Методическая статья

Выделение стволовых нервных / клеток-предшественников из Перивентрикулярные региона взрослых крыс и человека спинного мозга

DOI:

10.3791/52732

⸱

14 мая 2015 г.

 , 
1Division of Genetics and Development, Toronto Western Research Institute and Krembil Neuroscience Center, 2Department of Surgery, Division of Neurosurgery, Toronto Western Hospital and University of Toronto

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Спинной мозг взрослого млекопитающего содержит нейральные стволовые/прогениторные клетки (NSPC), которые могут быть выделены и расширены в культуре. В этом протоколе описывается забор, выделение, культивирование и пассирование NSPC, полученных из перивентрикулярной области спинного мозга взрослого человека от крысы и от доноров органов для трансплантации человека.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Взрослой крысы и человека спинного мозга нервные клетки стволовые / предшественники (NSPCs), культивируемые в фактор роста обогащенного среды позволяет распространением мультипотентных, самообновлению, и расширяемые нервные стволовые клетки. В сыворотке крови условий, эти мультипотентные NSPCs будет отличать, генерировать нейроны, астроциты, олигодендроциты и. Собирают ткань ферментативно диссоциируют в растворе папаина-ЭДТА, а затем механически диссоциируют и отделены через градиент плотности прерывистой с образованием суспензии отдельных клеток, которые высевают в Neurobasal среде с добавлением фактора роста эпидермиса (EGF), основной фактор роста фибробластов (оФРФ ), и гепарин. Взрослых крыс спинного мозга NSPCs культивируют в свободном обращении нейросфер и взрослых спинного мозга человека NSPCs выращивают прикрепленных культур. В этих условиях, взрослые спинного мозга NSPCs пролиферируют, экспресс-маркеры клеток-предшественников, и может быть постоянно расширяется при прохождении. Эти клетки можно бе учился в пробирке в ответ на различные стимулы, и экзогенные факторы могут быть использованы для содействия ограничение клонов изучить нейронную дифференциацию стволовых клеток. МУЛЬТИПОТЕНТНЫХ NSPCs или их потомство также могут быть пересажены в различных животных моделях для оценки восстановительный ремонт.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

NSPCs мультипотентны клетки, совершенные в нервной линии, что может самостоятельно возобновить и расширить легко в пробирке. Мы называем эти клетки в виде смешанного населения нейронных стволовых клеток / клеток-предшественников, поскольку они отображают свойства самообновляющихся мультипотентными стволовых клеток и клеток-предшественников более ограниченных. NSPCs найдены как в плода и взрослого головного и спинного мозга 1,2. У взрослого, как правило, NSPCs покоя и находиться в пределах конкретных ниш в том числе субвентрикулярной зоны накладки боковых желудочков 2-4 и перивентрикулярном области, окружающей центральный канал спинного мозга 5,6.

Как правило, NSPCs культивируют в свободно плавающих нейросферах или в адгезивных монослоев в бессывороточной среде с добавлением EGF и оФРФ, митогены, которые отбирают для клеточных популяций стволовых / клеток-предшественников. Нейросфера анализ первоначально разработан Рейнольдса и Вайса 2, наиболее часто используется для культуры ирасширить нервные стволовые клетки. NSPCs показать мультипотентность, когда они высевают в фактор-Free роста среде, содержащей сыворотку, дифференцируя в нейроны, астроциты и олигодендроциты,. Мультипотентных, самообновлению NSPCs могут быть выделены и культивированы с взрослого грызуна спинного мозга при культивировании тканей включает области центрального канала 6,7. Потенциальное преимущество в использовании NSPCs, полученные от взрослого спинного мозга, в отличие от генерации клеток из других областей, что эти ткане-специфические клетки наиболее близко клеток в спинном мозге, которые утрачены или повреждены после травмы или болезни.

