Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Вирусный-опосредованной маркировки и трансплантации медиальной ганглиозные Высокопреосвященства (MGE) Клетки для

11.1K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/52740

⸱

23 апреля 2015 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Psychiatry, University of California San Francisco, 2Department of Neurological Surgery, University of California San Francisco

В этой статье

Краткое содержание

ГАМКергические корковых интернейронов предшественники разойтись, разработать и синаптически интегрироваться в принимающей мозга после трансплантации. Эти клетки могут быть легко трансдуцировали перед трансплантацией для исследований в естественных условиях генетически модифицированных предшественников ГАМК. Здесь мы покажем, вирусные методы маркировки для решения конкретных интерней- подгруппы, используя существующие CRE линии и Cre-зависимых журналистам.

Аннотация

ГАМКергические корковых интернейронов, полученные из эмбриональных медиальной и хвостового ганглиозных возвышения (MGE и КГЭ), функционально и морфологически разнообразны. INROADS были сделаны в понимании роли различных корковых интернейронов подгрупп, однако, есть еще многие механизмы должны быть разработаны, которые могут внести свой вклад в развитие и созревание различных типов ГАМК клеток. Кроме того, изменены сигнализации ГАМК может способствовать фенотипов аутизма, шизофрении и эпилепсии. Конкретные направления Cre-драйвера начали разбазаривать функции уникальных интернейронных подгрупп. Несмотря на успехи в мышиных моделях, часто бывает трудно эффективно исследовать ГАМКергических интернейронов коры головного мозга предшественников с молекулярными подходов в естественных условиях. Один важный метод для изучения клеток автономного программирования этих клеток трансплантация MGE клеток в принимающих коры. Эти пересаженные клетки мигрируют широко, дифференцировать,й функционально интегрироваться. Кроме того, MGE клетки могут быть эффективно трансдуцированных лентивирусов непосредственно перед трансплантацией, позволяя множеству молекулярных подходов. Здесь мы подробно протокол эффективно трансдуцировать MGE клетки перед трансплантацией для анализа в естественных условиях, с использованием имеющихся линий Cre-драйвера и Cre-зависимых векторов экспрессии. Этот подход имеет преимущество, поскольку он сочетает в себе точное генетическое манипулирование с возможностью этих клеток для диспергирования после трансплантации, что позволяет более конкретное решение камерного типа в естественных условиях.

Введение

ГАМКергические корковых интернейронов содержат ~ 20-30% нейронов в коре головного мозга млекопитающих, в то время как остальные соответствуют нервной, глутаматергические основные нейроны. Интернейроны весьма разнообразны электрофизиологических свойств, аксона и дендритов морфологии и синаптических таргетирования 1, и дисбаланс в нервной / ингибиторного тона предположили лежать в основе некоторых фенотипов неврологических / нервно-психических расстройств, включая аутизм, шизофрения и эпилепсия 2. Общая цель протокола, описанного в настоящем документе, чтобы обеспечить средства, чтобы эффективно генетически модифицировать ГАМКергических интернейронов коры перед трансплантацией клеток-предшественников для анализа в естественных условиях.

Корковая ГАМКергические интернейронов рождаются в медиальных и хвостового ганглиозных возвышения (MGE и КГЭ соответственно) 3,4, а также преоптическом 5. Кортикальные интерней- предшественники переносу на большие расстояния по касательной миграции с последующимрадиальной миграции для достижения своих конечных целей. По прибытии в пункт назначения, эти корковые интернейронов необходимо правильно интегрировать в существующую сеть нейронов, и каждый уникальный интерней- подгруппа будет способствовать корковой схемы в конкретных отношениях. Четыре основные подгруппы можно отличить по молекулярным маркерам: MGE, полученных соматостатина (SST) + и парвальбумина (PV) + подгруппы, и КГЭ, полученных вазоактивный кишечный пептид (VIP) + и Рилин +; SST - подгруппы 6. Различные корковые интерней- подгруппы рождаются по различным раза во время эмбрионального развития в MGE и КГЭ 7, 8. Эти и другие корковые ГАМКергические интерней- маркеры были использованы для создания определенной линии Cre-драйвера для многих из этих подгрупп 9-11.

