Методическая статья

Применение ДНК-специфичных красителей метиловым зеленым в Флуоресцентная маркировка эмбрионов

DOI:

10.3791/52769

⸱

2 мая 2015 г.

 ,  ,  , 
1Institut Pasteur de Montevideo, 2Sección Biología Celular, Facultad de Ciencias, Universidad de la República

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Описан метод флуоресцентного окрашивания фиксированного биологического материала специфической метиловой метиловой меткой. Метиловый зеленый используется в разбавленном водном растворе и очень устойчив к фотообесцвечиванию. Его дальнее красное излучение позволяет проводить глубокую визуализацию образцов, что делает его особенно подходящим для целых эмбрионов.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Метиловый зеленый уже давно известен как гистологическое окрашивание со специфическим сродством к ДНК, хотя его флуоресцентные свойства до недавнего времени оставались неизученными. В этой статье мы проиллюстрируем способ приготовления метилового зеленого водного исходного раствора, который в разбавлении может быть использован в качестве очень удобной флуоресцентной ядерной метки для фиксированных клеток и тканей. В статье подробно описаны простые процедуры маркировки целых эмбрионов рыбок данио и цыплят, а также показаны примеры полученных изображений. Метиловый зеленый максимально возбуждается красным светом на длине волны 633 нм и излучает с относительно острым спектром, достигающим максимума на длине волны 677 нм. Он очень недорогой, нетоксичный, высокостабилен в растворе и очень устойчив к фотообесцвечиванию при связывании с ДНК. Его красное излучение позволяет получать сканирующую конфокальную визуализацию ядер в толстых образцах без изменений высокого разрешения. Наконец, этот протокол окрашивания метил-зеленым совместим с другими процедурами окрашивания клеток, такими как мечение антител или мечение актиновых филаментов фаллоидином, конъюгированным с флуорофором.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Флуоресцентное окрашивание ДНК широко и рутинно используется как в биологических исследованиях, так и в клинической диагностике, либо для детального изучения ядерной и хромосомной структуры, для противостоящего окрашивания тканей и клеток, либо для изучения параметров клеточного цикла1. Несмотря на то, что существует несколько красителей ДНК, наиболее широко используются те, которые возбуждаются ультрафиолетовым светом и излучают синий цвет, которые вписываются в обычные системы с тремя фильтрами, используемые в большинстве обычных эпифлуоресцентных микроскопов в сочетании с зелеными и оранжево-красными флуорофорами, такими как флуоресцентные белки или небольшие молекулы, прикрепленные к антителам. Среди этих окрашиваний ДНК, выделяющих синий цвет, наиболее распространенными являются DAPI и второстепенные бороздки-связывающие агентыHoechst 2,3. Тем не менее, использование широкого спектра лазерных линий излучения и спектрального детектирования в лазерных сканирующих микроскопах позволило исследователям выбрать для использования ядерные красители, излучающие дальний красный цвет, такие как йодид пропидия (PI) или TO-PRO 34. Преимущество этих красителей заключается в том, что они решают проблему аутофлуоресценции, обнаруженную во многих клетках и тканях, особенно у эмбрионов, но многие из них имеют различные проблемы, такие как широкие профили излучения или высокая чувствительность к фотообесцвечиванию.

Швейцарский исследователь Фридрих Мишер открыл ДНК в 1869 году, извлекая ее из ядер белых кровяных телец, обнаруженных в гное. Он назвал его нуклеином, а несколько лет спустя показал, что он образует осадки с относительно новым красителем метилового зеленого. Метиловый зеленый состоит из трех анилиновых колец с разной степенью метилирования и имеет два положительных заряда, которые позволяют ему прочно связываться с главной бороздкой ДНК7,8. Окрашивание ДНК метильным зеленым цветом было очень рано показано как специфичное, что привело к разработке Унной и Паппенгеймом комбинированного окрашивания с пиронином, который специфически маркирует РНК. С тех пор метил-зеленый пиронин широко используется в рутинной гистологической технике9.

До недавнего времени очень мало было известно о флуоресцентных свойствах метилового зеленого. Наша предыдущая работа, однако, выявила некоторые спектральныепреимущества метилового зеленого цвета6, такие как его возбуждение на длине волны 633 нм, удобный сдвиг Стокса, его излучение в ближней инфракрасной части электромагнитного спектра, более высокая фотостабильность по сравнению с коммерчески доступными красителями ДНК с аналогичными спектральными свойствами и при очень низкой стоимости. Вот почему мы решили протестировать его на использование в качестве очень высокоаффинной и специфической флуоресцентной метки для ДНК на эмбриональных тканях и в целых эмбрионах. Кроме того, до сих пор окрашивание ядра метиловым зеленым проводилось при низком pH, что затрудняло его совмещение с окрашиванием антителами. Цель метода, подробно описанного здесь, состоит в том, чтобы разработать протокол для окрашивания флуоресцентной ядерной ДНК, который преодолевает вышеупомянутые неудобства, выполняя процедуру окрашивания при физиологическом pH, что делает его подходящим противовесом для иммуномаркирования на срезах и целых тканях.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Очистка красителя