Предыдущая работа показала, что нейросферы полученные от взрослого человека спинного мозга не может распространяться долгосрочные или пассировать генерировать достаточное количество клеток 8,9. Тем не менее, с изменениями в условиях культивирования, мы сообщили о расширении и трансплантации взрослых спинного мозга NSPCs полученных человека, демонстрируя, что самообновлениюи мультипотентные NSPCs может быть изолирован от взрослого человека спинного мозга трансплантации органов доноров 10. В первую очередь, удаление большей части белого вещества при вскрытии и культивирование этих клеток на клейкого субстрата фактора роста в обогащенной среде выбраны для пролиферирующих взрослых спинного мозга NSPCs человека. В этом протоколе мы опишем сбор спинного мозга от взрослых крыс и человека от трансплантации органов доноров, рассечения перивентрикулярном ткани и выделения, культуры и расширение NSPCs.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все процедуры на животных утверждаются Care комитета животных Сети здравоохранения университета, Торонто Канады, в соответствии с политикой, установленной в Руководстве по уходу и использованию лабораторных животных, подготовленных Канадского совета по уходу за животными. Для уборки ткани спинного мозга человека, утверждение было получено от Совета Сетевого университета медицинских исследований по этике и от Trillium-подарок Фонда жизни, который курирует донорства в Онтарио, Канада.

1. Подготовка вскрытия буферов и медиакультуры

  1. Для выделения из спинного мозга крысы, подготовить 100 мл рассечение буфера (1X PBS + 0,6% глюкозы + 2% пенициллина-стрептомицина) и в холодильник. Для спинного мозга человека подготовить 100 мл рассечение буфера (1x HBSS + 0,6% глюкоза + 2% пенициллина стрептомицин) и поставить в холодильник.
  2. Приготовьте 100 мл бессывороточной среды (SFM) и в тепле при 37 ° С. Для подготовки SFM, добавить 2 мМ L-глутамина, 100 мкг / мл пенициллина-стрептомицина, 2% B27, и 10% смесь гормон Neurobasal-средой. Чтобы приготовить смесь гормона, сделать 1: / F12 среду DMEM, содержащую 1% глюкозы 0,6, 3 мМ NaHCO 3, 5 мМ HEPES, 25 мкг / мл инсулина, 100 мкг / мл апо-трансферрина, 10 мкМ путресцина, 30 нМ селена, и 20 нМ прогестерона.
  3. Подготовьте роста ОМР фактор обогащенного осажденный носитель (с УЛП добавить 20 нг / мл EGF, 20 нг / мл оФРФ и 2 мкг / мл гепарина) и теплую при 37 ° С. Убедитесь, что человек ОМР содержит человеческий рекомбинантный фактор роста (см Таблицу материалов).

2. Сбор и Препарирование взрослых крыс Перивентрикулярные ткани спинного мозга

  1. Стерилизовать рассекает инструменты в этаноле и промыть в стерильном физиологическом растворе или в автоклаве инструментов заранее. Дайте крысу (6 - 8 недель) смертельная инъекция из фенобарбитала натрия (1 см на 65 мг / мл) или передозировки анестетика (например, 4% изофлуораном) в соответствии со своей института одобрил протокол животных. DУз спину крысы с 70% этанола и снимите кожу на поверхности спинного с большими ножницами рассечение.
  2. Проведение ножницы перпендикулярно к поверхности спинного поперек разрезать позвоночник выше задних конечностей. Используйте ножницы, чтобы меньше в продольном направлении сократить спинной мышцы вышележащих позвоночный столб в ростральной направлении, чтобы разоблачить остистые отростки.
  3. Начиная с открытой хвостового конца, вставьте кусачек или небольшой тупой кости режущего инструмента экстрадурально в латеральной части позвоночного канала в пространстве между спинного мозга и позвоночника. Сделайте небольшие порезы в пластинки (костные арки слева и справа от остистых отростков по бокам позвонков) и тщательно удаляйте пластинку, чтобы разоблачить спинного мозга (1А-D). Обеспечить угол лопастей мелкое и параллельно шнура так, основной спинной мозг не был поврежден.
  4. Продолжить ламинэктомию в ростральной направлении выставкахе грудной и шейного отдела спинного мозга.
  5. Аккуратно вырезать спинной мозг от позвоночного столба с тупыми щипцами ткани и использования microscissors тщательно разорвать корни, чтобы освободить кабель. Поместите вырезали спинного мозга в чашку Петри, содержащую 4 ° С стерильной крыс буфер рассечение (описанный выше в 1.1). Промойте ткань в свежеприготовленный 4 ° С рассекает буфера и с помощью ножниц вырезать спинной мозг в поперечном направлении в 1 см сегментов (рис 1E).
  6. Для каждого сегмента ткани, одной рукой держать ткань с тонким пинцетом. С другой стороны, использовать microscissors тщательно удалить вышележащие мозговые оболочки, белое вещество, и большинство из серого вещества с помощью рассекает области. Кроме того, использование тонких щипцов Дюмон (4 #), чтобы очистить от самых серого и белого вещества, оставляя только перивентрикулярные область спинного мозга, который включает эпендимы и небольшое количество окружающих серое вещество (рис 1F-H).
  7. Бассейн расчлененный перивентрикулярная ткани в 10 см стерильную чашку Петри, содержащую холодный крысиный буфер рассечение.

