Методическая статья

Гепатоцитов конкретных абляция в данио рерио по изучению желчных приводом печени Регенерация

DOI:

10.3791/52785

⸱

20 мая 2015 г.

 ,  ,  ,  , 
1Department of Developmental Biology, McGowan Institute for Regenerative Medicine, University of Pittsburgh

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Чтобы помочь оценить молекулярные механизмы, лежащие в основе билиарной регенерации печени рыбок данио-рерио, мы создали модель повреждения печени, в которой гепатоциты, экспрессирующие нитроредуктазу, генетически абляются при лечении метронидазолом. В этом протоколе мы описываем, как умело манипулировать, контролировать и анализировать абляцию гепатоцитов и билиарную регенерацию печени.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Печень имеет большой потенциал к регенерации. Гепатоциты, паренхиматозные клетки печени, могут регенерировать в одном из двух способов: или hepatocyte- желчных приводом регенерации печени. В гепатоцитов приводом регенерации печени, регенерирующие гепатоциты получены из уже существующих гепатоцитов, тогда как в желчных приводом регенерации, регенерирующие гепатоциты получены из желчных эпителиальных клеток (БЭК). Для гепатоцитов приводом регенерации печени, есть отличные модели на грызунах, которые внесли значительный вклад в современном понимании регенерации печени. Однако такой модели грызунов не существует для желчных приводом регенерации печени. Мы недавно сообщили о данио модели повреждения печени, в которой БЭК широко породить гепатоцитов По тяжелой потерей гепатоцитов. В этой модели, гепатоциты специально удалена с помощью фармакогенетических средств. Здесь мы представляем подробно методы абляции гепатоциты и проанализировать БЭК-приводом процесс регенерации печени.Это гепатоцитов конкретных абляция модель может быть дополнительно использованы, чтобы обнаружить основные молекулярные и клеточные механизмы желчных приводом регенерации печени. Кроме того, эти методы могут быть применены к химическим экранов, чтобы определить небольшие молекулы, которые увеличивают или подавляют регенерацию печени.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Печень является высоко регенеративного органом. Во время регенерации печени, регенерации гепатоцитов, паренхиматозные клетки печени, получены из уже существующих гепатоцитов (гепатоцитов приводом регенерации печени) или (БЭК желчных приводом регенерации печени) 1,2. Травмы печени, как правило, вызывает пролиферацию уже существующих гепатоцитов; Однако, когда пролиферации гепатоцитов под угрозу, БЭК может способствовать гепатоцитов 2-4. Эти два способа регенерации печени являются клинически значимыми. По хирургического удаления части печени человека (например, из опухолей печени или живых доноров печени), гепатоциты в оставшейся печени размножаться, чтобы восстановить утраченную массу печени. В отличие от этого, у пациентов с тяжелыми заболеваниями печени, пролиферации гепатоцитов в значительной степени нарушена, так что БЭК или клетки-предшественники печени (LPCS) по всей видимости, способствуют регенерации гепатоцитов 5,6. Грызунов 2/3 частичная резекция печени модель, в которойгепатоциты размножаться, чтобы восстановить утраченную массу печени, внес значительный вклад в современное понимание гепатоцитов приводом регенерации печени 7,8. Тем не менее, нет никаких веских модель грызунов, в котором регенерирующие гепатоциты в основном из БЭК. Хотя несколько моделей грызунов печени токсинов привело к идентификации желчных приводом регенерации печени 2-4, недавние предшественники отслеживания исследования на мышах показывают, минимальный вклад БЭК к регенерации гепатоцитов в этих моделях 9,10. Некоторые из моделей травмы грызунов печени, в том числе частичной гепатэктомии 11-13 и ацетаминофен-индуцированного повреждения печени 14,15, были применены к данио и привело к идентификации новых генов или путей, вовлеченных в регенерации печени. Тем не менее, гепатоцитов приводом, но не БЭК-приводом, регенерация печени происходит в этих рыбок данио модели травмы печени. Таким образом, роман модель травмы печени, в которой БЭК широко способствовать regeneratIng гепатоциты необходим для лучшего понимания БЭК приводом регенерации печени.