  1. Подготовка 4% -ный водный раствор метиловым зеленым при растворении 0,4 г порошка красителя в 10 мл дистиллированной воды. Смешивайте до полного его растворения.
  2. Под вытяжного шкафа, смешать его с, по крайней мере 2-х частей хлороформа. Важно заранее проверить трубы, являются ли хлороформ устойчивостью.
  3. Тщательно перемешать и центрифугировать в течение 1 мин при 2000 х г чтобы ускорить разделение фаз.
  4. После центрифугирования верхнюю водную фазу метиловым зеленым, и ниже, органическую фазу с хлороформом и обычно загрязнителем кристаллический фиолетовый получены.
  5. Восстановление верхней фазы и повторите этот шаг, пока нижняя фаза не появляется полностью лишенный кристаллического фиолетового.
  6. В конце концов, верхнюю фазу и разбавляли водой до конечной концентрации 2% метиловым зеленым. Этот исходный раствор стабилен на верстаке в течение нескольких месяцев, и не должны быть защищены от света.

2. Люминесцентная ядерной Окрашивание всей данио рерио эмбрионов с помощью метиловым зеленым

  1. Исправление эмбрионов в течение ночи в 4% формальдегиде (с параформальдегидом) в фосфатном буферном растворе (PBS).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это может занять от нескольких часов до ночи в зависимости от толщины эмбрионов. В примере, мы зафиксировали 48 часов после оплодотворения (ФВЧ) данио эмбрионов в течение ночи.
  2. Промыть эмбрионы три раза в PBS-T (1% Тритон Х-100 в PBS) в течение 5 мин. Повышенная концентрация моющего средства permeabilizes кутикулу.
  3. Подготовьте 1: 5,000-1: 10,000 решение метиловым зеленым (от 2% раствора) в PBS-T. Наличие моющего средства во время инкубации полезен для толстых образцов, таких как эмбрионов данио и личинок.
  4. Инкубируйте эмбрионов в растворе в течение по крайней мере 6 ч при температуре 4 ° С при осторожном качания. Опять же, толщина эмбриона является параметром для калибрования длины инкубации.
  5. Вымойте эмбрионов 3 TIMES с PBS в течение 30 мин, чтобы удалить избыток моющего средства. Метил зеленая флуоресценция проявляется только при связывании с ДНК, следовательно, фон от несвязанного молекулы является незначительным.
  6. Mount на раскопки слайда или самодельной камеры с монтажной раствора (75% глицерина, 0,1 М Трис HCl рН · 8).
    Примечание: Если ядерный окрашивание должно быть выполнено после того, как иммунноокрашивания, метиловым зеленым, могут быть включены в монтажной раствора в рабочей концентрации, при этом нет необходимости смыть.
  7. Храните в холодильнике или начать визуализацию сразу. Выполнение визуализации с лазерной сканирующей конфокальной (или другого флуоресценции) микроскопа с возбуждением при 633 нм и эмиссии фильтров, установленных зарегистрироваться на 650-750 нм с учетом того, метиловым зеленым выбросов достигает максимума при 677 нм.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Мы предоставляем измеренные данные метилового зеленого профиль излучения, чтобы быть загружены в программу приобретения, в качестве дополнительного материала.

3. Люминесцентные ядерной СанктAining всей куриных эмбрионов с помощью метиловым зеленым

  1. Выдержите оплодотворенных куриных яиц на сцену интересов. Исправление эмбрионов в течение ночи в 4% формальдегиде (с параформальдегидом в PBS) при 4 ° С. Промыть 3 раза эмбрионов в PBS-T в течение 2 ч.
  2. Подготовьте 1: 5,000-1: 10,000 решение метиловым зеленым (от 2% раствора) в PBS-T. Инкубируйте эмбрионов в красящим раствором в течение ночи при 4 ° С. Вымойте эмбрионов 3 раза в PBS, 1 ч каждый. Крепление в камере с 75% глицерина, 0,1 М Трис, рН 8.