3. Заготовка и Препарирование взрослых человека Перивентрикулярные ткани спинного мозга

Примечание: Human ткани спинного мозга собирают из взрослых трансплантации органов доноров (доноры были в возрасте от 2 до 60 лет), после другие органы были удалены для трансплантации органов. Триллиум-Дар программе Life получает согласие на изъятие тканей для исследовательских целей от семьи пациента и уведомляет нашу команду уборки своевременно, так что мы смогли собрать шнуры в течение 2 часов в пережатия аорты. Мужские и женские взрослые доноры с отрицательным серологических и никаких инфекций не принимаются.

  1. Урожай ткани в стерильной моды в операционной комнате через передний подхода, используя тот же передний экспозицию уже вскрывали для извлечения органов по органной транспLant команда сбор.
  2. Expose передней позвоночник через втягивание с большими ребрами удобрений и крупных гребных преднатяжителями остальных тканей и органов, включая крупных кровеносных сосудов.
  3. Используйте пилу грудины, установленный с длинным лезвием, чтобы прорваться через межпозвоночных дисков в ростральных и каудального концов нужной длины позвоночного столба, чтобы быть резекция. Угол пила около 45 ° медиально сократить корыто треугольную из боковой части тел позвонков остановки чуть меньше позвоночного канала.
  4. Удалить целиком медиальной стороны тел позвонков желаемых сегментов с помощью изогнутых остеотомов и молотком стараясь избежать сокращения через твердую мозговую оболочку. Затем осторожно поднимите твердой мозговой спинной мозг покрыты с зубчатыми щипцами и резко надрезать ростральные и хвостовой концы шнура. Используйте длинные ножницы и пинцет, чтобы на двусторонней основе секут отдельные корни.
  5. Поместите вырезали сегмент спинного мозга в 4 °С стерильной буфера (1x HBSS + 0,6% глюкозы + 2% пенициллина-стрептомицина) в большой пробирке для транспортировки к комнатной культуре ткани.

  6. Примечание: Как правило, 3 - 6 см сегмент спинного мозга из верхнего грудного и / или средне-низком уровне грудной удаляется в операционной в стерильных условиях, как можно скорее после прекращения циркуляции и помещают в холодный стерильный буфер , Время, прошедшее между прекращением циркуляции и удаления спинного мозга зависит от времени, необходимого для сбора целевых органы для донорства и колебалась от 45 мин до 2 часов. Если сердце и легкие были также удалены, рассечение могут быть приняты далеко рострально собрать часть нижней шейки мозга, а также.
  7. Проанализируйте спинного мозга ткани человеческого как можно скорее после сбора урожая, как правило, в течение 3 часов. Удалить твердую мозговую оболочку и другие мозговые оболочки щипцами. Промойте ткань спинного мозга в свежеприготовленный 4 ° С рассечение буфера исократить в поперечном направлении в 1 см сегментов.
  8. С помощью рассекает сферу, вырезать вышележащие мозговые оболочки, белое вещество, и большинство из серого вещества, используя ткани щипцы, тонкий пинцет и microscissors для каждого участка ткани. Бассейн расчлененный перивентрикулярная ткани, которая включает в себя эпендимы и небольшое количество серого вещества, окружающего, в 10 см стерильную чашку Петри, содержащую холодный человека буфер рассечение.

