Здесь мы демонстрируем наиболее эффективные методы замораживания, встраивания, криосекции и окрашивания биопсий мышц, чтобы избежать замораживания артефактов.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
И что нельзя делать в подготовке мышц криосрезы для гистологического анализа
* These authors contributed equally
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Гистологическая оценка мышечных биопсий служил в качестве незаменимого инструмента в понимании развития и прогрессирования патологии нервно-мышечных расстройств. Тем не менее, для того, чтобы сделать это, правильный уход должны быть приняты, когда иссечение и сохранение тканей для достижения оптимального окрашивания. Один из способов сохранения тканей включает фиксации тканей в формальдегид, а затем встраивания их парафином. Этот метод сохраняет морфологию также и позволяет длительное хранение при комнатной температуре, но громоздка и требует обработки токсичными химикатами. Кроме того, результаты формальдегида фиксации в антигена сшивки, что требует протоколы антиген извлечения для эффективного иммунного окрашивания. Напротив, замороженные секционирование не требует фиксации и, таким образом, сохраняет биологическую конформацию антигена. Этот метод также обеспечивает явное преимущество в быстрой свою очередь вокруг времени, что делает его особенно полезным в ситуациях, требующих быстрого гистологическая оценка как intraoperaного хирургических биопсий. Здесь мы опишем наиболее эффективный способ получения мышечной биопсии для визуализации с различными гистологическими и иммунологическими пятен.
Введение
Экспертиза мышечной гистологии играет важную роль в понимании различных типов нервно-мышечных расстройств 1-4. В сочетании с другими методами, что позволяет исследователям получить лучшее представление о проявлении и прогрессирования патологии, а также может иметь важное значение для оценки эффективности терапевтического вмешательства 5-10. Однако, чтобы быть точным, ткани должны быть сохранены в надлежащем порядке, с тем чтобы сохранить физиологическое состояние непосредственно перед удалением. Это требует большой осторожности во время удаления, сохранения, секционирования и окрашивания.
Ткани могут быть получены двумя различными способами для легкой микроскопическом исследовании. Первый способ, фиксированных формалином парафин (FFPE) секции, требуется ткани, чтобы быть фиксировали в 10% буферном растворе формальдегида природного прежде чем с встроенной парафина 11,12. Шаг фиксация помогает сохранить морфологию лучше, но также перекрестные ссылки эндогенного прoteins что требует сложная антиген извлечения процедуры иммунным и исключая возможность окрашивания ферментативной на таких участках 12. Замороженные срезы, с другой стороны, не должны быть предварительно обработаны или фиксированной; Поэтому, белки способны удерживать родные биологические конформации 13,14. Кроме того, замороженные срезы также позволяют быстро времени оборота, что в некоторых случаях необходимо, например, в интраоперационной диагностике сарком и других хирургических биопсий 15. Тем не менее, если не сделано должным образом, этот метод склонен к заморозить ущерб, который вносит изменения в мышечной архитектуре, делая секции непригодным для гистологического исследования. Эта статья будет выделить наиболее эффективный способ получения мышечной биопсии для того, чтобы достичь оптимального окрашивания для тщательного осмотра.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Ткань Урожай и замораживание мышечных тканей
- Эвтаназии мышь с передозировкой изофлуран (2-хлор-2- (дифторметокси) -1,1,1-трифтор-этан). Выполните этот шаг в вытяжном шкафу и использовать дополнительный метод сдерживания, такие как эксикаторе или колпаком, содержащей ватным тампоном, смоченным в ИФ.
- Подтвердите смерть, крепко сжимая в подушечку лапы. Используйте дополнительный метод эвтаназии, таких как рак шейки матки дислокации.
- Намочите шерсть с 70% -ным спиртом, чтобы уменьшить прилипание сыпучих пряди волос на мышцы. Очистите кожу с помощью лимба тонких щипцов, таких как # 5.
- Осторожно отделите мышцу интерес (передней большеберцовой (TA) в данном случае) из костей внизу, начиная с сухожилия и удалить.
