В этой статье подробно описан протокол создания ножевого ранения переднего мозга у взрослых мышей. Колотая травма вызывает тяжелый реактивный глиоз и образование глиального рубца, которые впоследствии могут быть исследованы стандартными иммуногистохимическими методами.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
После повреждения ЦНС, астроциты претерпевают широкий спектр биохимических, морфологических и молекулярных изменений, которые в совокупности называются реактивным астроглиозом. Реактивные астроциты оказывают как воспалительное, так и защитное действие, препятствуя и способствуя, соответственно, восстановлению нейронов. Механизмы, лежащие в основе различных функциональных свойств реактивного астроглиоза, не совсем понятны. Достижение более глубокого понимания этих механизмов имеет решающее значение для разработки терапевтических стратегий лечения поврежденной ЦНС. Здесь мы демонстрируем метод запуска реактивного астроглиоза в переднем мозге взрослой мыши с использованием поражения ножом переднего мозга. Эта модель поражения проста, надежна и требует только стереотаксического устройства и лезвия скальпеля для нанесения травмы. Использование колотовидных поражений в качестве модели травмы в переднем мозге хорошо известно и поддается исследованиям, направленным на широкий спектр невропатологических исходов, таких как дегенерация нейронов, нейровоспаление и нарушения гематоэнцефалического барьера (ГЭБ). Таким образом, модель ножевой травмы переднего мозга служит мощным инструментом, который может быть применен для широкого спектра исследований реакции ЦНС на травму.
Введение
Основной проблемой для разработки успешных методов лечения поврежденной ЦНС является неполное понимание сложных многоклеточных событий, которые вызываются травмой. Реактивные астроциты получают все большее признание в качестве перспективной мишени для новых методов лечения1. Несмотря на то, что исторически реактивные астроциты считались враждебными для восстановления нейронов, в настоящее время они признаны важнейшими компонентами сложного многоклеточного нейропротекторного ответа, который включает в себя ослабление воспалительных процессов и ограничение вторичного повреждения и нейродегенерации2-6. Несмотря на то, что нейропатологические характеристики реактивного глиоза уже давно хорошо определены, клеточные и молекулярные механизмы, регулирующие реактивный глиоз, а также разнообразный спектр последующих последствий остаются плохо изученными. Понимание механизмов, которые управляют реактивным глиозом, а также последующими клеточными и молекулярными событиями, является важным шагом на пути к разработке стратегий, направленных на повышение нейропротекторных свойств реактивного глиоза при одновременном ослаблении вредных эффектов.
Здесь мы демонстрируем метод индуцирования тяжелого реактивного астроглиоза в переднем мозге взрослых мышей с помощью ножевого ранения. В отличие от других моделей черепно-мозговой травмы (ЧМТ), таких как контролируемый кортикальный удар (CCI) или жидкостная перкуссионная травма (FPI), которые требуют специализированного оборудования для получения травмы, для удара в передний мозг требуется только стереотаксическое устройство для стабилизации головы и лезвие скальпеля No 11. Таким образом, модель ножевого поражения переднего мозга более широко доступна для широкого круга лабораторий, которые не имеют доступа к специализированным устройствам, необходимым для создания травмы FPI или CCI. Описанный здесь метод позволяет исследователям надежно и воспроизводимо запускать устойчивый ответ на глиоз для исследования последующих клеточных и молекулярных событий. После восстановления после операции животные, получившие ножевую травму переднего мозга, могут выживать в течение длительного периода времени без необходимости специализированного ухода и могут быть возвращены в колонию для острых, промежуточных или хронических исследований. Несмотря на то, что поражение переднего мозга, вызванное ножевым ранением, является менее клинически переводимым, чем модели FPI или CCI ЧМТ, оно служит простой, но полезной экспериментальной моделью для изучения основных биологических механизмов, лежащих в основе реактивного глиоза и других невропатологических событий после травмы ЦНС.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Взрослый (3-4 месяцев) мышей-самцов на смешанной C57BL / 6 фоне были использованы в этом протоколе. Животных содержали на 12 ч циклом свет / темнота, и давали свободный доступ к пище и воде. Все процедуры, выполняемые в этом протоколе были проведены в соответствии с процедурами, утвержденными университета Институциональная комитета Drexel Уход за животными и использование.