Трансплантация MGE предшественников стала потенциальной клеточной терапии для лечения заболеваний, которые могут быть вызваны дисбалансомв возбуждения / торможения 12 - 24. Эти терапевтические преимущества могут быть отчасти из-за уникальной способности MGE предшественников (для разгона, дифференцировать и интегрировать в принимающей мозга), или потенциально, потому что многие пригородных соматические ингибирующее PV + клетки получают из MGE. MGE клетки также могут быть быстро и эффективно трансдуцированных лентивирусов перед трансплантацией 15, что позволяет клетки, генетически модифицированные в пробирке быть изучены в естественных условиях. Причиной разработки этого подхода в том, чтобы преодолеть препятствия в изучении GABAergic развития коры межнейронных и созревание. В частности, трансплантация MGE позволило исследователям изучить развитие мутантных клеток в естественных условиях, когда мутантных мышей имели бы умерли в раннем момент времени. Кроме того, путем введения генов, представляющих интерес перед трансплантацией, эффекты специфических генов на фенотип мутантного может быть оценена в эффциент образом.

Здесь мы предоставляем подробный протокол трансдуцировать MGE клетки лентивирусы до трансплантации. Кроме того, показано, как этот метод может быть адаптирован для экспрессии интересующего гена в конкретных интернейронов подгрупп из гетерогенной группе кортикальных предшественников интернейронов, используя комбинацию Cre-зависимых лентивирусов экспрессии и доступных линий мышей Cre-драйвера. Кроме того, этот протокол вводит методы и платформы для исследователей генетически модифицировать ГАМКергические корковых интернейронов предшественники для естественных условиях исследования в в уникальном пути. Одним из преимуществ этого метода по сравнению с другими текущими подходами в том, что трансплантированные клетки MGE разгона от места инъекции. Кроме того, в отличие от координационных вирусных инъекций, после MGE клетки расходятся их морфология легче оценить. Этот подход может быть использован для изучения влияния введения генов, представляющих интерес в дикого типа или мутантных клеток, представляя тип клеток конкретныхрепортер, чтобы оценить морфологию, или потенциально, чтобы изучить влияние аллелей болезни в естественных условиях.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Заявление по этике: Следующие процедуры были одобрены нашего протокола учреждения и животных. Убедитесь в том, чтобы получить одобрение для всех процедур, связанных операций выживания перед началом экспериментов и проверить все протоколы до настоящего времени.

1. Лентивирус Подготовка (Необязательный шаг)

  1. Разделение три 10 см пластины HEK293T клеток для каждого лентивирусов должны быть сделаны, в присутствии 10 мл DMEM / 10% FBS, и расти до ~ 60-70% слияния. Рост клеток в инкубатор при 37 ° C с 5% CO 2.
  2. Трансфекции следующие плазмиды ДНК (10 мкг общего количества) в каждой пластине с использованием любого реагента для трансфекции: 6,4 мкг CAG-Flex-GFP лентивирусов вектор (вектор ДНК последовательность, указанную в таблице 1), 1,2 мкг pMD2.G (кодирует VSV-G), 1,2 мкг ВКПП-Rev, и 1,2 мкг pMDLg / pRRE. Три лентивирусов упаковки векторы являются коммерчески доступными (табл
    Примечание: Данный подход использует поколения lentivir 3-йAl векторы но векторы 2-го поколения и связанные с ними плазмиды также будет работать.
  3. Подготовьте контейнер для отходов, содержащий 10% раствор отбеливателя в пределах BSL2 сертифицирована капотом для инактивации любых решений или устройства, которые контактируют или содержат лентивирус. Далее, полностью извлечь медиа-4-6 ч после трансфекции в раствор отбеливателя, заменить с тем же объема новых средств массовой информации, а также позволяет клеткам расти.
  4. После 4 дней, собирать средства массовой информации в 50 мл конические пробирки и центрифуги в 1000 мкг в течение 15 мин для осаждения любой мобильный мусора. Далее, супернатант фильтруют через мембрану 0,45 мкм. Любое низким содержанием белка связывания фильтр, как PVDF, работает хорошо. Внимание: Место как твердых, так и жидких вирусная отходов в раствор отбеливателя.
  5. Загрузка 30 мл фильтруют супернатант в Ультрацентрифуга труб и в ультрацентрифуге. Центрифуга при 100000 х г в течение 2,5 ч при 4 ° С. Откройте центрифужные пробирки в BSL2 капотом и удаления надосадочной жидкости в 10% гипохлоритом натрия. Добавить ~ 100 мкл PBS и полиэтиленомLLET, что дает титры 1x10 ^ 7-8 инфекционных единиц / мл. Алиготе на следующий день и хранят при -80 ° С. Лентивирус аликвоты стабильны при -80 ° С в течение по крайней мере шести месяцев.
  6. Важным фактором: многие учреждения в настоящее вирусная ядер. Приобретать концентрированный вирус с минимальным титром 1x10 7 инфекционных единиц / мл, для достижения оптимальных результатов.