- Акцизный мышцы, закройте его в ОСТ (Оптимальная температура для резки соединение), и положите его плашмя на меченым одноразовой формы замерзания. Убедитесь, что мышцы на его нормальное физиологическое положение (головой к тайл), не растягивая. Кроме того, заморозить мышцы на маленьких площадях пенополистирола и закрепить его с помощью насекомых булавками, чтобы обеспечить правильную длину мышц.
- Холод 2-метилбутан (изопентана) в стальной стакан с использованием жидкого азота. Это займет в среднем 3 - 5 мин. Продолжайте перемешивание с перерывами до белого осадка не начнут образовываться на дне и стенках стакана.
Примечание: Когда это происходит, изопентан достигла оптимальной температуры замерзания (-150 ° С) - Опустите форм, содержащих мышцы в охлажденной 2-метилбутана. Замораживание мелкие мышцы, такие как диафрагма и разгибатель большого пальца (EDL) для 6 - 12 сек и более крупных мышц, как икроножной камбаловидной (GS) и трицепс для 15 - 20 сек. Не замораживать мышцы слишком долго, так как это может привести к растрескиванию.
- Передача замороженных тканей на сухом льду и пусть изопентан испаряются (обратите внимание, что этот процесс занимает в среднем около 15 - 20 мин). Оберните тканей в алюминиевую фольгу и хранить их в ULTRA низкая температура (-70 ° С до -80 ° С) до секционирования.
2. Внедрение тканей в октябре подготовить тканей блок
- Транспорт ткани на сухом льду, чтобы предотвратить cyrostat оттаивания. Передача ткани в криостате камеры (набор от -20 до -24 ° С, чтобы избежать полного оттаивания тканей), и пусть они уравновешивают в течение 30 мин.
- Поверните отсек Пельтье охлаждения на. Если криостат не имеет этой охлаждение, используйте спрей охлаждения аэрозоля быстро заморозить октября Не позволяйте мышц оттепель в любой момент в течение вложения, так как это может привести к повреждению замораживания.
- Добавить равномерное тонкий слой ОКТ на диске образца и дайте ему остыть. Когда большинство из центра развертывания заморожен на дно, а еще жидкость сверху, вставьте ткань на правильной ориентации (перпендикулярно по октябрь для поперечных сечений и параллельно по октябрь для продольных секций). Используйте спрей охлаждения аэрозоля быстро заморозить Office. Нажмите unembeded часть ткани с тепловым добractor и ждать в течение 45 сек.
- Добавить еще один тонкий слой ОКТ вокруг мышц, спрей с распылителем охлаждения аэрозоля и извлекать тепло, как в предыдущем шаге.
- Продолжайте добавлять октября небольшими порциями и быстро заморозить центра развертывания с использованием комбинации аэрозоля охлаждения спрей и тепла экстрактор, пока вся мышца покрыта.
- Положить тепла экстрактор на верхней части блока тканей и ждать в течение 5 мин.
3. Подготовка секций и Выявление Разделы с середины живота области мышц
- Установите образец на образец голове. Затянуть ручку, чтобы закрепить диск. Убедитесь, что образец диск находится в хорошем контакте с образцом руководителя.
- Отрегулируйте температуру в камере до -21 и между -24 ° C и подождите, пока заданная температура не будет достигнута.
- Настройте параметры толщины (7 мкм); отделка блок по продвижению или втягивания блока с помощью грубой и тонкой настройки.
- Соберите разделына предварительно нагревают положительно заряженные предметные стекла, нажав на верхнюю часть слайда на участках, используя притяжение между противоположными зарядами, чтобы облегчить адгезию отрезанных секций с ползуном.
- Определение секции середине живота путем измерения площади поперечного сечения (CSA) секций. Делайте это, используя программное обеспечение обработки изображений на компьютере, подключенном к микроскопу.
ПРИМЕЧАНИЕ: фазового контраста изображения взяты и окружность всей мышцы измеряется с помощью функции отслеживания на программе. Это даст как CSA, а также минимальный диаметр хорька (меру волокна размером поперечного сечения, что выражается в виде наименьшего расстояния между двумя параллельными касательными на противоположных сторонах частицы) измерений. Примечание: При CSA и минимальный диаметр хорек измерения начинают плато, в середине живота была достигнута. - Инвентаризация и архив слайды при температуре -80 ° C для дальнейшего окрашивания.