1. Подготовка Хирургическая Площадь
- Лечить операционный стол с 70% этанола, а затем покрыть весь хирургический скамейки с впитывающие и организовать хирургических инструментов рядом с стереотаксической.
- Настройка стереотаксической оборудования без манипулятора. Упорядочить грелку на стереотаксической и установить до 37 ° C. Избегайте перегрева животного путем размещения небольшой кусочек бумажного полотенца или хирургического площадку между животным и грелку.
- Использование автоклавного ножницами, вырезать небольшие кусочки автоклавного Gelfoam в стерильную чашку Петри, содержащую 0,9% стерильного солевого раствора до REAду для использования.
Примечание: Поддержание стерильной рабочей среды с помощью автоклавного инструментов и стерильных хирургических материалов. Re-стерилизации хирургических инструментов во время процедуры или между животных путем погружения в шаровой стерилизатора в течение 10-15 сек, по мере необходимости. Поддержание чистые перчатки на протяжении всей процедуры, протирая руки с 70% этанола, в случае необходимости, для дезинфекции.
2. Prepping мышь для хирургии
- Удалить мыши из дома клетку и весят (г).
- Место мыши в ИФ индукции камеры и установленного кислорода до 2 л / мин и ИФ испаритель 5, чтобы побудить хирургической анестезии плоскости, около 3-5 мин. Монитор для замедления дыхания и иммобилизации. Убедитесь, что мышь полностью в отключке, используя палец щепотку рефлекс.
- Когда мышь полностью в отключке, место в стереотаксической рамы, закрепите нос в нос конуса, который прилагается с трубки к ИФ. Вставьте уха баров в ушной канал и затяните, чтобы глава является стабильной.
- Бритье головы от уха до уха, и от между глазами за ушами.
- Стерилизацию кожи с чередующимися салфетки изопропилового спирта и раствор Бетадин йода, 3 раза в каждом.
- Применить искусственные слезы обоих глаз, чтобы предотвратить их от высыхания во время хирургической процедуры.
3. Хирургические процедуры
- Монитор глубины наркоза, зажимая палец или хвост. Мышь в соответствующем хирургического плоскости, когда нет ответа, и дыхание медленно и ровно.
- Сделайте парасагиттальных разрез кожи от только позади глаз почти между ушами в одном, уверенным движением с использованием № 11 лезвие скальпеля. Перемещение кожу в сторону и закрепить правую сторону с кровоостанавливающего.
- Ясно череп вышележащих мембраны с помощью тупой стороны № 11 скальпеля и хлопка наконечником аппликаторы. При желании, протрите череп с ватной палочки, смоченной в 0,9% растворе. Дайте высохнуть полностью.
- НамING небольшой линейку, отметьте переднюю границу трепанации черепа на 1 мм каудально венечного шва, и к левому краю трепанации черепа в 1 мм латеральнее сагиттального шва (рисунок 1), с постоянным маркером. Затем отметьте право и хвостовой границы трепанации черепа в 4 мм от сагиттальной и корональной швов, соответственно (рисунок 1).
- Использование 0,5 мм сверло, начинают делать трепанацию черепа путем бурения медленно после постоянного маркера контуром. Будьте уверены, чтобы не пробить череп полностью. Слегка нажмите на изолированную часть теменной кости с № 5 щипцы, слабые места уступит давлению. Когда поредели кости достаточно слабой в течение периметру, кости картина готова для удаления.
Примечание: Если исследователь трудности опыты удаления костей в одной части, это говорит о том, что кости не достаточно разбавить в процессе бурения. Рассмотрим бурения череп далее в последующих животных в facilitaте просто удаление костного кусок. - Использование 10 мл шприц, снабженный иглой 23 G, применяют небольшое количество 0,9% физиологического раствора, чтобы впитать изолированный кости и просверленное область.
- Прикрепите манипулятором для стереотаксической техники. Прикрепите новый № 11 лезвие скальпеля к держателю зонда с острой стороной лезвия, обращенной рострально.