Общие цели абляции модели гепатоцитов, описанные здесь, (1), чтобы создать модель травмы печени, в которой БЭК широко способствовать регенерации гепатоцитов, и (2) выяснение молекулярных и клеточных механизмов, лежащих в основе БЭК-приводом регенерации печени. Мы предположили, что тяжесть травмы определяет режим регенерации печени; Таким образом, мы прогнозировали, что желчевыводящих приводом регенерации печени будет инициировать на тяжелой травмы гепатоцитов. Чтобы проверить эту гипотезу, мы разработали модель данио печени травмы путем создания трансгенной линии, ТГ (fabp10a: CFP-НТР) s931, что высоко выражает бактериальной нитроредуктазы (NTR), слитый с голубой флуоресцентный белок (CFP) под гепатоцитов конкретных fabp10a промоутер. С НТР преобразует нетоксичные пролекарства, метронидазол (МТЗ), в цитотоксическим препаратом, он ablates только предназначены NTR-экспрессирующих клеток 16-18, в данном случае, гепатоциты. Манипулируя продолжительность лечения МТЗ, степень гепатоцитов абляции может контролироваться. Используя эту модель, мы недавно сообщили, что на тяжелой потерей гепатоцитов, БЭК широко привести к регенерации гепатоцитов 19, которые дополнительно подтверждается двумя другими независимыми исследованиями 20,21. Таким образом, по сравнению с вышеупомянутой грызунов и данио модели повреждения печени, наша гепатоцитов абляции модель является более выгодным для изучения БЭК приводом регенерации печени.

Этот протокол описывает порядок проведения экспериментов регенерации печени с помощью данио модель гепатоцитов абляции. Эта модель будет уместно для определения механизмов, лежащих желчных приводом регенерации печени и химические экраны, чтобы определить небольшие молекулы, которые могут пресечению или усиливают регенерацию печени.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Данио рерио были подняты и вырос по стандартной методике; Эксперименты были одобрены Университета Питтсбурга Институциональные животных уходу и использованию комитета.

1. Подготовка эмбрионов / личинки

  1. Для проведения приурочен вязки, создать взрослый мужчина и женщина Tg (fabp10a: CFP-NTR) s931 гемизиготных или гомозиготные рыбы O / N и поместить делитель между ними. Удалить Этот делитель на следующее утро, когда спаривание лучшего. Сбор эмбрионов, напрягая воду, используя тонкую фильтр пластиковая сетка.
  2. Поверните фильтр вниз и промыть поверхность сетки с тонкой струйкой яичного воды, распределяемой из бутылки сжатия. Передача 100 эмбрионов в 100 мм чашки Петри с 25 мл яичного воды. Хранить не более 100 эмбрионов в чашку Петри и поднимать их при 28 ° С.
  3. Для подавления пигментации, добавить фенилтиомочевины (ПТУ) в чашках Петри до 10 ч после оплодотворения (ФВЧ), а также повысить еmbryos / личинки до 80 часов после оплодотворения. Конечная концентрация ПТУ 0,2 мм. ВНИМАНИЕ: ПТУ является токсичным. Использование в соответствии с соответствующими руководящими принципами обработки.
  4. Обезболить личинок добавлением 3-амино бензойной кислоты (Tricaine), в конечной концентрации 0,016%, в чашках Петри. Затем, используя микроскоп, эпифлуоресцентной рода СФП-положительных личинок. Использование личинок с аналогичным размером печени и отбросить те, с большей или меньшей печени.
    Примечание: любой КФП-положительных личинки, независимо от интенсивности, могут быть использованы, потому что нет никакой разницы в степени гепатоцитов абляции между гемизиготных и гомозиготной личинок. ВНИМАНИЕ: Tricaine является токсичным. Использование в соответствии с соответствующими руководящими принципами обработки.
  5. Удалить яйца водой, содержащей Tricaine и добавьте яичный воды с добавлением 0,2 мМ ПТУ. Держите эмбрионов / личинки при 28 ° C.

2. Лечение Mtz

  1. Подготовка свежий раствор 10 мМ МТЗ путем растворения 0,171 г порошка МТЗ в 100 мл воды яйцо с добавлением 0,2% ДМСО и 0,2 мМ ПТУ. Для полного растворения МТЗ, перемешать раствор при КТ с быстрым перемешиванием в течение 20-30 минут. Чтобы помочь растворить МТЗ и повышения МТЗ проникновение в личинок, добавить DMSO при подготовке МТЗ. ВНИМАНИЕ: Длительное воздействие или повышение концентрации МТЗ является токсичным. Использование в соответствии с соответствующими руководящими принципами обработки.
  2. Отдельные личинок в контрольных и опытных групп путем передачи требуемого количества личинок в двух разных 100 мм чашки Петри или нескольких луночного планшета. Для экспериментальной группы, держать личинки в 10 мМ раствора МТЗ; в контрольной группе, держать их в яичном воды, содержащей 0,2% ДМСО.
  3. Покрытие пластин или чашки Петри, содержащие раствор MTZ с алюминиевой фольгой, чтобы предотвратить фото-инактивации Mtz, и инкубируют при 28 ° С. Продолжительность лечения зависит от MTZ личиночной стадии и трансгенной линии.
  4. Для наблюдения подобный серьезный гепатоцитов абляции в Tg (fabp10a: CFP-НТР) линия, лечить личинок с решением МТЗ от 3,5 либо дней после оплодотворения (DPF) (продолжительностью 36 часов) или от 5 DPF (продолжительностью в 24 часов).