Примечание: Окт не должны быть удалены до staininг процедуры. После того, как слайды coverslipped, они готовы быть окрашены немедленно.
4. Окрашивание
ПРИМЕЧАНИЕ: В то время как подробные шаг за шагом процедуры могут быть найдены на спецификации и должны следовать за процедурами окрашивания, личный оптимизация может потребоваться для получения оптимального окрашивания.
- Из-за монтажа информации (смотри таблицу) не смешивается с водой, обезвоживают слайды посредством увеличения сортов спирта (2 мин каждый в 70%, 95% и 100% этанола) и очистить их с ксилолом (100% в течение 5 мин), чтобы обеспечить слайды не становятся непрозрачными в течение долгого времени.
- Покровное разделы и дайте им высохнуть. Изображение с микроскопа оснащены ПО для обработки изображений.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Установка для сбора и замораживания тканей можно увидеть на рисунке 1. Вырезанные ткани должны храниться на марлю, пропитанную PBS, чтобы избежать высыхания (рис 1А). Когда ткани выбирают так, чтобы быть использованы для гистологического анализа они должны быть погружены в ОСТ и раскладывают на крио плесени в правильной ориентации, и как можно ближе к физиологическому длины, насколько это возможно, чтобы обеспечить точную морфологию (Фигура 1В). Шлам изопентана, подходя...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Гистологии и иммуногистохимии были использованы в качестве основных инструментов в понимании проявление и прогрессирование патологии в различных нервно-мышечных нарушений. Классически, мышечные биопсии были впервые зафиксированы в формальдегид, а затем с встроенной парафина. В то время как формальдегид фиксация сохраняет архитектуру ткани и позволяет хранить тканей и транспорта при комнатной температуре, он также инактивирует ферменты и белки, требующими сшивок дальнейшие шаги для достижения точной иммуноокрашивания. Эт...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторам нечего раскрывать.
Благодарности
Мы хотели бы поблагодарить Алекса Миллера за редактирование рукописи. Эта работа была поддержана исследовательскими грантами, предоставленными M.G. от Cure CMD, Struggle Against Muscle Dystrophy (SAM) и Muscular Dystrophy Association (218938).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Криостат | Leica CM 1850 | Leica Microsystems Inc. | Buffalo Grove, IL 60089 США, рабочий телефон 1-800-248-0123 Альтернатива: Richard Allen Scientific |
| Микроскоп | Nikon Eclipse 50i | Nikon Instruments Inc. | 1300 Walt Whitman Road, Мелвилл, Нью-Йорк 11747-3064 США, Тел.: 1-631-547-8500 Альтернатива: Olympus |
| Программное обеспечение для анализа изображений | Nikon Программное обеспечение для обработки изображений, Basic Research | , Nikon Instruments Inc. | 1300 Walt Whitman Road, Мелвилл, Нью-Йорк 11747-3064, США, Тел.: 1-631-547-8500 Альтернативы: Image J, Metamorph |
| Изофлуран | 14043-220-05 | JD Medical Dist. Co., Inc. | 1923 West Peoria Avenue, Феникс, AZ 85029 США |
| ОКТЯБРЬ | 4583 | Сакура Инк. | Торренс, Калифорния 90501 США Альтернативный источник: Leica Microsystem |
| Freeze It | 23-022524 | Thermofisher | 790 Memorial Dr, Кембридж, Массачусетс, 02139 США Альтернативный источник: VWR Scientific |
| Одноразовая тканевая форма | 22-363-554 | Thermofisher | 790 Memorial Dr, Кембридж, Массачусетс 02139 США Альтернативный источник: VWR Scientific |
| Colorfrost плюс слайды | 9991001 | Thermofisher | 790 Memorial Dr, Кембридж, MA 02139 США Альтернативный источник: VWR Scientific |