ПРИМЕЧАНИЕ: Несмотря на то, Ростральные и хвостовой ткани испытывают острые и тупые края лезвия, соответственно, механические повреждения, вызванное проникающим травмы сравнима по всей протяженности поражения. Мы не наблюдаем ни одного заметного различия в основных характеристик реактивного глиозом включая повышение экспрессии GFAP или пролиферации, между ростральных и хвостовой секций. - Ведение манипулятором из пути, осторожно поднимите изолированный кости, используя 5/45 угловые щипцы. Вставьте кончик пинцетом в сторону изолированного кости и лифтом, используя рычаги, чтобы снять кусок кости, оставленные в одном фулл движение.
ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте осторожны, чтобы не ударить мозг или нарушить твердую мозговую оболочку под черепом. - Возьмите небольшой кусочек пропитанной рассасывающиеся гель пены и поставить на непокрытой мозга, чтобы предотвратить его от высыхания и впитать кровь, которая может присутствовать.
- После гель пена находится в месте, качели манипулятором на место и отрегулировать лезвие центре трепанации черепа над гель пены. Удалить гель пены и опустите лезвие, пока наконечник не коснется твердую мозговую оболочку, не прокалывая твердую мозговую оболочку. Отметить спинной / брюшные координаты с помощью нониуса на вертикальной руку стереотаксической.
- Использование манипулятора, медленно опустите лезвие точно 3 мм в мозг. Это достигается с помощью отметок шкалы штангенциркуля на манипулятора. Разрешить лезвие, чтобы остаться на месте в течение 5-10 сек. Перемещение стереотаксической руку с приложением лезвия ростральнее к хвосту три раза позволяющие лезвие, чтобы достичь ростральные и хвостовой границы трепанации черепа, прежде чем перейти к opposiте конец.
Примечание: Твердая не удаляется перед вставкой лезвие. В отличие от твердой мозговой оболочки крысы, которая ~ 80 мкм в толщину 7, твердая мозговая оболочка мыши значительно тоньше (толщиной всего несколько слоев клеток) и не вызывает заметное сопротивление скальпелем во время вставки. Использование нового скальпель лезвия для каждой мыши чтобы гарантировать, что каждое животное получает последовательное повреждение. - Медленно поднять руку стереотаксической, удаляя лезвие от мозга. После удаления лезвия, немедленно поместите другую часть Gelfoam на поверхности мозга, чтобы впитать лишнюю кровь или жидкость.
- Между тем, удалить стереотаксической руку и распоряжаться № 11 лезвие скальпеля. После того, как кровотечение остановилось, удалить Gelfoam.
- Закройте рану от ушивание кожи нерассасывающегося шва, таких как ethilon или проленовой. Швы должны быть удалены 9-10 дней после операции.
- Вернуться мышь, чтобы его клетку, и позволяют мыши медленно восстанавливаться на heatinг площадку и монитор для каких-либо признаков дистресса. Восстановление от изофлуораном-индуцированной анестезией, как правило, происходит в течение 2-5 мин после удаления из изофлуораном. Не оставляйте животное без присмотра, пока он не пришел в грудины recumbancy.
- Администрирование 0,5-1 мл подкожно лактат раствор Рингера для обеспечения гидратации.
4. Послеоперационный уход
- Внимательно следить не животных после операции до выздоровления от наркоза, прежде чем вернуться в колонию.
- Чтобы уменьшить боль и дискомфорт после операции, управлять 0,05-0,1 мг / кг бупренорфин инъекции провайдера сразу после процедуры.
- Соблюдайте животных в течение 2-3 дней после операции для тяжелых признаков бедствия, такие как ограниченных движений, отсутствие ухода, или потери веса. Эвтаназии животных, демонстрирующих либо из этих признаков дистресса и удалить из исследования.
- Чтобы изучить гистопатологию поврежденных тканей, эвтаназии животных СтэнDard внутрисердечной перфузии.
- Вкратце, анестезию животных с передозировкой кетамина / ксилазина, то внутрисердечно перфузии 15-20 мл 0,9% NaCl или до тех пор, пока печень очищается от крови, а затем 60 мл 4% параформальдегида в конце эксперимента.