4. Выделение и Культивирование взрослых крыс и человека позвоночника NSPCs шнура

  1. Выполните следующие шаги в асептических условиях в ламинарном боксе.
    1. Фарш расчлененный крысу или человека перивентрикулярная ткани в 1 мм 3 штук с microscissors.
    2. Ферментативно отделить измельченной ткани с использованием протеолитических ферментов папаин комплект диссоциации, как указано в таблице материалов / реагентов. Примечание: Реагент компоненты включают в себя 4 флаконов; Флакон 1: Эрла сбалансированный солевой раствор (EBSS), флакон 2: папаин containinг L-цистеина и ЭДТА, колба 3: Дезоксирибонуклеаза I (ДНКазы), флакон 4: Овомукоид ингибитор протеазы с бычьим сывороточным альбумином (БСА).
      Примечание: Примечание: Папаин сульфгидрильная протеазы, который имеет широкий специфичность для белковых субстратов. Папаин в данном документе является производным от латекса из папайи Carica завода и ухудшает большинство белковых субстратов более широко, чем панкреатические протеазы. В процессе диссоциации есть повреждения клеток в результате чего ДНК, будет выпущен в среде диссоциации что приведет к увеличению вязкости и сделать пипетки трудно. Таким образом, ДНКазы входит в процедуре выделения клеток усваивать ДНК без повреждения интактных клеток. Ovomucoids которые гликопротеина ингибиторы протеазы, используемые для ингибирования активности папаина после стадии диссоциации.
  2. При первом использовании, воссоздать ингибитор альбумина овомукоид смесь (пробирка 4) с 32 мл EBSS (пробирка 1), а затем хранят при температуре 4 ° С и используют в последующих выделений.Примечание: Это дает решение в эффективной концентрации 10 мг овомукоид ингибитора и 10 мг альбумина на миллилитр.
  3. Добавляют 5 мл EBSS (пробирка 1) к папаина флакона (флакона 2), с получением раствора на 20 единиц папаина / мл в 1 мМ L-цистеина с 0,5 мМ ЭДТА. Убедитесь, что папаин решение появляется ясно, когда полностью не растворится, иначе поместите флакон в водяную баню при 37 ° в течение десяти минут, пока, папаин полностью не растворится, чтобы обеспечить полную активность фермента.
  4. Добавить 500 мкл EBSS (пробирка 1) к ДНКазы флакон (флакон 3) и осторожно перемешать в ДНКазы чувствителен к сдвигу денатурации. Добавить 250 мкл раствора ДНКазы в пробирку, содержащую папаин, полученный в конечной концентрации приблизительно 20 единиц / мл папаин и 0,005% ДНКазы. Сохранить баланс ДНКазы флакон, чтобы использовать позже.
  5. Поместите фарш крысу или тканей человека в папаин решения, подготовленный в шаге 4.4 выше. Для выделения тканей человека, разделить фарш ткани поровну между двумяпапаин флаконы (примерно 0,2 г / флакон).
  6. Инкубируют при 37 ° С при постоянном перемешивании на качалке платформы для диссоциации ткани в раствор активированного папаина. Инкубируйте ткани крыс в течение 45 мин до 1 ч, и человеческой ткани в течение 1 2 часов в зависимости от количества измельченной ткани, около 0,2 - 0,4 г соответственно.