3. Анализ желчных приводом печени Регенерация

  1. В конце периода абляции, удаления раствора MTZ из пластин. Вымойте МТЗ-обработанного личинок, добавив 25 мл яичного воды. Вихревой пластины 2-3 раза, чтобы промыть личинки, прежде чем выбросить яйцо воды. Повторите три раза, а затем погрузить личинки еще раз в яйце воды. Чтобы избежать сердечного отека и личинок смерть в MTZ-обработанной личинок, добавить низкую концентрацию Tricaine, в конечной концентрации 0,008%, для иммобилизации личинки.
  2. Для анализа печени, изучить размер печени в МТЗ-обработанной личинок под микроскопом эпифлуоресцентной с CFP фильтра. Оценка уровня абляции гепатоцитов, основанные на относительном размере печени: большая (не удалена; 0-10% личинок), средний (частично удалена; 10-20%), и очень мало (полностью удалена; 80-90%).
  3. Удалить личинки с не-абляции или частично удалена печени. Только держите личинок с крошечной печени, что свидетельствует о тяжелой гепатоцитов абляции. Для анализа печени при регенерации 0 раз ч точке (R0h), урожай личинки после МТЗ вымывания и CFP сортировки. В противном случае, держать отсортированный личинок в яичном воды не дополненную 0,2 мМ ПТУ до готовности к уборке урожая.
  4. Передача собранного личинок в 1,5 мл микроцентрифужных трубки и заменить яичный воду с фиксирующем растворе 3% формальдегида в PEM буфера. Инкубируйте пробирку на вращатель O / N при 4 ° С.
  5. Заменить фиксирующем растворе с 1 мл PBSDT и вращать трубки, содержащей личинки на ротатор в течение 5 мин.
  6. Перевести фиксированный личинок в 100 мм чашку Петри, содержащую PBSDT и с помощью щипцов, вручную удалить желток и грудные плавники при вскрытии микроскопом. Трансфер до TP 20 расчлененного личинок в 1,5 мл трубки.
  7. Заменить раствор PBSDT 1 мл блокирующего раствора и рок трубки на ротатор при комнатной температуре в течение 2 часов.
  8. Заменить блокирующего раствора с 100 мкл блокирующего раствора, содержащего первичные антитела. Медленно раскачивать трубки на ротатор O / N при 4 ° С.
  9. Удалить раствор первичного антитела и промыть PBSDT 5 раз в течение 10 мин каждый раз. Затем добавляют 100 мкл блокирующего раствора, содержащего вторичные антитела, и качать его на ротатор при комнатной температуре в течение 2ч.
  10. Вымойте 5 раз с PBSDT на 10 мин каждый раз при комнатной температуре в покачиваясь на ротатора.