4. изображений Флуоресцентно меченых ядер в целом монтажа эмбрионов

  1. Подготовка камеры изображения, придерживаясь несколько слоев изоленты на предметное стекло и осторожно вырезать отверстие в ней с помощью скальпеля на место эмбрионов в. Это позволит предотвратить эмбрионов от дробления во время съемки.
  2. Тщательно передачи эмбрионов в камеру изображения и заполнить камеру к вершине с 75% глицерина, 0,1 М Трис-HCl, рН = 8недействительными образование пузырьков.
  3. Накрыть # 0 покровное избежать или устранить средний перетекание. Печать его с лаком для ногтей.
  4. Получение изображений образца на флуоресцентный микроскоп оснащен фильтром 633 возбуждения или лазерной линии.
    ПРИМЕЧАНИЕ: фильтры выбросов должна охватывать максимум 677 излучения метиловым зеленым.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ядерная окрашивание толстых образцах. Протокол описано позволяет для достижения однородной окраски глубинных структур в целом эмбрионов. Развивающиеся объектив ядра образуют 48 эмбрионы рыбок данио HPF однородно помечены (рис 1).

Метил зеленый окрашивание ДНК позволяет дискриминацию клеточного цикла зависимых морфологических различий, таких как идентификация фигуры митоза или апоптоза ядер (рис 2А). Субъядерных структуры с высоким разрешением также очевидны,...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Прогрессивное развитие методов микроскопии в последние десятилетия, с особым акцентом на вариации флуоресцентной микроскопии, привело к возможности изучения динамики и структуры образцов интактных тканей, включая целые эмбрионы10,11. Однако одним из основных ограничений является доступность флуорофоров хорошего качества, которые могут быть использованы для прямого и быстрого окрашивания субклеточных структур.

Наиболее часто используемые флуоресцентные красители ДНК, такие как DAPI ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы хотели бы выразить признательность Паткси Джасо за производство видео, PEDECIBA и Agencia Nacional de Investigación e Innovación (ANII) за частичное финансирование.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
ГлицеринSigma-AldrichG5516
Метиловый зеленыйDr. G. Grüuuml; blerТакже протестирован Sigma-Aldrich 323829, который представляет собой параформальдегид без кристаллов фиолетового
Sigma-Aldrich158127
Лазерная сканирующая конфокальная микроскопия Leica TCS-SP5Leica Microsystems
Phalloidin– Тетраметилродамин B изотиоцианатSigma-Aldrich
P1951 
хлороформSigma-Aldrich372978
центрифуга 5810 Reppendorf5811 000.010   
предметные стекла для микроскопаDeltalabD100004
крышкиEsco оптикаR525025

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Klonisch, T., Wark, L., Hombach-Klonisch, S., Mai, S. Nuclear imaging in three dimensions: a unique tool in cancer research. Annals of anatomy. 192 (5), 292-301 (2010).
  2. Kapuscinski, J. DAPI: a DNA-specific fluorescent probe. Biotechnic. 70 (5), 220-233 (1995).
  3. Latt, S. A., Stetten, G. Spectral studies on 33258 Hoechst and related bisbenzimidazole dyes useful for fluorescent detection of deoxyribonucleic acid synthesis. The journal of histochemistry and cytochemistry. 24 (1), 24-33 (1976).
  4. Van Hooijdonk, C. A., Glade, C. P., Van Erp, P. E. TO-PRO-3 iodide: a novel HeNe laser-excitable DNA stain as an alternative for propidium iodide in multiparameter flow cytometry. Cytometry. 17 (2), 185-189 (1994).
  5. Beumer, T. L., Veenstra, G. J., Hage, W. J., Destrée, O. H. Whole-mount immunohistochemistry on Xenopus embryos using far-red fluorescent dyes. Trends in genetics. 11 (1), 9(1995).
  6. Prieto, D., Aparicio, G., Morande, P. E., Zolessi, F. R. A fast, low cost, and highly efficient fluorescent DNA labeling method using methyl green. Histochemistry and cell biology. 142 (3), 335-345 (2014).
  7. Kim, S. K., Nordén, B. Methyl green. A DNA major-groove binding drug. FEBS letters. 315 (1), 61-64 (1993).
  8. Nordén, B., Tjerneld, F. Binding of methyl green to deoxyribonucleic acid analyzed by linear dichroism. Chemical Physics Letters. 50 (3), 508-512 (1977).
  9. Lyon, H., Jakobsen, P., Andersen, aP. Standardized methyl green-pyronin Y procedures using pure dyes. The Histochemical journal. 18 (2-3), 90-94 (1986).
  10. Amat, F., Keller, P. J. Towards comprehensive cell lineage reconstructions in complex organisms using light-sheet microscopy. Development, growth & differentiation. 55 (4), 563-578 (2013).
  11. Chung, K., Deisseroth, K. CLARITY for mapping the nervous system. Nature methods. 10 (6), 508-5013 (2013).
  12. Lenz, P. Fluorescence measurement in thick tissue layers by linear or nonlinear long-wavelength excitation. Applied. 38 (16), 3662-3669 (1999).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

zebrafishPBST

Похожие статьи