  7. Растирают в смеси с 10 мл пипетки, чтобы отделить все оставшиеся кусочки ткани с образованием мутной суспензии клеток. Передача клеточной суспензии (не включают каких-либо кусков ткани недиссоциированной) в стерильный 15 мл коническую пробирку и центрифугируют при 300 х г в течение 5 мин при комнатной температуре.
  8. Ресуспендируют гранулированных клеток в среде, содержащей Овомукоид, ингибитор папаин.
    1. Подготовка овомукоид решение путем смешивания 2,7 мл EBSS (флакон 1) 300 мкл восстановленного альбумин-овомукоид раствора ингибитора (пробирка 4) в 15 мл коническую пробирку. Добавить 150 мкл раствора (флакон 3) ДНКазы, сохраненные на шаге 4.4 выше.
    2. Удалите супернатант изосажденные клетки и сразу ресуспендируют осадок клеток в разбавленных ДНКазы альбумина ингибитор смеси.
  9. Отдельные неповрежденные клетки клеточных мембран центрифугированием через один шаг прерывистого градиента плотности.
    1. Подготовка градиент разрывной плотностью добавлением 5 мл альбумина раствора ингибитора (флакон 4) в 15 мл пробирку, и с помощью 5 мл пипетки, осторожно и медленно слой клеточной суспензии (полученного, как описано выше в шаге 4.8) на вершине альбумин раствора ингибитора.
    2. Центрифуга при 70 мкг в течение 6 мин при комнатной температуре.
    3. Примечание: Интерфейс между двумя слоями градиента должны быть четко видны, хотя минимальное перемешивание на этой границе не влияет на результат. Мембранные фрагменты остаются на границе раздела и диссоциированные клетки осаждения на дно пробирки.
  10. Для крыс клетки, отбросить супернатант и ресуспендируют осадок клеток в 1 мл среды крыс EFH (предварительно нагретого до 37 ° С).Количество живой клеточной плотности с помощью гемоцитометра и пластины клеток в культуральной колбы Т25 при плотности 10 клеток / мкл в EFH. Типичный выход клеток из ткани крысы составляет около 2 × 10 6 клеток с 80% viability.If клональных культур желательно, семенных клеток при плотности менее 10 клеток / мкл. Инкубируйте колбы при 37 ° С в 5% СО 2 и позволить расти культуры в покое на 1 неделю, чтобы избежать агрегации сфер.
  11. Для клеток человека, отбросить супернатант и ресуспендируют осадок клеток в 10 мл среды человеческого EFH (предварительно нагретого до 37 ° С). Фильтр клеточной суспензии через сито нейлона клеток 40 мкм с последующим 30 мл EFH удалить миелина и клеточные мембранные фрагменты. Центрифуга при 300 мкг в течение 5 минут и ресуспендируют осадок клеток в 1 мл EFH среды.
  12. Количество живой клеточной плотности с помощью гемоцитометра и пластины клетки человека в культуральных планшетах 6-луночные при плотности 10 5 клеток / лунку в общем объеме5 мл ОМР / хорошо. Типичный выход клеток из тканей человека составляет около 1 × 10 6 клеток с 70% жизнеспособностью. Предварительно пальто скважины со приверженцем подложки, такие как Matrigel (см примечание ниже). Развести в соотношении 40 мкл Matrigel: 1 мл SFM.
  13. Примечание: В качестве альтернативы, можно использовать другие адгезивные субстраты, такие как поли-D-лизином / ламинин, фибронектин, или коллагена.
  14. Инкубируйте пластин при 37 ° С в 5% СО 2 и позволить расти культуры в покое на 1 неделю.

