Мышь наивного CD4 + Т-клеток Выделение и В пробирке Дифференциация в Т-клеточных подмножеств

Краткое содержание

Наивные CD4⁺ Т-клетки поляризуются на различные подмножества в зависимости от окружающей среды во время активации. Дифференцировка наивных CD4⁺ Т-клеток к различным субпопуляциям эффекторов может быть достигнута in vitro путем добавления стимулов рецепторов Т-клеток и специфических цитокиновых сигналов.

Аннотация

антиген неопытные (наивные) CD4⁺ Т-клетки претерпевают экспансию и дифференцировку в эффекторные субпопуляции во время распознавания Т-клеточным рецептором (TCR) родственного антигена, представленного на MHC класса II. Цитокиновые сигналы, присутствующие в окружающей среде во время активации TCR, являются основным фактором в определении эффекторной судьбы наивных CD4⁺ Т-клеток. Несмотря на то, что цитокиновая среда во время наивной активации Т-клеток может быть сложной и включать как избыточные, так и противоположные сигналы in vivo, добавление различных комбинаций цитокинов во время наивной активации CD4⁺ Т-клеток in vitro может легко способствовать установлению эффекторных Т-хелперных линий с характерной экспрессией цитокинов и факторов транскрипции. Такие эксперименты по дифференцировке обычно используются в качестве первого шага для оценки мишеней, которые, как считается, способствуют или ингибируют развитие определенных субпопуляций CD4⁺ Т-хелперов. Добавление медиаторов, таких как сигнальные агонисты, антагонисты или другие цитокины, в процессе дифференцировки также может быть использовано для изучения влияния конкретной мишени на дифференцировку Т-клеток. В данной статье мы опишем базовый протокол выделения наивных Т-клеток от мышей и последующие шаги, необходимые для поляризации наивных клеток в различные линии Т-хелперных эффекторов in vitro.

Введение

Концепция различных линий или подмножеств CD4 ⁺ Т-хелперов (Th) клетки была примерно со второй половины ^20-го века ^1. Распознавание антигеном в присутствии костимуляторных сигналов приводит в нескольких раундах клеточной пролиферации и дифференцировки в конечном итоге в эффектора Th-клеток. Тип Th клетки, генерируемого в ходе этого процесса зависит от окружающей среды цитокинов, присутствующих во время активации ^2. Первоначально наивные Th клетки думал поляризовать в 2 различных линий следующих T-клеточного рецептора (TCR) активации, костимулирующего CD28 перевязки и цитокинов сигнализации. Тип 1-хелперы (Th1) характеризуются эффекторной производства цитокина IFN & gamma; а также их потребности в ИЛ-12 сигнализации в процессе дифференциации ^3,4. В конце концов выяснилось, что дифференцированные клетки Th1 имеют генетический профиль, который наиболее отчетливо характеризуется бу выражение T коробки фактора семья транскрипции, Tbx21 (T-бет), который считается мастером регулятором генетической программы Th1 ^5. Кроме того, ИЛ-12, а также может способствовать IFN & gamma; Т-прогноз выражение ^6,7. В иммунного ответа, Th1-клетки играют важную роль в защите организма против внутриклеточных патогенов, а также сильных промоторов аутоиммунного воспалительного процесса. В отличие от этого, тип 2-хелперы (Th2) требуют IL-4 по их развитием и эффекторные цитокины, включая IL-4, IL-5 и IL-13, имеют важное значение для приведения ответов В-клеточные и являются патогенными при аллергии ^{8, 9.} Как Th1 клеток, Th2 клетки были обнаружены, чтобы выразить свою собственную регулятор мастер транскрипции, называют GATA-3 ^10,11. Интересно, что присутствие поляризующих цитокинов и генерации конкретного Th линии являются антагонистами к развитию других ^2,12, предполагая, что только подмножество частности че может стать доминирующим в ходе иммунного ReОтклик.