  11. Ориентируйте личинок в боковом направлении на предметное стекло микроскопа и добавить каплю монтажных средств массовой информации. Тщательно покрыть их с крышкой стекла и запечатать крышку стекла с ногтей полировщик. Теперь она готова для конфокальной микроскопии.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Лечение Mtz в течение 36 ч (A36h, стоит абляции) от 3,5 до 5 денье резко уменьшенного размера печени (рис 1B). После вымывания МТЗ, рассматривается как начало регенерации печени (R), сильной fabp10a: CFP-NTR и fabp10a: выражение Dsred появился в 30 ч (рис 1B). Внутрипеченочного билиарного сети, как определено по экспрессии ALCAM, который присутствует в мембране БЭК 22, первоначально разрушилась, но была восстановлена ​​в 54 ч после смыва (R54h) (рис ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Тяжелая, но не мягкий, гепатоцитов абляция вызывает желчных приводом регенерации печени. Таким образом, после обработки MTZ и вымывание, важно рассмотреть размер печени в MTZ-обработанной личинок, которые могут быть оценены с помощью собственной флуоресценции CFP от fabp10a: CFP-NTR трансгена. Так небольшой процент от MTZ-обработанной личинок будет отображаться без абляции (0-5%) или частично удалена (10-20%) печень, очень важно, чтобы разобраться и анализировать только личинки с очень небольшим печени, который...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы благодарят докторов Хукриде и Цанга за дискуссии. М.К. получил грант на обучение от NIH (T32EB001026). Эта работа была частично поддержана грантами от Американского фонда печени, Фонда March of Dimes (5-FY12-39) и NIH (DK101426) для D.S.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
3-аминобензойная кислота этиловый эфир (трикаин)порошок Sigma-AldrichA5040Сделайте 0,4% (15 мМ) запаса трикаина: Доведите 0,4 г трикаина до 100 мл с яичной водой. Отрегулируйте pH до 7. 
Диметилсульфоксид (ДМСО)Сигма-ОлдричD8418
МетронидазолСигма-ОлдричM1547
Тритон X-100Сигма-ОлдричT8532
ФормальдегидСигма-Олдрич252549
Дигидрат сульфата кальцияСигма-ОлдричC3771
N-фенилтиомочевина (ПТУ)Сигма-ОлдричP7629
Монтажный носитель (Vectashield)Vector LaboratoriesH-1000
100 x 15 мм чашка Петри Denville Scientific Inc.M5300
прозрачный лак для ногтейFisher Scientific50949071
щипцамиFine Science Tools11251-20Dumont #5 
предметное стеклоFisher Scientific12-544-1
стеклянное покровное стеклоFisher Scientific12-540-A и 12-542-A18 x 18 мм
zn-5 (мышь анти-Alcam)ZIRCzn-51:10 разведение
козы анти-Hnf4aSanta Cruzsc-6556 (C-19)1:50 разведение
крысы анти-RFPаллель биотехнологииACT-CM-MRRFP101:300 разведение
AlexaFluor 647 AffiniPure Donkey Anti-goat IgG (H+L)Jackson laboratories705-605-1471:500 разведение
AlexaFluor 647 AffiniPure Goat Anti-mouse IgG (H+L)InvitrogenA212401:500 разведение
Cy3 осел антикрысиный IgGJackson laboratories712-165-1501:500 разведение
препарирующий микроскопLeica MicrosystemsS6F
эпифлуоресцентный микроскопLeica MicrosystemsM205FA
конфокальный микроскопCarl ZeissLSM700
яичная вода0,3 г/л морской соли ' Мгновенный океан» и 0,5 мМ CaSO4 in дистиллированной воды.
 