| Acetone | 650501-4L | Sigma-Aldrich | 3050 Spruce Street, St. Louis, MO 63103 США Альтернативный источник: VWR Scientific |
| Этиловый спирт | HC-1300-1GL | Thermofisher | 790 Memorial Dr, Кембридж, MA 02139 США Альтернативный источник: VWR Scientific |
| 2-метилбутан | M 32631-SL | Sigma-Aldrich | 3050 Spruce Street, Сент-Луис, MO 63103 США Альтернативный источник: VWR Scientific |
| Xylene | HC-7001GA | Thermofisher | 790 Memorial Dr, Кембридж, MA 02139 США Альтернативный источник: VWR Scientific |
| Cytoseal 280 | 8311-4 | Thermofisher | 790 Memorial Dr, Кембридж, MA 02139 США Альтернативный источник: VWR Scientific |
| Hematoxylin Gill #3 | CS402-1D | Thermofisher | 790 Memorial Dr, Кембридж, Массачусетс 02139 США Альтернативный источник: VWR Scientific |
| Eosin | 6766007 | Thermofisher | 790 Memorial Dr, Кембридж, Массачусетс 02139 США Альтернативный источник: VWR Scientific |
Ссылки
- Bonnemann, C. G., et al. Diagnostic approach to the congenital muscular dystrophies. Neuromuscular disorders : NMD. 24, 289-311 (2014).
- Caughey, J. E., Pachomov, N. The diaphragm in dystrophia myotonica. J Neurol Neurosurg Psychiatry. 22, 311-313 (1959).
- Fetterman, G. H., Wratney, M. J., Donaldson, J. S., Danowski, T. S. Muscular dystrophy. I. History, clinical status, muscle strength, and biopsy findings. AMA J Dis Child. 91, 326-338 (1956).
- Platzer, A. C., Chase, W. H. Histologic Alterations in Preclinical Mouse Muscular Dystrophy. The American journal of pathology. 44, 931-946 (1964).
- Mercuri, E., et al. Muscle magnetic resonance imaging involvement in muscular dystrophies with rigidity of the spine. Ann Neurol. 67, 201-208 (2010).
- Tasca, G., et al. Different molecular signatures in magnetic resonance imaging-staged facioscapulohumeral muscular dystrophy muscles. PloS one. 7, e38779(2012).
- Girgenrath, M., Dominov, J. A., Kostek, C. A., Miller, J. B. Inhibition of apoptosis improves outcome in a model of congenital muscular dystrophy. The Journal of clinical investigation. 114, 1635-1639 (2004).
- Kumar, A., Yamauchi, J., Girgenrath, T., Girgenrath, M. Muscle-specific expression of insulin-like growth factor 1 improves outcome in Lama2Dy-w mice, a model for congenital muscular dystrophy type 1A. Human molecular genetics. 20, 2333-2343 (2011).
- Mehuron, T., et al. Dysregulation of matricellular proteins is an early signature of pathology in laminin-deficient muscular dystrophy. Skeletal muscle. 4, 14(2014).
- Yamauchi, J., Kumar, A., Duarte, L., Mehuron, T., Girgenrath, M. Triggering regeneration and tackling apoptosis: a combinatorial approach to treating congenital muscular dystrophy type 1 A. Human molecular genetics. 22, 4306-4317 (2013).
- Sheriffs, I. N., Rampling, D., Smith, V. V. Paraffin wax embedded muscle is suitable for the diagnosis of muscular dystrophy. Journal of clinical pathology. 54, 517-520 (2001).
- Fox, C. H., Johnson, F. B., Whiting, J., Roller, P. P. Formaldehyde fixation. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 33, 845-853 (1985).
- Maccarty, W. C. The Diagnostic Reliability of Frozen Sections. The American journal of pathology. 5, 377-380 (1929).
- Shi, S. R., et al. Evaluation of the value of frozen tissue section used as 'gold standard' for immunohistochemistry. Am J Clin Pathol. 129, 358-366 (2008).
- Turan, T., et al. Accuracy of frozen sections for intraoperative diagnosis of complex atypical endometrial hyperplasia. Asian Pacific journal of cancer prevention : APJCP. 13, 1953-1956 (2012).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
Теги
