Мы представляем протокол обогащения для выделения бактериофагов, инфицирующих бактерии рода Arthrobacter. Этот протокол обогащения дает быстрые и воспроизводимые результаты для выделения и амплификации фагов Arthrobacter из почвенных изолятов.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Оптимизированная Техника по обогащению для изоляции
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Выделение бактериофагов из образцов окружающей среды выполняется в течение десятилетий с использованием принципов, изложенных пионерами в микробиологии. Выделение фагов, инфицирующих хозяев Arthrobacter, было ограничено, возможно, из-за низкого уровня успеха многих предыдущих методов выделения, в результате чего группа фагов Arthrobacter была недостаточно представлена для изучения. Описанный здесь метод обогащения, в отличие от многих других, использует отфильтрованный экстракт, свободный от загрязняющих бактерий, в качестве основы для роста индикаторных бактерий Arthrobactersp. KY3901, в частности. При первом удалении почвенных бактерий целевые фаги не сталкиваются с конкуренцией с нативными почвенными бактериями, присутствующими в исходных образцах почвы. Этот метод обогащения привел к получению десятков уникальных фагов из нескольких различных типов почв и даже к получению различных типов фагов из одного и того же изолята обогащенного образца почвы. Использование этой процедуры может быть распространено на большинство богатых питательными веществами аэробных сред для выделения фагов в огромном разнообразии интересных бактерий-хозяев.
Введение
Широкое распространение Arthrobacter видов почвенных условиях предлагает огромное количество и разнообразие фагов, способных быть изолированы от этого вида бактерий-хозяев. Бактериальные члены семьи Acintobacteriaceae являются наиболее заметным за их катаболических путей деградации непокорных соединений, таких как атразина и других различных пестицидов и гербицидов 1,2,3. Хотя большинство исследований было сделано с помощью экологических штаммов Arthrobacter, клинические изоляты этого рода находится в крови, моче, глаз и многих других человеческих источников все отображения филогенетическое неоднородность 4.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Подготовка Arthobacter Клетки для фага изоляции
- Культура Arthrobacter Sp. KY3901 колонии штрихом на Лурии Bertaini (LB) агаром инкубировали при 30 ° С в течение 2-3 дней. Выберите колонию и использовать стерильную петлю, чтобы добавить его к 250 мл LB бульоне в экранированной культуры колбу и инкубировать в дрожащей инкубаторе при 225 оборотах в минуту при температуре 30 ° C.
- Разрешить примерно 24 ч роста, чтобы получить поздно показательные / начале стационарной фазы клетки для фаговой инфекции экспериментов. Мониторинг состояния бактериального роста тесно, чтобы предотвратить клетки от ввода в середине и конце стационарного....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Чтобы продемонстрировать воспроизводимость улучшенную методику обогащения для Arthrobacter фагов, 30 различных образцов почвы были в разное время и местах в течение весны и лета 2014 года из этих образцов 30 почвенных уникальные Arthrobacter фаги, полученных из 22 собранных проб почвы с помощью этого обогащения Процедура. Стандартная процедура обогащения были получены уникальные фагов из 3 одинаковых образцов почвы. Образцы обогащения может иметь очень высокую фага титр нуждающихся начальное разбавлени.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Несмотря на многие предыдущие попытки изолировать фаги, способные заражать Arthrobacter хозяев, мы не имел большого успеха, используя стандартные процедуры по обогащению. Обобщенный метод бактериального обогащения разработаны и адаптированы ван Twest и Кропински 10 обогатить фагов из образцов окружающей среды остается основой для большинства обогащению процедур. Данные из предыдущих исследований позволяют предположить, что методы прямого посева дали обнаруживаемых бляшки на штаммах Arthrobacter
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы заявляют никакого конкурирующие финансовые интересы.
Благодарности
Финансирование развития этого протокола была предоставлена Юго-Восточной Пенсильвании консорциума по высшему образованию и Департаментом Cabrini вузовской науки. Дополнительное финансирование и поддержка пришла от Аркадия университета и Непорочной университете. Мы особенно благодарны доктору Карен Snetselaar в Санкт-Иосифа университета за любезно принимая электронно-микроскопических изображений наших изолированных фагов. Дополнительная поддержка была оказана охотников Медицинского института Говарда Хьюза Наука Образование Альянс фага наступающих геномика и эволюционная наука программы (SEA-фаги).
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Бульонный порошок LB | Fisher BP9722-2 | Лучше всего заказывать их оптом. | |
| Гранулированный агар | Fisher | BP1423-2 | Лучше всего заказывать их оптом. |
| 0,22 мкм шприцевые фильтры | Fisher | 09-719A | |
| 0,22 мкм бюхнер | фильтры Fisher | 430320 | Более 50 мл жидкости можно получить, осторожно поменяв местами приемную трубку. |
| Пробирки Eppendorf | Fisher | 05-408-129 | |
| мл пипетки индивидуальные | Fisher | 13-678-11D | |
| 50 мл конические пробирки | Fisher | 76002844 | |
| 15 мл конические пробирки | Fisher | 76002845 | |
| 10 мл пипетки индивидуальные | Fisher | 13-676-10J | |
| 25 мл пипетки индивидуальные | Fisher | 13-676-10K | |
| Ватман качественная фильтровальная бумага | Фишер | 1001-824 |
Ссылки
- Shapir, N., Mongodin, E. F., Sadowsky, M. J., Daugherty, S. C., Nelson, K. E., Wackett, L. P. Evolution of Catabolic Pathways: Genomic Insights into Microbial s-Triazine Metabolism. J Bacteriol. 189 (3), 674-682 (2007).
- Qingyan, L., Ying, L., Xikun, Z., Baoli, C.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