 
 
 
 
 
 
 
 
[header]
10X PBS25.6 g Na2HPO4· 7H2O, 80 г NaCl, 2 г KCl, 2 г KH2PO4.  Доведите до 1 л с дистиллированной водой. Отрегулируйте pH 7.  Автоклав в течение 20 мин при температуре 121°С.
1X PBSDT0,2% Triton X-100 и 0,2% ДМСО в 1 X PBS.
Буфер30,2 г ТРУБКИ, 761 мг ЭГТА, 1 мМ MgSO4.  Доведите до 1 л с дистиллированной водой. Отрегулируйте pH 7.
Блокирующий растворСмешайте 1 мл термоинактивированной лошадиной сыворотки с 9 мл 1X PBSDT.
ПЭМ

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Riehle, K. J., Dan, Y. Y., Campbell, J. S., Fausto, N. New concepts in liver regeneration. J Gastroen Hepatol. 26, 203-212 (2011).
  2. Fausto, N., Campbell, J. S. The role of hepatocytes and oval cells in liver regeneration and repopulation. Mechanisms of Development. 120, 117-130 (2003).
  3. Duncan, A. W., Dorrell, C., Grompe, M. Stem Cells and Liver Regeneration. Gastroenterology. 137, 466-481 (2009).
  4. Michalopoulos, G. K. Liver regeneration: Alternative epithelial pathways. Int J Biochem Cell B. 43, 173-179 (2011).
  5. Falkowski, O., et al. Regeneration of hepatocyte 'buds' in cirrhosis from intrabiliary stem cells. Journal of hepatology. 39, 357-364 (2003).
  6. Yoon, S. M., et al. Epithelial Cell Adhesion Molecule (EpCAM) Marks Hepatocytes Newly Derived from Stem/Progenitor Cells in Humans. Hepatology. 53, 964-973 (2011).
  7. Michalopoulos, G. K. Liver regeneration. J Cell Physiol. 213, 286-300 (2007).
  8. Michalopoulos, G. K. Liver Regeneration after Partial Hepatectomy Critical Analysis of Mechanistic Dilemmas. Am J Pathol. 176, 2-13 (2010).
  9. Yanger, K., et al. Adult hepatocytes are generated by self-duplication rather than stem cell differentiation. Cell stem cell. 15, 340-349 (2014).
  10. Schaub, J. R., Malato, Y., Gormond, C., Willenbring, H. Evidence against a Stem Cell Origin of New Hepatocytes in a Common Mouse Model of Chronic Liver Injury. Cell reports. 8, 933-939 (2014).
  11. Dovey, M., et al. Topoisomerase II alpha is required for embryonic development and liver regeneration in zebrafish. Molecular and cellular biology. 29, 3746-3753 (2009).
  12. Goessling, W., et al. APC mutant zebrafish uncover a changing temporal requirement for wnt signaling in liver development. Developmental Biology. 320, 161-174 (2008).
  13. Sadler, K. C., Krahn, K. N., Gaur, N. A., Ukomadu, C. Liver growth in the embryo and during liver regeneration in zebrafish requires the cell cycle regulator, uhrf1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 1570-1575 (2007).
  14. Cox, A. G., et al. S-nitrosothiol signaling regulates liver development and improves outcome following toxic liver injury. Cell reports. 6, 56-69 (2014).
  15. North, T. E., et al. PGE2-regulated wnt signaling and N-acetylcysteine are synergistically hepatoprotective in zebrafish acetaminophen injury. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 17315-17320 (2010).
  16. Curado, S., et al. Conditional targeted cell ablation in zebrafish: A new tool for regeneration studies. Developmental Dynamics. 236, 1025-1035 (2007).
  17. Pisharath, H., Rhee, J. M., Swanson, M. A., Leach, S. D., Parsons, M. J. Targeted ablation of beta cells in the embryonic zebrafish pancreas using E. coli nitroreductase. Mech Dev. 124, 218-229 (2007).
  18. Curado, S., Stainier, D. Y. R., Anderson, R. M. Nitroreductase-mediated cell/tissue ablation in zebrafish: a spatially and temporally controlled ablation method with applications in developmental and regeneration studies. Nat Protoc. 3, 948-954 (2008).
  19. Choi, T. Y., Ninov, N., Stainier, D. Y., Shin, D. Extensive conversion of hepatic biliary epithelial cells to hepatocytes after near total loss of hepatocytes in zebrafish. Gastroenterology. 146, 776-788 (2014).
  20. Huang, M., et al. Antagonistic interaction between Wnt and Notch activity modulates the regenerative capacity of a zebrafish fibrotic liver model. Hepatology. , (2014).
  21. He, J., Lu, H., Zou, Q., Luo, L. Regeneration of liver after extreme hepatocyte loss occurs mainly via biliary transdifferentiation in zebrafish. Gastroenterology. 146, 789-800 (2014).
  22. Sakaguchi, T. F., Sadler, K. C., Crosnier, C., Stainier, D. Y. Endothelial signals modulate hepatocyte apicobasal polarization in zebrafish. Curr Biol. 18, 1565-1571 (2008).
  23. Ninov, N., Borius, M., Stainier, D. Y. R. Different levels of Notch signaling regulate quiescence, renewal and differentiation in pancreatic endocrine progenitors. Development. 139, 1557-1567 (2012).
  24. Lorent, K., Moore, J. C., Siekmann, A. F., Lawson, N., Pack, M. Reiterative use of the notch signal during zebrafish intrahepatic biliary development. Developmental dynamics : an official publication of the American Association of Anatomists. 239, 855-864 (2010).
  25. Itoh, T., Miyajima, A. Liver Regeneration by Stem/Progenitor Cells. Hepatology. 59, 1617-1626 (2014).
  26. Mathias, J. R., Zhang, Z., Saxena, M. T., Mumm, J. S. Enhanced cell-specific ablation in zebrafish using a triple mutant of Escherichia coli nitroreductase. Zebrafish. 11, 85-97 (2014).
  27. Stueck, A. E., Wanless, I. R. Regression of cirrhosis: The maturation sequence of buds arising from hepatocyte progenitor cells. Hepatology. 58, 235A(2013).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

CFP

Похожие статьи