяют подробную визуализацию функций клеток. После обработки изображений, клетки микроглии должны быть изолированы (сегментирован) для морфометрического анализа путем использования нескольких пороговых шагов, чтобы оценить размер сомный и / или сложность процесса как для считывания микроглии активации. В этом протоколе мы описываем методы получе.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторам нечего раскрывать.
Благодарности
Мы благодарим Научный институт вычислительной техники и визуализации Университета штата Юта за использование программного обеспечения FluoRender (R01GM09815). Эта работа была поддержана грантами от Фонда исследования глаукомы, Фонда Мелсы М. и Фрэнка Теодора Барр и Национального института здравоохранения США, (R01EY020878 и R01EY023621) M.L.V. и (R01EY017182 и R01EY017950) B.K.A.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Мыши DBA/2J и CX3CR1-GFP/+ | Мыши Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME | 000671 и 00582 | разводятся в домашних условиях, вводя новых селекционеров каждые 3 - 4 поколения, чтобы предотвратить генетический дрейф. |
| 30½ Игла G и 1 мл туберкулиновый шприц со скользящим наконечником | BD, East Rutherford, NJ | 305106 и 309659 | |
| 2,2,2-триброметанол, трет-амиловый спирт 99% и фосфатный буфер в солевом растворе | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | T48402, 152463 и P4417 | раствор авертина (pH 7,3, стерильный фильтрованный) должны быть свежеприготовленным раствором или храниться при температуре 4 °°; C на срок до 1 недели. |
| Термотерапия T/Pump | Gaymar Industries, Орчард Парк, Нью-Йорк | TP-650 | |
| Аппликаторы с хлопковыми наконечниками | Fisher Scientific, Питтсбург, Пенсильвания | 23-400-100 | |
| Тропикамид 1% | Bausch & Lomb, Рочестер, Нью-Йорк | NDC 24208-585-64 | |
| Контактные линзы из ПММА, кривизна основания 1,70, общий диаметр 3,2 мм, толщина центра 0,40 мм | Cantor & Nissel Ltd., Нортгемптоншир, Великобритания | G003709 | Линзы ополаскивают стерильным PBS и хранят в полипропиленовых коробках. |
| Конфокальный сканирующий лазерный офтальмоскоп HRA/Spectralis и программное обеспечение Eye Explorer | Heidelberg Engineering GmbH, Карлсбад, Калифорния | Версия 1.7.1.0 | |
| PowerPoint | Microsoft, Редмонд, Вашингтон | Версия 14.4.3 | |
| Adobe Photoshop | Adobe, Сан-Хосе, Калифорния | Версия CS3 | |
| FluoRender | Scientific Computing and Imaging Institute, Университет штата Юта | Версия 2.13 | Бесплатное программное обеспечение. http://www.sci.utah.edu/software/13-software/127-fluorender.html |
| NIS-Elements C | Nikon, Мелвилл, Нью-Йорк | Версия 4.30.01 |
Ссылки
- Hanisch, U. K. Functional diversity of microglia - how heterogeneous are they to begin with. Front. Cell. Neurosci. 7 (65), 1-18 (2013).
- Kettenmann, H., Hanisch, U. K., Noda, M., Verkhratsky, A. Physiology of microglia. Physiol. Rev. 91 (2), 461-553 (2011).
- Davalos, D., et al.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