2. Донорские Мыши для MGE Вскрытие

  1. Во-первых, создать приурочен спаривания между Cre-экспрессирующих линии, представляющей интерес и либо дикого типа (WT) мыши или мышь, которая будет выражать репортеру после Cre-опосредованного рекомбинации.
    Примечание: Многие линии Cre-драйвера трансгены и поддерживаются и вырос в гемизиготных государства. Таким образом, только половина эмбрионов будет содержать трансген Cre. ДНК может быть быстро получены из эмбрионов в течение короткого ПЦР для обнаружения аллель Cre. В + зародыши Cre затем могут быть собраны таким образом, что только MGE ткань искомого генотипа используется. AlternatiВели, Cre-зависимых репортер может быть использован, чтобы выбрать эмбрионы для MGE вскрытия и трансплантации.
  2. Рассчитать, какой день будет соответствовать E13.5. Если животные были в паре накануне вечером, день вилки 0,5. Заказать приурочен беременных мышей или женщина WT с P1 щенков для того, чтобы время имея послеродовой (р) 1 мышей в день донорская ткань будет E13.5. Кроме того, созданы эти вязки в доме за неделю до спаривания животных-доноров.
    Примечание: бывший стратегия формирования как E13.5 и эмбрионов P1 / щенки в тот же день, часто трудно сделать надежно.

3. Подготовка средств массовой информации, инструментов и оборудования.

  1. Подготовка реагентов и инструментов для клеточного препарата MGE (таблица 2).
    1. Подготовьте чистую поверхность и место чистым пинцетом, ножницами и либо микрохирургической нож или тонкий пинцет (для точного рассечения тканей) на поверхности.
    2. Подготовка сбалансированный солевой раствор Хэнка (HBSS), Fили рассечение, и средний модифицированной орла Dulbeco (DMEM) с добавлением 10% фетальной бычьей surem (FBS), для трансдукции.
    3. Preincubate 20-30 мл DMEM / 10% FBS в С тканевой культуры инкубатор 37 ° в течение 1 ч. Крышка должна быть ослаблена для обеспечения газообмена и рН уравновешивания СМИ.
      Примечание: СМИ инкубация может быть получен непосредственно перед началом вскрытия.