- Проанализируйте мозги и пост-фикс для 2-4 часа в 4% параформальдегида до передачи 30% раствора сахарозы. Раздел мозги на криостата на 40-60 мкм, и процесс по стандартным гистологических или иммуногистохимических процедур, или, как описано в Гарсия 8,9.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Потому что животные переносят эту операцию, не требуют специальных послеоперационный уход, короткие или долгосрочные периоды времени выживания легко включены в исследование, в зависимости от необходимости исследовать острую или хроническую патологию после повреждения. Основные особенности реактивного глиозом, такие как позитивной регуляции GFAP и гипертрофии сомы, может наблюдаться в начале 2-3 дней после травмы. Пик фазы пролиферации реактивных астроцитов в дни 3-5 после травмы 10. Представительные результат...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Очень важно, что череп или основной твердая, не повреждены во время бурения. Используйте небольшое давление во время бурения для обеспечения череп не проколоты. Кроме того, следует позаботиться при подъеме черепа кусок, чтобы обеспечить твердую мозговую оболочку не стартовал с костью.
Травмы переднего мозга удар описано здесь моделям проникающей травмы ЦНС. Хотя менее клинически переводимые чем ЧМТ моделей, таких как FPI или ТПП, поражение переднего мозга модель удар служит полезным инструме...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторам нечего раскрывать.
Благодарности
Мы благодарим Кэтрин Кларк за техническую помощь. A.D.R.G. частично финансируется 5K01MH097957-03
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Stereotax | Harvard Apparatus | 726049 | |
| Высокоскоростная микродрель | Harvard Apparatus | 724950 | |
| лезвие скальпеля из нержавеющей стали, # 11 | MedVet | JOR581S | |
| 5/45 угловые щипцы | Fine Science Tools | 11251-35 | |
| Губка из гельпенопласта 12 см x 7 мм | Fisher | NC9841478 | |
| Rb anti-GFAP | ДАКО | Z033429-2 | Разведение - 1:20 000 (светлое поле); 1:1 000 (флуоресценция) |
| Shp anti-BrdU | Abcam | ab1893 | Разведение - 1:20 000 (светлое поле); 1:500 (флуоресценция) |
| Биотинилированная коза против кролика | Vector Laboratories | BA-1000 | Разведение - 1:400 (светлое поле) |
| Биотинилированный кролик против овец | Vector Laboratories | BA-6000 | Разведение - 1:400 (светлое поле) |
| Alexafluor 488 козий анти-кролик | Life Technologies | A-11008 | Разведение - 1:400 (светлопольное) |
| Alexafluor 568 осел против овец | Life Technologies | A-21099 | Разведение - 1:1,000 (флуоресценция) |
| DAPI Окрашивание нуклеиновых кислот | Life Technologies | D3571 | Разбавление - 1:1,000 (флуоресценция) |
| Cresyl Violet Acetate | Sigma Aldrich | C5042-10G | Разбавление - 1% (светлопольное) |
Ссылки
- Hamby, M. E., Sofroniew, M. V. Reactive astrocytes as therapeutic targets for CNS disorders. Neurotherapeutics. 7 (4), 494-506 (2010).
- Bush, T. G., et al. Leukocyte infiltration, neuronal degeneration, and neurite outgrowth after ablation of scar-forming, reactive astrocytes in adult transgenic mice. Neuron. 23 (2), 297-308 (1999).
- Faulkner, J. R., et al. Reactive astrocytes protect tissue and preserve function after spinal cord injury. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 24 (9), 2143-2155 (2004).
- Okada, S., et al. Conditional ablation of Stat3 or Socs3 discloses a dual role for reactive astrocytes after spinal cord injury. Nature Medicine. 12 (7), 829-834 (2006).
- Voskuhl, R. R., et al. Reactive Astrocytes Form Scar-Like Perivascular Barriers to Leukocytes during Adaptive Immune Inflammation of the CNS. Journal of Neuroscience. 29 (37), 11511-11522 (2009).
- Burda, J. E., Sofroniew, M. V. Reactive Gliosis and the Multicellular Response to CNS Damage and Disease. Neuron. 81 (2), 229-248 (2014).