Поскольку идентификации клонов Th1 и Th2, дальнейшая работа показала, еще более уникальным подмножества Т-хелперных клеток, в том числе фолликулярной помощника (TFH), IL-9-продуцирующих (Th9), и IL-22-продуцирующие (Th22) (последнее рассмотрены в ^13). Для целей в пробирке экспериментов дифференциации, этот протокол будет сосредоточена только на два дополнительных Th подмножества, называемые регуляторные Т-клетки (Treg) и Ил-17 по производству CD4 ⁺ Т-клетки (TH17). CD25 ⁺ регуляторных Т-клеток может происходить естественным (nTreg) в тимусе; Наивные клетки Th также могут быть вызваны (iTreg), чтобы стать регулирования на периферии (обзор ^14,15). Оба типа регуляторных Т-клеток выразить характеристика транскрипционный фактор, названный forkhead P3 коробка (FOXP3), которая имеет решающее значение для их эффекторных механизмов подавления, которые включают растворимые противовоспалительное производства посредника, IL-2 потребления, а ячейку контактно-зависимые механизмы ^14,15. Отсутствие Foxp3 Результаты выражение в тяжелой, полиорганной аутоиммунных расстройств называется иммунной нарушения, так polyendocrinopathy, энтеропатия, с Х-хромосомой синдром (IPEX), что свидетельствует о критической роли этого Th подмножества в решении воспаление и регулирования периферической толерантности к собственным антигенам ^16. В пробирке, наивные CD4 ⁺ Т-хелперы до регулировать Foxp3 и стать привержены программы Treg при стимуляции IL-2 и TGF-β ^14,15. Там может быть умеренной до значительной пластичности в CD4 ⁺ Т-клеточных поколений, особенно при рассмотрении только продукцию цитокинов (обзор в ^17,18). Тем не менее, для целей в пробирке протоколов дифференциации, мы будем обсуждать каждое из подмножеств как уникального рода.

Недавно подмножество Th17 клеток, которые производит цитокин IL-17 была определена в качестве уникального линии с про-воспалительных функций, особенно патогенные во время аутоиммунного воспаления ^19-21, Th17 клетки экспрессируют уникальный транскрипционный фактор, названный ретиноидов, связанные с гамма-рецептор сирота т (RORγt), который координирует генетическую программу ²² Th17. TGF-beta является важным для генерации Th17 линии через индукции RORγt. Тем не менее, влияние сигналов TGF-beta, как полагают, вызывают только Th17 приверженность при синергизма с IL-6 (обзор в ^12). Дальнейшие исследования показали, что множество других сигналов, которые могут положительно регулируют Th17 приверженность, в том числе ИЛ-1β, увеличение натрия и TLR сигнализации ^23-26. Другие отчеты предполагают, что патогенные клетки Th17 в естественных условиях являются те, которые фактически обходить сигнализации TGF-beta, а вместо этого полагаются на сочетание ИЛ-1, ИЛ-6 и ИЛ-23 для их дифференциации ^27. Таким образом, Th17 клетки могут быть получены из различных сигнальных путей; для целей настоящего протокола, часто используемых (TGF-beta и IL-6) путь для Th17 коммитированиебудут представлены.

Протоколы дифференцирования, описанные ниже, для всех эффекторных линий зависит от фиксированного антитела, стимулов для TCR и CD28 на протяжении всего хода эксперимента. Тем не менее, другие показали, что TCR-активации с антиген-представляющих клеток ²⁸ или сшивающий анти-CD3 и анти-CD28 антител с антителом хомячка в течение 2 дней ²⁹ также весьма эффективным средством индукции генерацию различных Th подмножеств. Протокол, представленные здесь основывается на ранее сообщалось о способах выделения мышиных CD4 ⁺ Т-клеток из вторичных лимфоидных органов ³⁰ и генерации клетки Th17 ^31. Одним из основных отличий является то, что этот протокол основан на использовании клеточного сортера, чтобы изолировать наивных CD4 ⁺ Т-клеток от лимфоидных тканей. Тем не менее, многие компании сейчас предлагают для экспресс разделения, который может обогатить для простых CD4 ⁺ Т-клеток, которые могут быть в состоянии обойти требование пили сортировки в зависимости от эксперимента. Методы и реагенты, представленные в этом протоколе то, что мы обычно используем и нахожу, чтобы быть наиболее эффективным. Однако, имейте в виду, что альтернативные реагенты и методологии существуют для многих из шагов, представленных ниже, и это до индивидуального лаборатории, чтобы определить, что будет работать лучше для своих целей.

Протокол

Все экспериментальные процедуры выполняются с использованием протоколов, утвержденных в офисе окружающей среды и безопасности в Розалинд Франклин университета медицины и науки. C57BL / 6 мышей (полученных от NCI), используемый для этого протокола были размещены под конкретного патогена условиях, и все эксперименты на животных проводились с использованием протоколов, утвержденных Комитетом Уходу за животными и использование (IACUC) в то Розалинд Франклин университет медицины и Наука.

1. Подготовка инструментов, расходных материалов, а Реагенты

1. Пальто 48-а и 24-луночные планшеты с анти-CD3 и анти-CD28 (таблица 1) в стерильном PBS, накрыть крышкой и заверните в парафильмом для предотвращения испарения и загрязнения, а затем инкубируют O / N на 4 ^{° С} за день до T изолятор. Кроме того, пальто скважин 1 ч при 37 ^о С. Выполните условия Th0, Th1, Th2, и iTreg путем нанесения как анти-CD3 и анти-CD28 на 1 мкг / мл 0,5-1 мл доОбъем Таль (48-луночный планшет). Для Th17, мы, как правило, покрытие анти-CD3 на 2 мкг / мл и анти-CD28 на 1 мкг / мл.
   Примечание: Мы обнаружили, что более низкая концентрация анти-CD3 является оптимальным для генерации Th1, Th2, и iTreg то время как более высокая концентрация анти-CD3 является оптимальным для генерации Th17. Таким образом, анти-CD3 и анти-CD28 концентрации следует титровать и оптимизирована для отдельных лабораторий (таблица 2).
2. Стерилизовать набор рассечение инструментов (ножницы и щипцы) в автоклаве или дезинфицирующим раствором. Трубка или маленький стакан, содержащий 70% этанола будут необходимы для быстрого стерилизации инструментов между вскрытия. Наконец, распылитель, содержащий 70% этанола будет необходимо для стерилизации поверхности мыши до вскрытия.
3. Подготовка рассечение поверхности, обернув плоский кусок пенопласта или пробковая в алюминиевой фольги. Режущий булавки или иглы используются для фиксации животных на месте.
4. Готовить блюда или пластин для сбора TiОПРОСЫ. Если объединение ресурсов тканей, отдельных 60mm блюда, содержащие 3 мл стерильного PBS + 1% FBS (PBS +) для селезенки и лимфатических узлов тканей достаточно. Если сохранение ткани из отдельных мышей по отдельности, подготовить 24-луночный планшет, содержащий 1 мл PBS + в нужное количество скважин.
5. Подготовьте полный RPMI носитель для культуры клеток и предварительной тепло перед использованием (Таблица 1).
   Примечание: Мы обычно используют RPMI, но и другие средства, такие как IMDM и DMEM может быть столь же эффективным или выше в зависимости от лаборатории и эксперимента.
6. Сокращение 2х2 см квадраты нейлоновой сеткой с размером пор 120 мкм и автоклав для стерилизации (таблица 1).
7. Дополнительно: при использовании высокоскоростной магнитной ячейки системы сортировки, такие как AutoMACS для обогащения CD4 ⁺ клеток, предварительно теплой проточной и промывки буферы в C на водяной бане 37 ^O, чтобы предотвратить повреждение машины.
8. ПРИМЕЧАНИЕ: Обогащение рекомендуется увеличить выход сортировки и сократить время сортировки.
9. Всестадии получения, за исключением того, для вскрытия, должны быть выполнены в стерильной капот культуры ткани.

2. Выделение лимфатических узлов и селезенки у мышей

1. Эвтаназии необходимое количество животных с использованием институционально-утвержденный технику. Используйте C57BL / 6 самок мышей, возраст 5-10 WKS, из-за их высокой процентной наивных Т-клеток и нижней части тела жиром по сравнению с мужчинами или старых мышей.
   Примечание: клетки, полученные от мышей-самцов будет выполнять так же в пробирке и этапы протокола остаются теми же. Самок мышей, 5-10 нед старые, как правило, дают 3-6 х 10 ⁶ наивных CD4 ⁺ Т-клеток на мышь. Однако, используя различные штаммы мышей может повлиять на урожайность и производительность. Например, клетки от мышей C57BL / 6 лучше для генерации Th1 клеток, а клетки мышей Balb.c лучше для генерации клеток Th2.
2. Распространение конечности животного и закрепите их на месте, как показано на рисунке 1. Вырезать кожи длинойitudinally из ануса к подбородку, стараясь при этом не проколоть более глубокие ткани.
3. Распространение открыть кожу щипцами и закрепить кожу в месте, чтобы обеспечить свободный доступ к лимфатических узлов, как показано на рисунке 1.
4. Урожай доступные лимфатических узлов точках, указанных на рисунке 1. Схватив лимфатический узел с парой щипцов при отделении ткани с другой парой щипцов позволит для легкого удаления. Поместите ткань в коллекции блюдо.
5. Урожай селезенки от местоположения, показанного на фиг.1. В этом случае, осторожно резки в брюшину необходимо получить доступ к селезенке. Поместите ткань в коллекции блюдо.
6. Повторите процедуру, если больше ткани будут собраны. В противном случае перейдите к следующему шагу. В этот момент, не выполнять все остальные шаги на льду до обшивки из Т-клеток после сортировки.

3. Ткань Обработка и CD4 ⁺ Обогащение

1. Процесс лимфатические узлы и селезенку в различных блюд, чтобы увеличить выход как препараты клеток лимфатических узлов не требуют эритроцитов лизис, которые могут привести к незначительным лейкоцитов смерти. Таким образом, следующие шаги описывают способ обработки селезенки и лимфатических узлов населения отдельно с последующим объединения до маркировки для сортировки.
2. Снимите ткань (селезенка или объединенного лимфатические узлы) в чашке сбора и места в новом 60 мм блюдо с 3 мл PBS +. Поместите квадрат стерильной нейлоновой сетки над ткани с использованием стерильных щипцов.
3. Возьмите большой палец сторону поршня шприца (3-10 мл) и осторожно разбить ткань от сетки. Почти все ткани должны идти в суспензии. Кроме того, поместите ткань между двумя автоклавированна матовых горок и измельчают в суспензии.
4. Внесите подвески вверх и вниз несколько раз, чтобы разбить оставшиеся растворимые скопления. Вставьте новую квадратный кусок нейлоновой сетки на открытии15 мл коническую трубку и фильтр суспензии через, чтобы удалить оставшиеся обломки.
5. Повторите шаги 2-4 для дополнительной лимфатического узла и селезенки ткани.
6. После того, как суспензию фильтруют был в 15 мл пробирку заполнить остальную часть трубы с PBS + и инвертировать несколько раз. Центрифуга клетки при 475 мкг в течение 5 мин при 4 ° ^С.
7. Для клеток селезенки, аспирата супернатант После центрифугирования и ресуспендируют осадок клеток в 1 мл охлажденного льдом 1X ACK раствора на селезенке в течение 1 мин для лизиса эритроцитов. Затем добавляют 10 мл PBS + в верхней части ACK, инвертировать трубку и центрифуги 475 мкг в течение 5 мин при 4 ^о С.
8. Для клеток лимфатических узлов, аспирация супернатант и ресуспендируют в 2 мл PBS +. При желании они могут быть объединены с клеток селезенки после их лизиса АСК и стадии промывки.
9. Аспирата супернатант после центрифугирования спленоцитов и ресуспендируют в другом 10 мл PBS +. В этот момент лимфатических узлов подвески может бытьdded в верхней части суспензии селезенки, если ткань объединение требуется для сортировки. Центрифуга трубки снова в 475 мкг в течение 5 мин при 4 ° ^С.
10. Осадок клеток теперь могут быть подготовлены для CD4 обогащения. Если этот шаг не будет выполнена, переходите к сортировке, подготовке.
11. Для CD4 обогащения с использованием высокоскоростной магнитной системы сортировки клеток, ресуспендируют клеточной шарик бисером CD4. Обычно 15 мкл из бисера разводят в 85 мкл PBS + используется для обозначения тканей от 1 мыши. Нарастить объемы из бисера смеси, когда необходимо, ресуспендируют осадок, и инкубировать в течение 15-30 мин при 4 ° ^С.
12. Промыть клеток с 10 мл PBS +, проходить через суспензию нейлона в новую пробирку 15 мл для удаления мусора, и центрифуга снова в 475 мкг в течение 5 мин при 4 ^о С.
13. Ресуспендируют осадок в 100 мкл PBS + на мышь и перейти к позитивной селекции на высокой скорости сортировочной системы магнитной ячейки. При использовании ручную систему разделения, Follow инструкциям производителя для обогащения. Кроме того, ресуспендируют образцов в FACS буфере: PBS с 1 мМ ЭДТА (рН = 8) и 1% BSA, стерильно фильтруют.
14. Снимите положительная дробь и мыть снова 10 мл PBS +. Обогащенный CD4 ⁺ фракция теперь готов быть помечены для сортировки.

4. Сортировка наивного CD4 ⁺ Т-клетки

1. Этикетка осадок клеток с PBS + люминесцентные ртутьсодержащие антитела, направленные против CD62L, CD44, CD25 и CD4. При использовании антител, перечисленных в таблице 1, для каждого разведения предусмотрены. Для окрашивания, объем 100 мкл коктейля антител используется в тканях от одной мыши.
2. Ресуспендируют осадок в коктейль антител и инкубировать в течение 15-30 мин при ⁴ ° С в темноте.
3. Вымойте клеток с 10 мл PBS + и центрифуги 475 мкг в течение 5 мин при 4 ° ^С.
4. Пропускают смесь через другую нейлоновый фильтр или сотовый фильтра крышку, чтобы повторноперемещать любые остатки мусора. Пипетки меченых клеток в пробирку, который совместим для клеточного сортера. Держите клетки на льду и защищенном от света месте, пока в этом роде.
5. Подготовка сбора трубки с помощью пипетки 1-2 мл RPMI полных сред или FBS в нижней части трубок, совместимых для сбора на клеточного сортера.
6. Сортировать наивные CD4 ⁺ Т-клетки, как CD4 ⁺ CD25 ^- CD62L ⁺ CD44 ^- население (рис 2). Промыть Собранные клетки с полным RPMI среде и центрифуги, как описано выше.
7. Ресуспендируют гранул в полной среде RPMI, рассчитывать наивной клетки, и регулировать концентрацию до 1 × 10 ⁶ клеток / мл.

5. Настройка В пробирке Дифференциация

1. Аспирируйте скважин пластин, покрытых анти-CD3 и анти-CD28 и мыть каждую лунку с 1 мл стерильной PBS (без FBS). Для 48-луночных планшетах, пластины 0,5 × 10 ⁶ клеток / лунку в 0,5 мл RPMI. Для 24-луночных планшетах, культуры 1 х 10 ⁶ клеток / лунку в 1,0 мл RPMI.
2. Если тестирование влияния фактора, такого как препарат добавить вещество в соответствующие лунки либо до, во время или после процесса дифференцировки в зависимости от эксперимента. Далее, дополнить питательных сред с цитокинами и блокирующих антител соответственно. Th0: 30 Ед / мл ГИП-2. Th1: 15 нг / мл rmIL-12, 30 ед / мл ГИП-2 и 5000 нг / мл 11B11.Th2: 10 нг / мл rmIL-4, 30 ед / мл ГИП-2, 2000 нг / мл растворимого 37,51, и 5000 нг / мл XMG1.2. iTreg: 15 нг / мл hTGFβ, 30 ед / мл ГИП-2, 5000 нг / мл XMG1.2 и 5000 нг / мл 11B11. Th17: 20 нг / мл rmIL-6, 3 нг / мл hTGFβ, 5000 нг / мл XMG1.2 и 5000 нг / мл 11B11.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Условия, представленные выше, являются оптимальными для максимизации продукцию цитокинов, измеренная в конце дифференциации эксперимента (Представитель Результаты разделе). Тем не менее, каждое условие должно быть оптимизировано для отдельных лабораторий (таблица 2 ). Кроме того, добавление растворимого анти-CD28 в дополнение к пластине связанного анти-CD28 было обнаружено, чтобы повысить продукцию цитокинов Th2 в нашей лаборатории, но не имеет никакого эффекта на других клеточных подмножеств Т:
3. Инкубируйте планшет при 37 ^{° С} с 5% СО ₂ в течение 4-5 d до анализа экспрессии генов и продукции цитокинов. С другой стороны, удалить клетки от стимулов TCR после 2 дней, доводили до 1 × 10 ⁶ клеток / мл свежей средой и пластины в новых скважин (не покрытой оболочкой), чтобы повысить пролиферацию и конечный выход. В этом случае, свежие поляризационные цитокины и антитела не нужны, но должны быть добавлены к новым медиа 10 U / мл IL-2 в течение Th0, Th1, Th2, и iTreg культур.

6. Анализ дифференциации

1. Для анализа цитокинов с помощью проточной цитометрии, рестимулировать каждую лунку с 10 нг / мл РМА и 1000 нг / мл иономицина или 1 мкг / мл анти-CD3 в течение 4-6 ч в присутствии ингибитора Гольджи, таких как брефелдин (табл1). Выполните внутриклеточный окрашивание цитокинов в зависимости от эксперимента (рис 3).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Пятно без Lineage конкретных цитокины или факторы транскрипции, такие как IL-4 (не показан) и IFN & gamma (рис 3) для Th17 культур, для каждого состояния в качестве отрицательного контроля и в качестве показателя эффективности дифференциации. Кроме того, пятно Foxp3 для Th17 культур, как обратной разработки регуляторных Т-клеток может происходить с добавлением TGF-beta.
2. Для белка количественного, собирать супернатанты из каждой лунки и анализе путем цитокин-специфический ELISA (рис 3). Если есть опасение, что коэффициент тестируемого повлияло пролиферацию по сравнению с контрольными образцами, клетки могут быть промыты, подсчитывали, нормализованное, а затем повторно стимулировали 1 мкг / мл анти-CD3 в течение 24 ч до сбора супернатантов для ИФА. Если опробования IL-4 с Th2 условия, стиральная и restimulating необходимо удалить IL-4, которые могут быть лeftover от начальной дифференцировки культуры.
3. Для анализа экспрессии генов с ПЦР в реальном времени, урожай клеток после инкубационного периода, мыть, нормализуют, и вновь стимулировать 2-6 ч с 1 мкг / мл анти-CD3 до уборки мРНК (рис 3).

Результаты

Момент времени для анализа дифференциации может изменяться в зависимости от состояния Th быть проверены, а также прочности активации Т-клеточного рецептора. После 2-3 дней дифференциации, клетки могут быть визуализированы с помощью световой микроскопии, чтобы определить степень пролиферации Т-клеток. Скважины, обладающие обширным пролиферацию и слипания клеток, скорее всего, будет готов для анализа на 4 день условиях дифференцировки, опираясь на добавлением экзогенного IL-2, такие как Th1 и Th2, скорее всего, исчерпываю...

Обсуждение

В то время как селезенка содержит наивные Th клетки, доля этой группы населения в лимфатических узлах гораздо выше. Неправильное выявление и устранение лимфатических узлов в этом протоколе приведет к плохим выходом наивных клеток. Это может быть особенно трудно у пожилых мышей и мышей-самцов, которые имеют более жировой ткани. Как показано на фиг.1, соответствующую фиксации и закреплению конечностей животного и кожи позволит легче визуализации доступных наружных лимфатических узлов. После того, как лимф...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Полный RPMI:			Согрейте на водяной бане 37 oC перед использованием
RPMI 1640 Media	Life Technologies	11875119
10 % FBS	Life Technologies	26140-079
1000X 2-меркаптоэтанол	Life Technologies	21985023
100X Pen/Strep	Life Technologies	15140122
100X L-глютамин	Life Technologies	25030081
нейлоновая сетка 120 микрон	Amazon	CMN-0120-10YD	Разрезанный на квадраты размером 2 см<>2 и автоклав
Альтернатива: сетчатые фильтры для ячеек 100 микрон	Fisher	08-771-19	Альтернатива резке нейлоновой сетки
autoMACS беговой буфер	Miltenyi	130-091-221	Согреть на водяной бане 37 oC перед использованием
раствор для полоскания autoMACS	Miltenyi	130-091-222	Нагреть на водяной бане 37 oC перед использованием
гранулы CD4	Miltenyi	130-049-201
ACK лизис буфер	Life Technologies	A10492-01
Цитокины:
Человек (h) IL-2	Peprotech	200-02
Мышь рекомбинантная (rm) IL-4	Peprotech	214-14
rmIL-6	R & D Systems	406-ML-025
rmIL-12	Peprotech	210-12
hTGFb	R & D Systems	240-B-010
Антитела:
2C11 (анти-CD3)	BioXcell	BE0001-1
37,51 (анти-CD28)	BioXcell	BE0015-1
11B11 (анти-IL-4)	BioXcell	BE0045
XMG1,2 (анти-IFNg)	BioXcell	BE0055
анти-CD62L-FITC	BioLegend	104406	Используйте при 1:100
анти-CD25-PE	BioLegend	102008	Используйте при 1:400
анти-CD4-PerCP	BioLegend	100434	Используйте при 1:1000
анти-CD44-APC	BioLegend	103012	Используйте при 1:500
Phorbol  12-миристат 13 ацетата (PMA)	Sigma-Aldrich	P-8139	Приготовьте бульон из дозы 0,1 мг/мл в ДМСО и заморозьте аликвоты при -20 oC
Иономицин	Sigma-Aldrich	I-0634	Приготовьте бульон в дозе 0,5 мг/мл в ДМСО и заморозьте аликвоты при -20 oC
Brefeldin A	eBioscience	00-4506-51	Используйте при 1:1000