4. MGE сотовый Подготовка

  1. Жертвоприношение беременную мышь в соответствии с протоколом, утвержденным животного и удалить эмбрионов в 10 см чашку Петри, содержащую ледяную HBSS.
  2. Удалить мозг от каждого эмбриона с использованием рассекает сферу (сделайте по одному, оставляя остальную часть эмбрионов в ледяной HBSS), а затем приступить к вырезать MGE ткани.
    Примечание: Детальный ниже, и на рисунке 1, являются ключевыми шагами, показывающие, как удалить MGE. Кроме того, на фиг.2 фильм, показывающий всю рассечениеПроцедура.
    1. Установите мозг с вентральной стороной вверх (1А, а '). Примечание: это также хорошо иметь спинной стороной вверх. Разрежьте мозг пополам вдоль сагиттальной плоскости для создания двух штук. Пример hemisected мозг показано на рисунке (1, б, б '), заметим, что спинной (перекрывающие коры) и вентральной стороны крышки головного мозга и окружающие ганглиозный возвышение (GE) ткани.
    2. Далее, с доминирующей рукой, удерживая либо очень тонкий пинцет или stabknife (таблица 2), а иммобилизации полушарие щипцами, проводимых в не доминантной рукой. (Медиальная сторона полушария должна быть направлена ​​вверх). Открываются спинной и брюшной ткани с щипцами и ножевое нож, чтобы выявить основные GE ткани (рис 1С и схемы на рисунке 1С »).
      Примечание: Удаление некоторых средств массовой информации из рассечение чашки Петри может облегчить для стабилизации тканей с одновременным реrforming вскрытие MGE.
    3. Сделать прямые пропилы с stabknife или тонким пинцетом, чтобы отделить КГЭ, LGE и перегородки тканей (смотри пример сокращения, обозначенные красной пунктирной линии, фигуры 1D и D '). Эти сокращения могут быть сделаны в любом порядке.
      Примечание: Представьте себе MGE как «ящик», который вырезают из окружающих тканей. Это помогает воспроизводимо сделать подобные сокращения для каждого вскрытия, тем самым уменьшая изменчивость в ткани вскрытия.
    4. Наконец, поверните MGE на бок и обрезать дно (то, что было латеральной поверхности мозга). Это устраняет мантии зону MGE (отбросить на фиг 1E и 1E ') от остальной части MGE. Оставшиеся аспект MGE содержит первую очередь желудочка зоны и субвентрикулярной зоне частей MGE, который содержит почти все клетки-предшественники MGE. Продолжайте этой ткани.
  3. Важным фактором: Добавление силиконового геля на дно чашки Петри CAп послужить отличным поверхности вскрытия, как он защищает деликатные кончики щипцов и обеспечивает мягкую поверхность для закрепления ткани с щипцами.

4,3 Дополнительные стратегии для MGE вскрытия.

  1. Разрежьте кожу эмбриона с помощью щипцов, как ножницы, чтобы быстро удалить мозг. Как эмбрион лежит на боку, удерживать ткань у основания головки с щипцов, используемых для закрепления ткани. Во-первых, сократить передней брюшной мозг и задней брюшной головного мозга, а затем соединить два надреза вдоль стороне эмбриона. Затем берем лоскут кожи и вытяните ее поверх головного мозга. Мозг может быть быстро рассекали от остальной ткани.
  2. Кроме того, якорь задней поверхности весь мозг за кору. Между тем, возьмитесь каждого полушария на самом спинной каудальной коры и разорвать кору от прижатого ткани в передней направлении. Таким образом, как сortices могут быть удалены и двусторонние ганглиозные возвышения выявлены, еще привязаны к остальной ткани с сохранением медиальной-боковой анатомии.
  3. Переключитесь на колото-нож, чтобы сделать точные разрезы вокруг MGE на каждом полушарии. Используйте либо отдельный чистый набор щипцов, чтобы собрать MGE или пипетки с большим наконечником (IE., P1000).
    Примечание: Имейте собранную ткань от всех других расчлененный материала, так как некоторые средства массовой информации неизбежно передаются при MGE собирается.
  4. Сбор MGE и поместить ткани в 1,5 мл пробирку, содержащую DMEM / 10% FBS, (объем 500 мкл достаточно, чтобы собрать МГЭС). Повторите для другой полушарии и в том же пробирку. Хранить образцы на льду, пока все ткани не собирали.