- Maikos, J. T., Elias, R. A., Shreiber, D. I. Mechanical properties of dura mater from the rat brain and spinal cord. Journal of neurotrauma. 25 (1), 38-51 (2008).
- Garcia, A. D., Doan, N. B., Imura, T., Bush, T. G., Sofroniew, M. V. GFAP-expressing progenitors are the principal source of constitutive neurogenesis in adult mouse forebrain. Nat Neurosci. 7 (11), 1233-1241 (2004).
- Garcia, A. D., Petrova, R., Eng, L., Joyner, A. L. Sonic hedgehog regulates discrete populations of astrocytes in the adult mouse forebrain. J Neurosci. 30 (41), 13597-13608 (2010).
- Amat, J. A., Ishiguro, H., Nakamura, K., Norton, W. T. Phenotypic diversity and kinetics of proliferating microglia and astrocytes following cortical stab wounds. Glia. 16 (4), 368-382 (1996).
- Hozumi, I., et al. Administration of prosaposin ameliorates spatial learning disturbance and reduces cavity formation following stab wounds in rat brain. Neuroscience letters. 267 (1), 73-76 (1999).
- Ness, R., David, S. Leptomeningeal cells modulate the neurite growth promoting properties of astrocytes in vitro. Glia. 19 (1), 47-57 (1997).
- Byrnes, K. R., Fricke, S. T., Faden, A. I. Neuropathological differences between rats and mice after spinal cord injury. Journal of magnetic resonance imaging : JMRI. 32 (4), 836-846 (2010).
- Steward, O., et al. Genetic approaches to neurotrauma research: opportunities and potential pitfalls of murine models. Experimental neurology. 157 (1), 19-42 (1999).
- Davalos, D., et al. ATP mediates rapid microglial response to local brain injury in vivo. Nature neuroscience. 8 (6), 752-758 (2005).
- Hanisch, U. -K., Kettenmann, H. Microglia: active sensor and versatile effector cells in the normal and pathologic brain. Nature neuroscience. 10 (11), 1387-1394 (2007).
- Neumann, H., Kotter, M. R., Franklin, R. J. M. Debris clearance by microglia: an essential link between degeneration and regeneration. Brain. 132 (2), 288-295 (2008).
- Nimmerjahn, A. Resting Microglial Cells Are Highly Dynamic Surveillants of Brain Parenchyma in Vivo. Science. 308 (5726), 1314-1318 (2005).
- Horn, K. P., Busch, S. A., Hawthorne, A. L., van Rooijen, N., Silver, J. Another Barrier to Regeneration in the CNS: Activated Macrophages Induce Extensive Retraction of Dystrophic Axons through Direct Physical Interactions. Journal of Neuroscience. 28 (38), 9330-9341 (2008).
- Ip, C. W. Immune Cells Contribute to Myelin Degeneration and Axonopathic Changes in Mice Overexpressing Proteolipid Protein in Oligodendrocytes. Journal of Neuroscience. 26 (31), 8206-8216 (2006).
- Perry, V. H. Contribution of systemic inflammation to chronic neurodegeneration. Acta neuropathologica. 120 (3), 277-286 (2010).
- McKeon, R. J., Jurynec, M. J., Buck, C. R. The chondroitin sulfate proteoglycans neurocan and phosphacan are expressed by reactive astrocytes in the chronic CNS glial scar. Journal of Neuroscience. 19 (24), 10778-10788 (1999).
- Silver, J., Miller, J. H. Regeneration beyond the glial scar. Nature reviews. Neuroscience. 5 (2), 146-156 (2004).
- Zamanian, J. L., et al. Genomic analysis of reactive astrogliosis. J Neurosci. 32 (18), 6391-6410 (2012).
- Buffo, A., et al. Origin and progeny of reactive gliosis: A source of multipotent cells in the injured brain. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (9), 3581-3586 (2008).
- Sirko, S., et al. Reactive glia in the injured brain acquire stem cell properties in response to sonic hedgehog. [corrected]. Cell stem cell. 12 (4), 426-439 (2013).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