5. пассажи из взрослых крыс и спинного мозга человека NSPCs

  1. Крыса NSPCs образуют небольшие нейросферы примерно 70 мкм в диаметре в течение 1 недели первоначального посева; Переход крыс NSPCs еженедельно путем сбора клеточной суспензии, центрифугированием при 300 х г в течение 5 мин, и механически растиранием осадок клеток для диссоциации нейросферы.
  2. Семенной диссоциированных клеток в Т25 колбы, содержащие свежие крыс EFh среду. В качестве альтернативы,использовать 50% кондиционного крыс среду для пересева. Типичный выход из крысиных NSPCs на пассажей около 5 х 10 6 клеток, которые экспоненциально возрастает с числом пассажей.
  3. Для человеческих культур, через неделю после первоначального посева, заменить половину культуральной среде со свежей EFH два раза в неделю, чтобы позволить клеткам прилипать к подложке. Как правило, 1 - 2 недели после того, как клетки прикреплены к субстрату, замените весь объем культуральной среды два раза в неделю со свежей EFH.
  4. Субкультура клетки до достижения слияния между 4 - 8 недель.
    1. Субкультура клеток путем отсоединения клеток от субстрата ферментативной (табл материалов) с 2 мл фермента на лунку инкубировали в течение приблизительно 10 мин при 37 ° С. Собирают суспензию клеток, центрифугируют при 300 х г в течение 5 мин, и осторожно ресуспендируют осадок клеток в 1 мл свежеприготовленного EFH среды.
    2. Количество живых клеток с помощью гемоцитометра и пластины клеток в культуральных планшетах 6-луночные (предварительно совместноованные, как указано выше в пункте 4.12) при плотности 10 5 клеток / лунку в общем объеме 5 мл EFH / а. Типичный выход человека в NSPCs пассажей около 2 х 10 6 клеток и, как правило это удвоит с прохода. Как правило, поддерживать культуру с 50% условного EFH среды 2 - 3 раза в неделю между пассажами.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Взрослый клетки крысы спинного мозга, выращенные в суспензионной культуре в среде EFH образуют небольшие нейросферы (колонии недифференцированных клеток) в течение 1 недели первоначального посева. В первичных культурах, большинство клеток высевали умрет и фактор роста реагирующих стволовые клетки пролиферируют и выбираются для в среде EFH. По прохождении 3, будет множество свободно плавающего нейросферы около 100 мкм в диаметре (фиг.2А). Нейросферах круглые и фазы ярким, и при большом увеличении, реснич...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Во время вскрытия крыс спинного мозга помощи ткани должны быть приняты, чтобы не повредить спинной мозг при выполнении ламинэктомию. Это легче изолировать перивентрикулярные ткани, когда сегментов спинного мозга не повреждены. Сегменты ткани должны быть полностью погружены в рассечение буфера и вышележащие мозговые оболочки и белое вещество может быть срезана, как продольных полос с microscissors. В качестве альтернативы, тонким пинцетом ткани могут быть использованы, чтобы очистить от белого вещества.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы хотели бы выразить признательность за поддержку от Spinal Cord Injury Ontario, Онтарио-китайского фонда исследований и инноваций, Фонда общих и западных больниц Торонто и Фонда Physicians' Services Incorporated. Авторы благодарят доктора Таснима Захира за экспертные советы по культуре NSPC спинного мозга человека, а также докторов Синди Морсхед и Ирис Кульбатски за их экспертные советы по изоляции NSPC спинного мозга крыс.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
1x PBSLife Technologies#10010023Буфер для рассечения
1x HBSSLife Technologies#14175095Буфер для рассечения
D-глюкозыSigma# G-6152Приготовление 30% раствора глюкозы для буфера для рассечения и смеси гормонов
Пенициллин-стрептомицинLife Technologies#15140-148Буфер для рассечения и питательная среда
Нейробазал-A Life Technologies#10888-022Питательная среда
L-глутамин, 200 мМLife Technologies#25030-081Культуральная среда
B27Life Technologies#12587010Культуральная среда
DMEMLife Technologies#11885084Гормональная смесь
F12Life Technologies#21700-075Гормональная смесь
NaHCO 3Sigma# S-5761Приготовить 7,5% NaHCO3 стоковый раствор для гормональной смеси
HEPESSigma#H9136Приготовить 1M стоковый раствор HEPES для гормональной смеси
ИнсулинSigma#I-5500Гормональная смесь
Apo-трансферринSigma#T-2252Гормональная смесь
PutrescineSigma# P7505Гормон
смесь селенаSigma#S-9133Смесь гормонов
ПрогестеронSigma#P-6149Смесь гормонов
EGF, мышьSigma#E4127Готовьте 100 μ г/мл акций в B27 и аликвотах; EFH средняя
ЭФР, человеческий рекомбинантныйSigma#E9644Готовьте 100 мкм; г/мл акций в B27 и аликвотах; EFH medium
bFGF, человеческий рекомбинантныйSigma#F0291Готовьте 100 мкм; г/мл акций в B27 и аликвотах; EFH средний 
Гепарин, 10 000 ЕДсигма#H3149Приготовьте запасы 27,3 мг/мл в смеси гормонов и аликвот; Набор для
диссоциации среднего папаинаEFH Worthington Biochemicals#LK003150Содержит EBSS, папаин, ДНКазу, ингибитор овомукоидной протеазы с BSA
Sodium PentobarbitalBimeda – MTC Animal Health IncDIN 00141704
Щипцы для тканей: AddisonsFine Science Tools#11006-12 Стандартный зазубренный наконечник; также доступен микронаконечник
Тонкие щипцы: Dumont # 4Fine Science Tools# 11241-30
МикроножницыFine Science Tools# 15024-10Vannas
RongeursBausch & Чашки Петри LombN1430
10 мм Nunc1501
T25 Колбы для культурыNunc156367
40 μ m нейлоновое ситечкоVWRCA21008-949
6 лунок пластиныNuncCA73520-906
Matrigel, фактор роста снижен (100x)Corning354230разморозьте в соответствии с инструкциями и заморозьте аликвоты; используйте разбавленные в соотношении 40 мкм; l Матригель: 1 мл SFM