5. Lentiviral маркировки и трансплантации

  1. Перемещение трубки MGE ткани в BSL2 сертифицирована кожуха, снять СМИ.
    Примечание:MGE ткани является достаточно большим, чтобы быть видимым для глаз и оседают на дне пробирки, позволяющей холодные медиа, чтобы быть легко и аккуратно удалены.
  2. Добавить ~ 500 мкл DMEM / 10% FBS сред, которые предварительно инкубировали в 37 ° С инкубаторе тканевых культур в. Затем добавьте полибрена, чтобы облегчить трансдукции в каждую пробирку при конечной концентрации 8 мкг / мл. Растирают MGE ткани для создания суспензии отдельных клеток, используя наконечник пипетки P1000. И, наконец, добавляют ~ 15-20 мкл концентрированной лентивирусов в каждую пробирку.
  3. Важно соображение: растирание в 10-12 раз достаточно, чтобы разбить MGE ткани из одного эмбриона, но больше растираний может потребоваться, если несколько МГЭС, собирают вместе. Попробуйте различные условия растирание, чтобы определить, что работает лучше всего.
  4. Плотно закройте каждую пробирку, инвертировать перемешать, чем место все трубки в 37 ° C инкубатора. Инкубируйте клетки в лентивирусов, по крайней мере, 30 мин до 1 ч. Более длительные времена привели к десминаться жизнеспособность клеток. Обратить трубок каждые 10 мин, пока время не истекло.
  5. После инкубации с лентивирусов, удалить трубы из инкубатора и центрифуги при ~ 700 мкг в течение 3 мин для осаждения клеток. В BSL2 капотом, удалить супернатант и отбросить в 10% хлорной извести. Затем добавьте 1 мл DMEM / 10% FBS и растирают осадок 2-3 раза, чтобы промыть, а затем снова центрифуге с той же скоростью для осаждения клеток. Повторите эту Вымойте шаг еще 2-3 раза, чтобы удалить лишнюю вирус.
    Примечание: Выполнение шага центрифугирования при 4 ° С, однако, снижение выживаемости не наблюдалось, когда короткие спины выполняются при комнатной температуре.
  6. После последней промывки, удалить как можно больше средств массовой информации, насколько это возможно, и поместить каждую пробирку на льду. В связи с остаточной массовой информации по бокам трубки, ~ 2-3 мкл среды в конечном итоге охватывающих осадок клеток к тому времени, процедура трансплантации началась.

6. Трансплантация и проверка

  1. Приобретать хостов P1 щенков и подготовить процедуруПлощадь распылением вниз с 70% этанола. Для поддержания стерильности во время процедуры рекомендуется выполнять эти процедуры в отдельном чистом процедурной комнате. Кроме того, использование либо в автоклаве хирургические инструменты стерилизовать поверхности, что щенки будут находиться в контакте с помощью 70% этанола. Пример репрезентативной оборудования, необходимого для выполнения трансплантации и репрезентативную площадь процедура показана на рисунке 3.

Примечание: Хотя эта процедура является введение небольших объемах, а не хирургическая процедура, которая потребует разрез, открытая рана или швы, он по-прежнему рекомендуется новый микропипетка используется для каждой мыши, который будет введен. В микропипетки термически стерилизуют при тянули и скошенный на поверхности, опрыскивали 70% -ным этанолом хранится в герметичном контейнере.

  1. Генерация микропипетки, чтобы иметь диаметр на конце между 40-80 мкм. После этих размеров даст оптимальныйРезультаты. Тепло стерилизации микропипетки когда вытащил фаски на поверхности и спрей с 70% этанола до сохранения микропипетки в герметичном контейнере.
    Примечание: В качестве альтернативы, если доступ к устройствам, необходимым для создания этих игл (таблица 2) ограничивает, использовать любое другое устройство впрыска. Тем не менее, это может быть не так хорошо подходит в качестве микропипетки из-за разных диаметров.
  2. Составьте минеральное масло в 1 мл шприц, и с 30 1/2 G иглы, заполните стеклянную пипетку полностью с минеральным маслом. Далее, установите поршень на стереотаксической устройства, а затем прикрепить стеклянную пипетку для стереотаксической устройства и нагрузки на поршень. Использование гидравлического привода, переместите поршень примерно до половины в стеклянной пипетки, удаление минеральное масло, которые распространяются с чистой чистой бумажной салфеткой.
    1. В качестве альтернативы с помощью шприца, погрузить задний конец пипетки в минеральном масле и заполнения под действием капиллярных сил. Для предотвращения воздушных пузырьков в pipettе, поддерживать положительное давление на шприц до полного выхода из стеклянной пипетки.
      Примечание: Другие устройства могут быть использованы для успешного трансплантации клеток MGE 14. Любое устройство, которое может доставить объем меньше или около 100 нл хорошо работает для этой процедуры.
  3. Затем, используя стерильную салфетку или любой впитывающий материал, с угловой скручены в тонкости деликатно удалить избыток носителя выше осадку клеток MGE. Этот шаг концентрирует плотность клеток таким образом, что меньшие объемы впрыска может быть достигнута. Затем, используя низкий объем (P2 является предпочтительным) пипетка медленно составить осадок клеток и растереть 1-2 раза, прежде чем перейти к клеточной суспензии на гидрофобной поверхности. Объем должен быть чуть меньше 1 мкл. Перемещение кончик иглы в суспензию клеток и с помощью гидравлического привода, составление клеточной суспензии в пипетку.
  4. Анестезировать Р1 щенка через гипотермии (завернуть в латексные перчатки и положил на льду в течение ~ 2-4 мин).Проверьте эффективность анестезии с болевые раздражители. Зажмите кожу между пальцами с тонким пинцетом: щенок должен быть не отвечает, если зажат. Далее, поместите щенка на форму, которая находится под инъекционного устройства, а затем сделать кожу в натянутом состоянии, потянув назад кожу на голове и обеспечения со стандартным лабораторным ленты.
    Примечание: При гипотермии является очень эффективным на новорожденных мышах и приводит к низкой смертности, процедуры должно быть сделано быстро, как щенки начнут восстанавливаться в соответствии с 10 мин. Кроме того, 4 мин на льду верхний предел того, что может быть терпимо. Попробуйте только вызвать гипотермию сразу, если требуется больше времени для инъекций. Однако, если щенок восстанавливает рано, сначала позвольте щенку, чтобы полностью восстановиться, прежде чем заставить гипотермии снова. Кроме того, только вызвать гипотермию еще раз для выполнения инъекций. Щенки будут восстанавливаться в течение 5-10 мин гипотермии. Это может быть облегчено путем размещения щенков с подстилкой и мама или путем размещения щенка на теплое Surfacе, чтобы восстановиться.
  5. Использование стереотаксической устройства, положение кончика стеклянной пипетки на поверхность на голову щенка, перпендикулярной к поверхности головки. Когда пипетку находится в контакте с головой, рассмотреть это как '0'. Далее, нажать пипетку через поверхность кожи и черепа в коре головного мозга, а затем вставить и убрать пипетку ~ 2 раза до остановки. Для оптимального таргетинга клеток в коре головного мозга, инъекции выполняются при микропипетка находится на глубине 0,1 мм. Тем не менее, это должно быть оптимизировано пользователем (смотрите примечание ниже).
    Примечание: В то время как эта глубина надежно цели глубже неокортекса слоев с устройствами, описанными выше, несколько глубины должны быть проверены определены эмпирически. Кроме того, диапазон глубин при различных ростро-хвостового и Medio-боковом положении, должны быть проверены, чтобы определить, что глубина является оптимальной в каждом месте. Кроме того, начальная прокол должен быть быстрым, как медленно, проникновение в коре головного мозга уменьшает способность к Сleanly проникать в ткани. Попробуйте разные скорости, при первом запуске эту процедуру, чтобы найти то, что работает лучше всего. Кроме того, для тестирования координат, нет реальной альтернативы для использования меченых клеток, как красители были ненадежны, чтобы обозначить положение.
  6. После того, как игла находится в положении, повернуть гидравлического устройства, чтобы продвигать плунжер в стеклянной пипетки, толкая заданного объема клеточной суспензии в коре головного мозга. Вводите 50-70 NLS для каждого сайта. Повторите эту процедуру на 3-6 различных сайтов на разных ростральных-каудальном уровне, если цель состоит в том, чтобы получить широкое распространение клеток по всему неокортекса.
    Примечание: Объемы 100 нл или более может вызвать повреждения и привести к крупных комков, инъецированных клеток, которые не эффективно мигрировать из места инъекции. Таким образом, меньшие объемы впрыска (~ 70 п или меньше) являются оптимальными, по сравнению с более сайтов, если позволяет время.
  7. Когда инъекции являются полными, удалить щенка со сцены и отметьте его (палец отсечение надежный способ определить рИБП позже). После того, как щенок оправился от болезни и в состоянии двигаться сам по себе (это происходит в течение нескольких минут их устранения со сцены), положил его обратно с мамой и мусора.
    Примечание: Поскольку это минимально инвазивная процедура, нет послеоперационные процедуры один раз щенок свободно движущиеся и нагревают. Тем не менее, щенки должны быть проверены не только после процедуры, но и на следующий день, чтобы убедиться, что они не имеют никаких признаков ухудшения здоровья.
  8. Перед началом процедуры на следующий щенка, спрей вниз область с 70% этанола, чтобы поддерживать стерильную рабочую зону. Разрешить введенные щенков в разработке, а затем оценить ткани на соответствующем этапе (ы) развития.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

С MGE клетки обладают уникальной способностью мигрировать и интеграции при пересадке в принимающей неокортекса 16, они обеспечивают отличную модель системы генетических манипуляций перед исследований в естественных условиях. Здесь мы покажем, как можно выделить MGE ткани от E13.5 эмбрионов (рис 1 и 2), которые затем могут быть трансдуцировали лентивирусы либо в пробирке или в быстрой манере перед трансплантацией для исследований в естественных условиях. Маркировка M...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Использование GABAergic прекурсоров корковых интернейронов из эмбриональных ганглиозных возвышения (GES) для сотовых терапии на основе показывает обещание для многих условий 12 -1 4. Точные молекулярные методы необходимы, чтобы отслеживать и выразить интерес генов в конкретных интернейронных подгрупп. Здесь мы предлагаем подробный протокол для маркировки эмбриональных MGE клетки лентивирусы до трансплантации и показать, как эта техника может быть использована, чтобы выразить интерес генов в специфических корк...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

Эта работа была поддержана грантами на JLRR от: Аутизм Говорит, Нина Ирландия, Weston Пристани Фонд, NiMH R01 MH081880 и NIMH R37 MH049428. PRW была поддержана общение Национального научного совета Тайваня. SFS была поддержана F32 (MH103003).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Реагенты и оборудование для трансплантации клеток MGE
шприц1 мл REF 309602BD, Becton Dickinson and company
30 1/2 G игла305106BD, Becton Dickinson и компания
Precision bore для доставки 5 & микро; l (идет с поршнем)5-000-1005Drummond научная компания
ParafilmPM-999Polysciences, Inc.
Стереомикроскоп со штангой **MZ6Leica
Digital только для мышей стереотаксический прибор **51725DStoelting company
Одноосный масляный гидравлический тонкий микроманипулятор **MO-10Narishige
Роторный фаскасобственного производства
Игольчатый пипетка съемник730Kopf инструменты
Минеральное маслоЛюбая аптека или аптека
Любая пипетка и наконечники, которые могут надежно измерить 1&микро; l объема
** Это конкретные модели, которые мы используем, но многие другие настройки должны работать
Необязательные реагенты (для создания лентивирусов)
25 мм, 0.45 &микро; m фильтр09-719BFisher Scientific
Ультрапрозрачные центрифужные пробирки (25 x 89 мм)344058Beckman Coulter®
Lipofectamine 2000 (объем 1,5 мл)11668019Invitrogen
Другие коммерчески доступные расходные материалы
pMDLg/pRRE с кодированием плазмиды gag/pol12251Addgene
pRSV-Rev с кодировкой плазмиды Rev12253Addgene
pMD2.G с кодировкой плазмиды VSVG12259Addgene
pAAV-Flex-GFP28304Addgene
с алмазным покрытием

Ссылки

  1. Huang, Z. J., Di Cristo, G., Ango, F. Development of GABA innervation in the cerebral and cerebellar cortices. Nat. Rev. Neurosci. 8 (9), 673-686 (2007).
  2. Rubenstein, J. L. R., Merzenich, M. M. Model of autism: increased ratio of excitation/inhibition in key neural systems. Genes, brain, and behavior. 2 (5), 255-267 (2003).
  3. Anderson, S. A., Eisenstat, D. D., Shi, L., Rubenstein, J. L. Interneuron migration from basal forebrain to neocortex: dependence on Dlx genes. Science. 278 (5337), 474-476 (1997).
  4. Wonders, C. P., Anderson, S. A. The origin and specification of cortical interneurons. Nat. Rev. Neurosci. 7 (9), 687-696 (2006).
  5. Gelman, D., et al. A Wide Diversity of Cortical GABAergic Interneurons Derives from the Embryonic Preoptic Area. J. Neurosci. 31 (46), 16570-16580 (2011).
  6. Miyoshi, G., et al. Genetic fate mapping reveals that the caudal ganglionic eminence produces a large and diverse population of superficial cortical interneurons. J. Neurosci. 30 (5), 1582-1594 (2010).
  7. Batista-Brito, R., Fishell, G. The developmental integration of cortical interneurons into a functional network. Curr. Top. Dev. Bio. 87, 81-118 (2009).
  8. Inan, M., Welagen, J., Anderson, S. A. Spatial and Temporal Bias in the Mitotic Origins of Somatostatin. and Parvalbumin-Expressing Interneuron Subgroups and the Chandelier Subtype in the Medial Ganglionic. 22 (4), 820-827 (2012).
  9. Taniguchi, H., et al. A Resource of Cre Driver Lines for Genetic Targeting of GABAergic Neurons in Cerebral Cortex. Neuron. 71 (6), 995-1013 (2011).
  10. Madisen, L., et al. A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain. Nature Neuroscience. 13 (1), 133-140 (2010).
  11. Hippenmeyer, S. A developmental switch in the response of DRG neurons to ETS transcription factor signaling. PLoS Bio. 3 (5), e159(2005).
  12. Southwell, D. G., et al. Interneurons from embryonic development to cell-based therapy. Science. 344 (6180), 1240622(2014).
  13. Hunt, R. F., Girskis, K. M., Rubenstein, J. L., Alvarez-Buylla, A., Baraban, S. C. GABA progenitors grafted into the adult epileptic brain control seizures and abnormal. Nature Neuroscience. 16 (6), 692-697 (2013).
  14. Braz, J. M., et al. Forebrain GABAergic Neuron Precursors Integrate into Adult Spinal Cord and Reduce Injury-Induced Neuropathic Pain. Neuron. 74, 663-675 (2012).
  15. Vogt, D., et al. Lhx6 Directly Regulates Arx and CXCR7 to Determine Cortical Interneuron Fate and Laminar Position. Neuron. 82 (2), 350-364 (2014).
  16. Alvarez-Dolado, M., et al. Cortical inhibition modified by embryonic neural precursors grafted into the postnatal brain. J. Neurosci. 26 (4), 7380-7389 (2006).
  17. Du, T., Xu, Q., Ocbina, P. J., Anderson, S. A. NKX2.1 specifies cortical interneuron fate by activating Lhx6. Development. 135 (8), 1559-1567 (2008).
  18. Arguello, A., et al. Dapper Antagonist of Catenin-1 Cooperates with Dishevelled-1 during Postsynaptic Development in Mouse Forebrain GABAergic Interneurons. PLoS ONE. 8 (6), e67679(2013).
  19. Lee, A., et al. Pyramidal neurons in prefrontal cortex receive subtype-specific forms of excitation and inhibition. Neuron. 81 (1), 61-68 (2014).
  20. Chen, Y. J. J., et al. Use of “MGE Enhancers” for Labeling and Selection of Embryonic Stem Cell-Derived Medial Ganglionic Eminence (MGE) Progenitors and Neurons. PLoS ONE. 8 (5), e61956(2013).
  21. Pattabiraman, K. Transcriptional regulation of enhancers active in protodomains of the developing cerebral cortex. Neuron. 82 (5), 989-1003 (2014).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Лентивирусная трансдукциятрансплантация клетокГАМК-ергические интернейроныстереотаксическая инъекцияфлуоресцентная микроскопияCre-драйверные линииизоляция клетоквирусное мечение
Вирусный-опосредованной маркировки и трансплантации медиальной ганглиозные Высокопреосвященства (MGE) Клетки для
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.