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gage, F. H. Mammalian neural stem cells. Science. 287, 1433-1438 (2000).
  2. Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255, 1707-1710 (1992).
  3. Gritti, A., et al. Multipotential stem cells from the adult mouse brain proliferate and self-renew in response to basic fibroblast growth factor. J Neurosci. 16, 1091-1100 (1996).
  4. Morshead, C. M., et al. Neural stem cells in the adult mammalian forebrain: a relatively quiescent subpopulation of subependymal cells. Neuron. 13, 1071-1082 (1994).
  5. Weiss, S., et al. Multipotent CNS stem cells are present in the adult mammalian spinal cord and ventricular neuroaxis. J Neurosci. 16, 7599-7609 (1996).
  6. Martens, D. J., Seaberg, R. M., van der Kooy, D. In vivo infusions of exogenous growth factors into the fourth ventricle of the adult mouse brain increase the proliferation of neural progenitors around the fourth ventricle and the central canal of the spinal cord. Eur J Neurosci. 16, 1045-1057 (2002).
  7. Kulbatski, I., et al. Oligodendrocytes and radial glia derived from adult rat spinal cord progenitors: morphological and immunocytochemical characterization. J Histochem Cytochem. 55, 209-222 (2007).
  8. Akesson, E., et al. Long-term culture and neuronal survival after intraspinal transplantation of human spinal cord-derived neurospheres. Physiol Behav. 92, 60-66 (2007).
  9. Dromard, C., et al. Adult human spinal cord harbors neural precursor cells that generate neurons and glial cells in vitro. J Neurosci Res. 86, 1916-1926 (2008).
  10. Mothe, A. J., Zahir, T., Santaguida, C., Cook, D., Tator, C. H. Neural stem/progenitor cells from the adult human spinal cord are multipotent and self-renewing and differentiate after transplantation. PLoS One. 6, e27079(2011).
  11. Huettner, J. E., Baughman, R. W. Primary culture of identified neurons from the visual cortex of postnatal rats. J Neurosci. 6, 3044-3060 (1986).
  12. Azari, H., Rahman, M., Sharififar, S., Reynolds, B. A. Isolation and expansion of the adult mouse neural stem cells using the neurosphere assay. J Vis Exp. , (2010).
  13. Reynolds, B. A., Rietze, R. L. Neural stem cells and neurospheres--re-evaluating the relationship. Nat Methods. 2, 333-336 (2005).
  14. Singec, I., et al. Defining the actual sensitivity and specificity of the neurosphere assay in stem cell biology. Nat Methods. 3, 801-806 (2006).
  15. Louis, S. A., Azari, H., Sharififar, S., Vedam-Mai, V., Reynolds, B. A. Neural-colony forming cell assay: an assay to discriminate bona fide neural stem cells from neural progenitor cells. J Vis Exp. , (2011).
  16. Louis, S. A., et al. Enumeration of neural stem and progenitor cells in the neural colony-forming cell assay. Stem Cells. 26, 988-996 (2008).
  17. Conti, L., et al. Niche-independent symmetrical self-renewal of a mammalian tissue stem cell. PLoS Biol. 3, e10(2005).
  18. Pollard, S. M., Conti, L., Sun, Y., Goffredo, D., Smith, A. Adherent neural stem (NS) cells from fetal and adult forebrain. Cereb Cortex. 16, Suppl 1. i112-i120 (2006).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи